宋尚橋 馬圍圍 曾素先 嚴(yán)瑾 孫翠翠 李鑫 黎宗強(qiáng)

摘要：為探討直徑為2 mm以下和2～6 mm豬卵泡卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)分裂率與囊胚率差異，采用相同體外成熟培養(yǎng)條件，來培養(yǎng)從不同直徑的2種卵泡中所抽出的卵母細(xì)胞，在卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)后44～48 h，對卵母細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)激活和體外培養(yǎng)，觀察胚胎體外發(fā)育能力;在培養(yǎng)48 h時進(jìn)行分裂數(shù)據(jù)統(tǒng)計，培養(yǎng)168 h時統(tǒng)計囊胚個數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2 mm 以下豬卵泡卵母細(xì)胞孤雌激活后胚胎的體外培養(yǎng)平均分裂率與2～6 mm豬卵泡卵母細(xì)胞孤雌激活后胚胎的體外培養(yǎng)平均分裂率差異顯著，分別為62.46%、81.76%（P<0.05）;2 mm以下豬卵泡卵母細(xì)胞孤雌激活后胚胎的體外培養(yǎng)平均囊胚率與2～6 mm豬卵泡卵母細(xì)胞孤雌激活后胚胎的體外培養(yǎng)平均囊胚率差異不顯著，分別為11.71%、15.30%。說明正常卵泡、小腔卵泡的卵母細(xì)胞在體外成熟后，孤雌激活胚分裂率依次降低，孤雌胚胎的分裂能力隨卵泡直徑的增大而增強(qiáng);正常卵泡、小腔卵泡的卵母細(xì)胞體外成熟后，孤雌激活胚囊胚率隨卵泡直徑的增大有一定增高，但變化不顯著。

關(guān)鍵詞：豬;小腔卵泡;孤雌激活;分裂率;囊胚率

中圖分類號：S852.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2020）16-0205-03

對于卵母細(xì)胞成熟體系、胚胎發(fā)育體系、胚胎干細(xì)胞體系的建立及體細(xì)胞核移植效率的提高仍需要依賴于各技術(shù)環(huán)節(jié)的進(jìn)一步完善[1]，而孤雌激活胚胎的準(zhǔn)備是其中不可或缺的一個環(huán)節(jié)，也是非常重要的影響因素之一[2]。因此，對于小腔卵泡孤雌激活胚胎發(fā)育率的研究顯得十分必要。在豬卵巢卵母細(xì)胞體外成熟、孤雌激活方面的研究，目前已取得關(guān)鍵性突破[3]。只有卵泡直徑達(dá)2 mm時，卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞才具有體外成熟的能力[4]。卵巢上分布著許許多多的細(xì)胞，不僅包括少量的大腔卵泡卵母細(xì)胞，還包括數(shù)以萬計的腔前卵泡卵母細(xì)胞和小腔卵泡細(xì)胞，這些細(xì)胞是供給進(jìn)行體外培養(yǎng)所需成熟卵母細(xì)胞的潛在重要支柱[5]。早在1996年，Tsafriri等在體外培養(yǎng)豬1～2 mm卵泡的卵母細(xì)胞，獲得15%～25%的成熟率[6]。本研究對豬小腔卵泡卵母細(xì)胞的體外成熟孤雌激活胚胎發(fā)育率進(jìn)行探索，以期為豬的多種試驗研究提供寶貴材料，如體外受精試驗、核移植試驗等，為對卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中發(fā)育機(jī)制的探索有重要價值和研究意義[7-8]。因此，直徑<2 mm的卵泡的卵母細(xì)胞體外成熟的孤雌激活發(fā)育能力及其機(jī)制將逐漸被揭示。通過對豬小腔卵母細(xì)胞孤雌激活后體外發(fā)育能力的研究，為解決豬卵巢資源緊張?zhí)峁┬碌馁Y源。

1 材料

1.1 試驗樣品的采集

從廣西大學(xué)附近的屠宰場獲得新鮮豬卵巢，將其放置于30～35 ℃裝有生理鹽水的保溫瓶中，在 1 h 內(nèi)運(yùn)回實驗室進(jìn)行相關(guān)的試驗操作。

1.2 主要試劑

本研究所用化學(xué)試劑除特別指明外，均購自Sigma公司，如洗卵液（CCM）、胚胎培養(yǎng)液（NCSU）、體外成熟培養(yǎng)液（M）、離子霉素、2，6-二甲苯酚（6DMP）;促卵泡激素（FSH）和促黃體生成素（LH），購自中國科學(xué)院動物研究所;培養(yǎng)用儀器為TCM-199，購自Gibco公司;一次性塑料皿，購自NUNC公司。

