楊洋，張亞紅*，李鵬，胡澤軍，張曉麗

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021）

近些年來，隨著我國葡萄產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，其產(chǎn)業(yè)規(guī)模已超過西歐傳統(tǒng)葡萄主產(chǎn)國而名列前茅，是我國栽培區(qū)域最廣的落葉果樹[1]。中國是葡萄的起源中心之一，葡萄栽培與葡萄酒釀造已有千年歷史。如今，我國葡萄與葡萄酒產(chǎn)業(yè)伴隨著“一帶一路”戰(zhàn)略正迅速崛起[2]，逐步形成東北、京津冀、山東、新疆、賀蘭山東麓等優(yōu)質(zhì)釀酒葡萄原料產(chǎn)區(qū)。葡萄漿果的風(fēng)味物質(zhì)與產(chǎn)地密切相關(guān)，在品種、樹齡、栽培管理方式一致條件下，釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)的氣候、地形、土壤等風(fēng)土條件是影響果實(shí)風(fēng)味物質(zhì)及葡萄酒風(fēng)格與典型性的重要因素[3]，其中氣候影響最大。眾所周知，新疆產(chǎn)地葡萄成熟期晝夜溫差大，果實(shí)含糖量高，但白天高溫使酸發(fā)育不良，香氣和著色都受到不利影響。而山東產(chǎn)地晝夜溫差小，糖度低，亦對葡萄酒風(fēng)格不利。寧夏釀酒葡萄產(chǎn)地的晝夜溫差介于新疆和山東產(chǎn)地之間，因此研究三個(gè)產(chǎn)地間釀酒葡萄漿果風(fēng)味物質(zhì)的差異性，可以從另一方面解釋溫度對釀酒葡萄品質(zhì)的影響。

研究發(fā)現(xiàn)，葡萄果實(shí)中花色苷組成和比例受品種和產(chǎn)地的影響，且產(chǎn)地環(huán)境因素的影響大于品系自身特性的影響[4]。崔日寶等[5]對河西走廊不同產(chǎn)地‘赤霞珠’的研究也得到了相似的結(jié)論。這是因?yàn)楫a(chǎn)地環(huán)境因素會影響花色苷的合成與積累，從而使葡萄果實(shí)的花色苷組成具有地域差異。研究發(fā)現(xiàn)，山地葡萄果實(shí)含糖量、含酸量和單寧含量均高于平地，且海拔越高，差異越大[6]，這可能與溫度及土壤水分有關(guān)。溫度對釀酒葡萄果實(shí)含糖量的升高及含酸量的降低均有促進(jìn)作用[7]，白天氣溫高導(dǎo)致酸含量降低，糖酸比例不協(xié)調(diào)，會使所釀出來的葡萄酒品質(zhì)下降[8]。光照對葡萄果實(shí)中單寧含量影響最大，其次是總花色苷含量[9]。葡萄果實(shí)成熟度對產(chǎn)地降水量較為敏感，降水過多會造成果皮多酚類物質(zhì)含量下降[10]。葡萄果實(shí)的風(fēng)味物質(zhì)主要有甜味、酸味和香味[11]，香氣物質(zhì)主要存在于果皮中，而冷涼環(huán)境有助于香氣物質(zhì)的積累[12]。光照會影響葡萄果實(shí)的代謝產(chǎn)物，若紫外照射減少，降異戊二烯類物質(zhì)含量會降低[13]。

‘赤霞珠’是世界范圍栽培最廣泛的釀酒葡萄品種，也是我國栽培面積最大的品種，因此在我國葡萄酒產(chǎn)品中具有不可替代的位置。新疆、山東和寧夏是我國主要的葡萄酒產(chǎn)區(qū)，氣候、土壤等環(huán)境條件差異顯著，因此生產(chǎn)中應(yīng)根據(jù)風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生規(guī)律采取與之相適應(yīng)的栽培管理模式，從而釀造出具有鮮明地域風(fēng)格的葡萄酒產(chǎn)品，推動我國葡萄酒產(chǎn)業(yè)的建康發(fā)展。因此，本試驗(yàn)通過3個(gè)產(chǎn)地‘赤霞珠’葡萄果實(shí)風(fēng)味物質(zhì)的比較研究，以期為釀酒葡萄選擇最佳的栽培地區(qū)，生產(chǎn)高品質(zhì)葡萄漿果及釀造具有產(chǎn)地風(fēng)格特征的葡萄酒提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及產(chǎn)地概況

