梁 群 程 漢黃華孫③

(1海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院 海南?？?70228;2中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所 海南?？?71101)

巴西橡膠樹是大戟科橡膠樹屬植物，是天然 橡膠的最主要來源。橡膠樹樹皮組織中的乳管細(xì)胞作為橡膠樹中合成和貯存橡膠的重要組織，一直是研究的重點(diǎn)［1］。橡膠合成有賴于韌皮部中蔗糖等碳源的代謝和運(yùn)輸及乳管細(xì)胞中各種酶的合成反應(yīng)；此外，橡膠樹寒害［2］、割面干涸（Tap‐ping panel dryness，TPD）［3］等生理綜合反應(yīng)都會涉及各種蛋白質(zhì)的表達(dá)和功能。樹皮蛋白的成功提取是研究其表達(dá)和功能的前提。然而迄今尚未見有較成熟的橡膠樹樹皮蛋白質(zhì)提取方法的報道。

在過去的幾十年里，已有多種植物蛋白樣品制備方法得到應(yīng)用，諸如丙酮沉淀法、TCA/丙酮沉淀法、苯酚提取法、TCA/丙酮-酚提取法、Trizol沉淀法、尿素-硫脲提取法等［4］。但是由于橡膠樹樹皮結(jié)構(gòu)復(fù)雜，木栓化嚴(yán)重，次生代謝產(chǎn)物豐富，蛋白含量低且雜質(zhì)含量高，使高質(zhì)量的蛋白樣品制備比較困難，至今尚未有橡膠樹樹皮中蛋白提取的標(biāo)準(zhǔn)方法。王斌等［5］使用改進(jìn)酚抽法提取巴西橡膠樹木質(zhì)部的蛋白，過程復(fù)雜且步驟繁瑣；袁坤等［6］使用尿素提取液提取方法無法成功獲得高豐度蛋白；谷瑞升等［7］比較了4種木本植物蛋白的提取方法，發(fā)現(xiàn)改良丙酮沉降法對木本植物葉片、懸浮細(xì)胞以及花藥蛋白提取有效。本研究以橡膠樹成熟大樹的樹干樹皮，為材料，比較TCA/丙酮沉淀法（方法1）、TCA/丙酮—雙乙法（方法2）、TCA/丙酮-Tris-HCl法（方法3）3種橡膠樹樹皮中總蛋白質(zhì)的提取方法，并對其進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

所用材料為10年生未開割的巴西橡膠樹RRIM 600，采自海南省儋州國家橡膠樹種質(zhì)資源圃，以樹干木栓化的樹皮為材料，剝?nèi)『蟮臉淦そ?jīng)液氮速凍后，迅速置于–80℃冰箱備用。

1.1.2 主要試劑

丙酮、三氯乙酸、鹽酸、無水乙醇、乙醚、考馬斯亮藍(lán)G-250等，購自廣州化學(xué)試劑廠；尿素、硫脲、二硫蘇糖醇、苯甲基磺酰氟、三羥甲基氨基甲烷、聚乙烯吡咯烷酮、30%丙烯酰胺（29∶1）Acr/Bis、10% AP，購自北京索萊寶科技有限公司；蛋白定量試劑盒Bradford Protein Assay Kit，購自康維世紀(jì)生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器

研磨機(jī)為德國IKA分析研磨機(jī)-All basic，離心機(jī)為Thermo Scientific的HERAEUS Multifuge X1R，METTLER Toledo DELTA 320 pH計，真空干燥機(jī)CentriVap Concentrator LABCONCO，超聲波破碎機(jī)，MULTISCAN GO酶標(biāo)儀。

1.2 方法

1.2.1 橡膠樹樹皮總蛋白提取

TCA/丙酮沉淀法：參照Sarawanan等［8］的方法，在此方法基礎(chǔ)上稍作改進(jìn)。稱取一定量的樹皮置于液氮預(yù)冷過的研缽中，加入0.5%（m/m）PVPP防止研磨過程中氧化，反復(fù)加入液氮研磨至粉末；在研磨后的樣品中加入等體積的10%的TCA-丙酮溶液懸浮、0.1 mol/L PMSF、1 mol/L DTT至其終濃度分別為1 mmol/L、10 mmol/L，于-20℃靜置6 h或過夜后，以4℃、20 000 g離心15 min，棄上清；沉淀用等體積的預(yù)冷的丙酮溶液重懸?。尤?0 mmol/L DTT），于-20℃靜置1 h后，以4℃、20 000 g離心15 min，棄上清，用丙酮再重復(fù)洗2次直至沒有顏色；取出沉淀真空干燥約5 min，除盡有機(jī)溶劑；按照10 mg干粉末加入200滋L尿素裂解液（7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%CHAPS）的比例，再加入1 mmol/L PMSF、10 mmol/L DTT，超聲5 min，充分溶解1 h后，以4℃，35 000 g離心30 min，上清為所需的蛋白溶液。