2019年9月底至10月初在新疆石河子市北泉鎮(zhèn)、山東蓬萊市劉家溝鎮(zhèn)、寧夏銀川市西夏區(qū)（以下分別簡稱新疆、山東、寧夏），采集大面積種植的7～8年生釀酒葡萄‘赤霞珠’樣品，著重考慮各地栽培管理、生長年限、架式等的一致性。在‘赤霞珠’果實(shí)收獲期，根據(jù)各產(chǎn)地果實(shí)可溶性固形物及果實(shí)種子顏色確定成熟度。取樣時(shí)按照隨機(jī)摘取及具有涵蓋代表性的原則于每個(gè)產(chǎn)地整穗采樣約4 kg。葡萄果實(shí)長途運(yùn)輸中采用干冰冷藏。樣品到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，每產(chǎn)地分別從果穗上、中、下3個(gè)部位隨機(jī)剪取果粒300粒，每產(chǎn)地3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。并于當(dāng)日用果實(shí)鮮樣測定粒質(zhì)量、pH和可滴定酸等相關(guān)理化指標(biāo)，其余樣品液氮冷凍打磨存于﹣80 ℃冰箱，用于測定可溶性糖、單寧、花色苷、揮發(fā)性香氣物質(zhì)等。

新疆產(chǎn)地位于東經(jīng)8 4°5 8′～8 6°2 4′，北緯43°26′～45°20′，平均海拔450 m左右，年平均氣溫7～8 ℃，年降水量為125.0～207.7 mm，無霜期為168～171 d，大于10 ℃的活動積溫為3570～3729 ℃，年日照時(shí)數(shù)為2721～2818 h；土壤多系沙壤土、沙質(zhì)土、灰漠土；日照充沛，氣溫日較差大，屬于典型溫帶大陸性干旱氣候。山東產(chǎn)地位于東經(jīng)119°34′～121°57′，北緯36°16′～38°23′，海拔在100～300 m，年平均降水量600～800 mm，年平均氣溫11.9 ℃，年平均日照時(shí)數(shù)2826 h，無霜期平均210 d以上；土壤以花崗巖風(fēng)化形成的沙壤土為主；雨水適中、氣候溫和，屬溫帶季風(fēng)氣候。寧夏產(chǎn)地位于北緯38°08′～38°53′，東經(jīng)105°49′～106°18′，海拔在1010～1150 m，年平均氣溫8.5 ℃左右，全年平均氣溫較差為13.1 ℃，年平均日照時(shí)數(shù)3000 h左右，年平均降水量200 mm左右，無霜期170 d左右；土壤為灰鈣土、灰褐土及灌淤土；光照充足，晝夜溫差大，屬于中溫帶干旱氣候區(qū)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

氯化鈉、醋酸鈉、碳酸鈉、濃鹽酸、氯化鉀、甲醇、蒽酮，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鄰苯二酚、單寧酸、福林-酚試劑、福林-丹尼斯試劑，無錫耐思生物科技有限公司；C5-C30烷烴標(biāo)準(zhǔn)品均為色譜純，美國Sigma-Aldrich公司；

FA-1004電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；5804R低溫冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；UV 757紫外可見分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司；Agilent 6890N-5975B氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國安捷倫公司；100 μL PDMS固相微萃取針，美國Supelco公司。

1.3 葡萄果實(shí)理化指標(biāo)的測定

采用手持糖量計(jì)測定可溶性固形物；酸堿滴定法測定可滴定酸含量[14]；可溶性糖測定采用蒽酮硫酸比色法[15]；總酚的測定采用福林酚法[16]，單寧的測定采用福林-丹尼斯法[17]；花色苷的測定用pH示差法[18]。參考楊夫臣等[19]的方法測定類黃酮的含量。

揮發(fā)性香氣成分的測定采用頂空固相微萃取方法提取，運(yùn)用氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（G a s Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）分析，參照楊曉帆[20]的方法并稍加修改。前處理：稱取適量液氮打磨樣品置于頂空瓶中，加3 g氯化鈉，密封，于80 ℃下水浴平衡30 min，用固相微萃取針萃取30 min，待萃取結(jié)束后，萃取針在進(jìn)樣口解吸5 min。色譜柱：HP-5MS（30m×0.25mm×0.25μm）；分流比：不分流；載氣流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；掃描方式：全掃描；離子源溫度：230 ℃；四級桿溫度：180 ℃；升溫程序?yàn)槠鹗紲囟龋?5 ℃，保持3 min，以5 ℃/min的速率升至200 ℃，保持6 min，再以30 ℃/min的速率升250℃，保持4 min。采集到的質(zhì)譜圖利用NIST譜庫進(jìn)行檢索，鑒定樣品中的揮發(fā)性成分，并利用峰面積歸一化法分析各成分的相對含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)的整理、匯總和初步分析在WPS 2019中完成，進(jìn)一步釆用Origin 2018軟件進(jìn)行顯著性方差分析、主成分分析（PCA）及偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）。

2 結(jié)果分析

2.1 三個(gè)產(chǎn)地‘赤霞珠’果實(shí)中糖、酸含量

由表1所知，不同產(chǎn)地成熟時(shí)果實(shí)中的糖、酸含量存在差異。三個(gè)產(chǎn)地的果實(shí)粒質(zhì)量在顯著差異，且表現(xiàn)為寧夏＞山東＞新疆；果實(shí)中可溶性糖含量新疆顯著高于寧夏約14.1%，而寧夏與山東沒有顯著差異。三個(gè)產(chǎn)地果實(shí)可滴定酸含量之間均有顯著差異，且呈現(xiàn)寧夏最高，新疆次之，山東最低。糖酸比是漿果成熟度的一項(xiàng)度量標(biāo)準(zhǔn)，即可溶性糖與可滴定酸的比值。三個(gè)產(chǎn)區(qū)的糖酸比之間有顯著差異，新疆成熟度最高，山東次之，寧夏最低。

2.2 三個(gè)產(chǎn)地‘赤霞珠’果實(shí)中酚類物質(zhì)

如表2所示，三個(gè)產(chǎn)地單寧和總酚的含量均存在顯著性差異，且表現(xiàn)為山東最高，寧夏次之，新疆最低。山東的單寧和總酚含量較寧夏分別高出5%和12.6%。新疆的單寧和總酚含量較寧夏分別低了10%和12.4%。三個(gè)產(chǎn)地間果實(shí)花色苷含量均存在顯著差異，且新疆較寧夏高12.9%，山東較寧夏銀川低13.7%。三個(gè)產(chǎn)地果實(shí)中的類黃酮含量沒有差異。

表1 三個(gè)產(chǎn)地‘赤霞珠’葡萄果實(shí)中糖、酸含量Table 1 Contents of sugar and acid of 'Cabernet Sauvignon' berries from different production regions

表2 三個(gè)產(chǎn)地‘赤霞珠’葡萄果實(shí)中酚類物質(zhì)含量Table 2 Content of phenolic substance of 'Cabernet Sauvignon' berries from different production regions/(mg/g)