TCA/丙酮—雙乙法：與TCA/丙酮沉淀法相比，在用TCA/丙酮清洗樹皮粉末3次并離心后，加入雙乙試劑（V乙醇∶V乙醚＝1∶1），于-20℃靜置1 h后，以4℃，20 000 g離心15 min，棄上清；再加入丙酮重復(fù)洗2次直至沒有顏色。后續(xù)操作均與TCA/丙酮沉淀法相同。

TCA/丙酮-Tris-HCl法：按TCA/丙酮沉淀法的操作進(jìn)行至真空干燥獲得樹皮干粉后，用Tris-HCl（120 mmol/L Tris-HCl、20%甘油、4% SDS）溶液代替尿素裂解液溶解樹皮粉末，其他操作均與TCA/丙酮沉淀法相同。

1.2.2 蛋白定量

使用康為世紀(jì)生物科技有限公司的Bradford Protein Assay Kit測量蛋白質(zhì)濃度，以試劑盒中的牛血清蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；取待測樣品1滋L于試劑盒中的考馬斯亮藍(lán)G-250顯色液中，使用MULTISCAN GO酶標(biāo)儀測其OD595值，蛋白質(zhì)濃度表示為mg/mL，重復(fù)3次以評估蛋白質(zhì)提取效率。

1.2.3 SDS-PAGE與Western blot

制作2塊SDS-PAGE膠，分離膠和濃縮膠的濃度分別是10%和5%；將上述3種方法提取的蛋白母液用SDS-PAGE上樣緩沖液稀釋，在100℃下煮沸5 min后迅速置于冰上，待其冷卻后加入孔中，50 V起始電壓，待樣品進(jìn)入分離膠后將電壓升到100 V；電泳完畢后將其中一塊膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)R-250染色，另一塊膠進(jìn)行western blot實(shí)驗(yàn)，具體實(shí)驗(yàn)步驟參考abcam官網(wǎng)［9］的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種橡膠樹樹皮總蛋白提取方法比較

采用的3種橡膠樹樹皮蛋白提取方法，在傳統(tǒng)的丙酮/TCA法的基礎(chǔ)上稍加改進(jìn)。橡膠樹樹皮經(jīng)過液氮研磨后，加入TCA/丙酮勻漿，經(jīng)過離心、真空干燥等步驟得到樹皮干粉；隨后加入尿素裂解液、雙乙試劑和Tris-HCl提取液溶解，經(jīng)過超聲波助溶破碎離心，得到樹皮總蛋白的粗提液（圖1）。由于傳統(tǒng)的提取方法最后的蛋白溶解時間過長，容易造成蛋白質(zhì)降解，因此改進(jìn)方法中主要優(yōu)化了提取液配方，以防止蛋白質(zhì)降解。TCA/丙酮-雙乙法是先使用雙乙試劑（V乙醇∶V乙醚＝1∶1）清洗殘留丙酮，用尿素裂解液溶解提??；TCA/丙酮-Tris-HCl法采用Tris-HCl提取液（120 mmol/L Tris-HCl、20%甘油、4%SDS）。

圖1三種蛋白質(zhì)提取方案的示意圖

2.2 三種總蛋白提取方法的提取效率比較

使用3種提取方案對蛋白質(zhì)提取物進(jìn)行定量比較，發(fā)現(xiàn)不同提取方法獲得的蛋白質(zhì)質(zhì)量有所差異。TCA/丙酮沉淀法耗時最少，且Western blot結(jié)果清晰，無雜帶，但總蛋白電泳可見的條帶數(shù)目最少，蛋白濃度偏低。TCA/丙酮—雙乙法耗時最多，可見條帶數(shù)目比TCA/丙酮要多，蛋白濃度相差不大。TCA/丙酮-Tris-HCl法耗時較少，提取蛋白的濃度最高達(dá)到3.21 mg/mL，SDS-PAGE電泳的條帶清晰，上樣孔干凈，泳道無拖尾，條帶數(shù)量最多。綜合來看，TCA/丙酮-Tris-HCl提取的蛋白質(zhì)量較好（表1）。