2.3 三個(gè)產(chǎn)地果實(shí)成熟時(shí)揮發(fā)性香氣物質(zhì)比較

如表3所示，果實(shí)成熟時(shí)，不同產(chǎn)地果實(shí)中均檢測到醛類、酮類、萜烯類、醇類、酯類等揮發(fā)性成分，新疆、山東和寧夏分別有43、43、44種。醛類是果實(shí)揮發(fā)性組分的主要成分，山東的醛類化合物總的相對含量均高于新疆和寧夏，且山東醛類化合物種類數(shù)最多，新疆最少；香氣物質(zhì)中的萜烯類和脂類化合物的相對含量占比較小，但其嗅覺感官閾值很低，對果實(shí)感官特性影響很大。山東的萜烯類化合物的相對含量高于新疆和寧夏，而新疆的脂類化合物的相對含量和種類數(shù)均高于山東和寧夏，而寧夏的醇類化合物相對含量最高。

如表4所示，三個(gè)產(chǎn)地果實(shí)中檢測到的共有揮發(fā)性物質(zhì)為11種，其中4種為醛類物質(zhì)。具有青草香味的反式-2-己烯醛和乙醛的相對含量是主要成分。在共有揮發(fā)性物質(zhì)中，新疆、山東和寧夏果實(shí)中醛類物質(zhì)總的相對含量分別為52.6%、48.5%和48.7%。帶有混合香氣且嗅覺閾值較低（2 ng/L）的β-大馬士酮，在山東果實(shí)中的相對含量均高于新疆和寧夏，分別約是新疆和寧夏的1.7倍和3.4倍。

圖1顯示，成熟時(shí)三個(gè)產(chǎn)地果實(shí)共有揮發(fā)性物質(zhì)PCA和PLS-DA結(jié)果。PCA結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCA1和PCA2的貢獻(xiàn)率分別為63.23%和36.58%，累積貢獻(xiàn)率達(dá)到99.81%，能夠反映果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)的總體狀態(tài)。三個(gè)產(chǎn)地的果實(shí)樣品可以被明顯分開，PCA1將山東和寧夏區(qū)分開，分別位于正半軸與負(fù)半軸；而新疆位于PCA2的正半軸，山東和寧夏位于負(fù)半軸。苯甲醛、1-辛醇和1-3二羥基丙酮對PCA1的影響最強(qiáng)；壬醛、反式-2-己烯醛和1-辛烯-3-醇對PCA2影響較強(qiáng)；因此三個(gè)產(chǎn)地間果實(shí)揮發(fā)性香氣物質(zhì)有顯著差異。PLS-DA結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三個(gè)產(chǎn)地果實(shí)中反式-2-己烯醛、苯乙醇、壬醛、5-羥基糠醛和1-辛烯-3-醇的差異最大，其得分均大于1.0，而其它成分得分均在1.0以下。新疆的反式-2-己烯醛、5-羥基糠醛和1-辛烯-3-醇的相對含量最高，山東的苯乙醇含量最高，而寧夏的壬醛含量大于新疆和山東。

表3 三個(gè)產(chǎn)地‘赤霞珠’葡萄果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)種類及含量Table 3 Content of volatile substance and kinds of 'Cabernet Sauvignon' berries from different production regions

表 4 三個(gè)產(chǎn)地‘赤霞珠’葡萄果實(shí)中共有揮發(fā)性物質(zhì)的含量Table 4 Content of common volatile substance of 'Cabernet Sauvignon' berries from different production regions

圖1 三個(gè)產(chǎn)地‘赤霞珠’果實(shí)共有揮發(fā)性物質(zhì)PCA和PLS-DA分析Figure 1 PCA and PLS-DA in the common volatile compounds of 'Cabernet Sauvignon' berries from different production regions