表1三種橡膠樹樹皮總蛋白提取方法的提取效果比較

2.3 三種總蛋白提取方法的電泳結(jié)果

將3種方法提取的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，上樣量均為100滋g。電泳結(jié)束后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色與脫色，結(jié)果如圖2所示。TCA/丙酮法（泳道1）和TCA/丙酮—雙乙法（泳道2）提取的蛋白經(jīng)過電泳后，泳道背景較深，加樣孔中有殘留雜質(zhì)，泳道拖尾嚴(yán)重，主帶難以區(qū)分，說明這2種方法提取的總蛋白中含有較多的雜質(zhì)。TCA/丙酮-Tris-HCl法（泳道3）提取的蛋白經(jīng)過電泳后，泳道背景最淡，加樣孔干凈無殘留，蛋白條帶清晰可見。使用Gel Image Analysis軟件分析膠圖可知，方法1檢測條帶數(shù)目為8條，方法2檢測條帶數(shù)目為11條，方法3檢測條帶數(shù)目為22條。表明TCA/丙酮-Tris-HCl法提取的橡膠樹樹皮總蛋白凝膠電泳效果最好。

圖2不同提取方法提取橡膠樹樹皮總蛋白的單向電泳圖

2.4 三種蛋白提取方法的Western blot分析

將提取的蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，經(jīng)過Western blot分析后的結(jié)果如圖3所示。使用Western blot對橡膠樹樹皮中微管蛋白tubulin進(jìn)行定量分析可知，圖譜背景清晰，蛋白條帶清晰且位置大小正確。在使用相同上樣量的情況下，TCA/丙酮-Tris-HCl法的條帶更亮，常規(guī)TCA/丙酮沉淀法和TCA/丙酮—雙乙法的條帶較弱。推測原因可能是樣品雜質(zhì)較高導(dǎo)致這2種方法提取的蛋白量偏高。

圖3 3種蛋白提取方法提取橡膠樹樹皮tubulin蛋白定量

3 討論

橡膠樹樹皮蛋白提取過程復(fù)雜，且研磨困難。本研究為了得到充分研磨好的樹皮粉末，首先使用剪刀剪碎樹皮，然后使用研磨機(jī)研磨樹皮，操作時間過長，因此可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解。因此，后續(xù)的提取方法中，在抑制蛋白降解方面要有所改進(jìn)。

常規(guī)TCA/丙酮提取法耗時少且容易操作，一般作為植物蛋白提取的初始方案，是目前提取植物蛋白的常用方法之一，具有降低次生代謝物質(zhì)干擾、減少蛋白降解等優(yōu)點(diǎn)，但該方法常用于幼嫩組織中蛋白的提取，不適用于更為復(fù)雜的植物組織［10］；該方法的一個最大缺點(diǎn)是蛋白質(zhì)很難重新溶解，而且樣品中的非蛋白成分很難除去，可能會丟失膜蛋白和疏水性蛋白［11］。用乙醇—乙醚洗滌以除去水溶性雜質(zhì)（包括高濃度的鹽離子），比傳統(tǒng)的TCA/丙酮法方法能更有效地排除雜質(zhì)干擾；TCA丙酮-Tris-HCl法的提取效果明顯比前2個方法更好，主要表現(xiàn)在蛋白條帶的數(shù)目以及條帶的清晰度，而且Tris-HC1法操作簡便，時間較短，成本適中，提取步驟簡單，減少了因處理步驟繁多而造成的蛋白質(zhì)損失，大大提高了試驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性［10］。

巴西橡膠樹作為一種重要的產(chǎn)膠作物，其主要經(jīng)濟(jì)價值均存在于樹皮中的乳管細(xì)胞。開展乳管及樹皮內(nèi)重要蛋白質(zhì)功能研究對于后續(xù)進(jìn)行橡膠合成及代謝調(diào)控研究至關(guān)重要。本研究通過比較3種橡膠樹樹皮蛋白質(zhì)提取方法，提出了一種簡單高效的橡膠樹樹皮蛋白提取方法，為進(jìn)一步開展橡膠樹樹皮內(nèi)重要蛋白功能研究提供了參考。