3 討論與結(jié)論

影響葡萄果實(shí)風(fēng)味物質(zhì)的主要因素包括品種特性、生態(tài)因素和栽培管理方式等[21]。國內(nèi)外許多學(xué)者已經(jīng)證實(shí)不同產(chǎn)地同一品種葡萄果實(shí)品質(zhì)具有地域特征性[5,22]。本文分析比較的‘赤霞珠’果實(shí)采集，三個(gè)不同產(chǎn)地，它們處于不同生態(tài)區(qū)，氣象條件與土壤狀況均不同。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三個(gè)產(chǎn)地果實(shí)粒質(zhì)量有顯著差異，且寧夏最大，新疆最小，這可能是產(chǎn)地降水、光照等因素影響果實(shí)的大小。果實(shí)中可溶性糖、蔗糖和花色苷含量，均表現(xiàn)為新疆顯著高于寧夏和山東，這可能是產(chǎn)地晝夜溫差大，會促進(jìn)總糖的積累，有利于葡萄果實(shí)著色；果實(shí)中可滴定酸含量則是寧夏最高，山東最低，可能與高溫會加速降解果實(shí)內(nèi)蘋果酸有關(guān)。因?yàn)樵谄咸殉墒爝^程中，新疆白天溫度高，山東晝夜溫度均很高。溫度對花青素和黃酮醇的濃度影響很大，但對果實(shí)單寧的積累沒有影響[23-24]。王秀琴等[25]研究認(rèn)為，相同品種在不同產(chǎn)地酚類物質(zhì)含量差異性顯著。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，三個(gè)產(chǎn)地果實(shí)中單寧和總酚含量有顯著差異，且表現(xiàn)為山東最高，新疆最低，這可能與成熟季節(jié)不同產(chǎn)地除溫度外的其它環(huán)境因子有關(guān)，不同微氣候會使葡萄果實(shí)產(chǎn)生不同的、微妙的風(fēng)味差異。

葡萄芳香物質(zhì)受產(chǎn)地的影響很大，因此不同生態(tài)區(qū)的葡萄與葡萄酒都具有獨(dú)特的地域特征。本研究發(fā)現(xiàn)，三個(gè)產(chǎn)地檢測出的總揮發(fā)性物質(zhì)種類數(shù)大致相同，但不同產(chǎn)地香氣組成有明顯差異。研究發(fā)現(xiàn)，冷涼地區(qū)葡萄果實(shí)中C6醛含量的積累更高[12]。而本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，山東果實(shí)中醛類化合物種類數(shù)和相對含量均高于新疆和寧夏，可能與溫度之外其他環(huán)境因素有關(guān)。也有研究發(fā)現(xiàn)，同一品種不同產(chǎn)地果實(shí)中萜烯類物質(zhì)的組成比較接近[26]。本試驗(yàn)中雖然三個(gè)產(chǎn)地萜烯類物質(zhì)組成差異不大，山東果實(shí)萜烯類化合物總的相對含量明顯高于新疆和寧夏，可能是因?yàn)闇嘏貕K果實(shí)中含有更高的單萜類物質(zhì)[12]。萜烯類和酯類化合物在果實(shí)中的含量很小，但其感官閾值都很低，二者均會賦予果實(shí)品種香氣特征。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)新疆，酯類化合物相對含量最高，而寧夏醇類化合物相對含量最高?？梢?，不同產(chǎn)地的環(huán)境因素對釀酒葡萄果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)的影響是十分復(fù)雜的。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，三個(gè)產(chǎn)地間果實(shí)糖、酸含量和粒質(zhì)量均存在顯著差異，含糖量為新疆最高，可滴定酸含量和粒質(zhì)量均為寧夏最高，三個(gè)產(chǎn)地間果實(shí)酚類物質(zhì)均存在顯著差異，果實(shí)中單寧和總酚含量均表現(xiàn)為山東最高，而花色苷含量則為新疆最高，山東最低；三個(gè)產(chǎn)地果實(shí)中檢測出的揮發(fā)性物質(zhì)組成差異明顯。山東果實(shí)中醛類和萜烯類化合物種類數(shù)和相對含量最高，新疆果實(shí)中酯類化合物的種類數(shù)和相對含量最高，而寧夏果實(shí)中醇類化合物種類數(shù)和相對含量最高。因此，不同產(chǎn)地的風(fēng)土條件及地域性決定同一釀酒葡萄品種果實(shí)風(fēng)味物質(zhì)的差異性。