2 方法

2.1 卵母細(xì)胞的收集

用帶針頭的注射器分別抽取卵巢表面上直徑<2 mm 和直徑為2～6 mm的卵泡的卵母細(xì)胞，并將2～6 mm卵泡的卵母細(xì)胞設(shè)為第1組，直徑<2 mm 卵泡的卵母細(xì)胞設(shè)為第2組。在實體顯微鏡下用玻璃吸管吸取帶2層卵丘細(xì)胞以上、胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞，之后以具有完整卵丘細(xì)胞層的標(biāo)準(zhǔn)篩選卵母細(xì)胞，將篩選得到的卵母細(xì)胞用CCM洗凈后，以30～60枚為1組移入含1.5 mL成熟培養(yǎng)液的玻璃平皿（30 mm×10 mm）中，設(shè)定體外成熟培養(yǎng)條件為：38.5 ℃、5% CO2及飽和濕度。將不同組的卵母細(xì)胞作好標(biāo)記分開成熟培養(yǎng)。

2.2 豬卵母細(xì)胞的孤雌激活

在豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)44～48 h后，向其中加入含0.1%透明質(zhì)酸酶的洗卵液除去卵丘細(xì)胞，并用槍頭輕輕吹打。然后在40倍體視顯微鏡下檢查卵母細(xì)胞是否排出第一極體，以排出第一極體作為卵母細(xì)胞核成熟的標(biāo)志。挑取核成熟卵母細(xì)胞，采用5 μmol/L離子霉素處理5 min后，用 2.5 mmol/L 二甲氨基嘌呤處理4 h，最后移至 100 μL/滴的胚胎培養(yǎng)基中置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 168 h，并設(shè)定培養(yǎng)條件為：39 ℃、5% CO2飽和濕度。將不同組胚胎作好標(biāo)記分開培養(yǎng)。

2.3 豬孤雌激活胚胎發(fā)育力數(shù)據(jù)統(tǒng)計

在胚胎培養(yǎng)48 h時，統(tǒng)計孤雌激活胚胎發(fā)育分裂率;在培養(yǎng)168 h時，統(tǒng)計孤雌激活胚胎發(fā)育囊胚率。所得試驗結(jié)果均用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，對計量資料進(jìn)行t-檢驗分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 豬小腔卵泡與正常直徑卵泡卵母細(xì)胞孤雌激活胚胎分裂率

由表1可知，2 mm以下卵泡卵母細(xì)胞（小腔卵泡卵母細(xì)胞）孤雌激活后胚胎的體外培養(yǎng)平均分裂率與2～6 mm豬卵泡卵母細(xì)胞（正常卵泡卵母細(xì)胞）孤雌激活后胚胎的體外培養(yǎng)平均分裂率分別為62.46%、81.76%，二者差異顯著（P<0.05）。表明從不同直徑的卵泡中抽出的卵母細(xì)胞孤雌激活后，孤雌激活胚分裂率不同，孤雌胚胎的分裂能力隨卵泡直徑的增大而增強(qiáng)。

3.2 豬小腔卵泡與正常直徑卵泡卵母細(xì)胞孤雌激活胚胎囊胚率

由表1可知，2 mm以下卵泡卵母細(xì)胞孤雌激活后胚胎的體外培養(yǎng)平均囊胚率與2～6 mm豬卵泡卵母細(xì)胞孤雌激活后胚胎的體外培養(yǎng)平均囊胚率分別為11.71%、15.30%，二者差異不顯著（P>0.05）。表明從正常卵泡、小腔卵泡中抽出的卵母細(xì)胞孤雌激活后，孤雌激活胚囊胚率與卵泡直徑大小有一定的關(guān)系，囊胚率隨卵泡直徑的增大而增高，但正常卵泡與小腔卵泡所抽出的卵母細(xì)胞囊胚率相比，差異不顯著。

4 討論

進(jìn)入20世紀(jì)90年代后，有更多學(xué)者投身于小腔卵泡的研究，豬小腔卵泡的體外成熟研究已經(jīng)相當(dāng)普遍，但體外成熟小腔卵泡的孤雌激活研究較少[9-10]。Tsafriri等對豬的1～2 mm卵泡卵母細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其成熟率達(dá)到15%～25%[11]。家畜小腔卵泡卵母細(xì)胞仍然需要經(jīng)歷很多復(fù)雜多變的生理生化過程才能具有恢復(fù)和完成成熟分裂的能力。相關(guān)研究表明，豬卵母細(xì)胞的成熟率和卵泡直徑呈正比[12]。在體內(nèi)正常生理條件下，卵母細(xì)胞發(fā)育程度與卵泡直徑呈正比。豬小腔卵泡卵母細(xì)胞正處于生長后期，進(jìn)行活躍的RNA合成，其體外成熟能力低于2～6 mm卵泡的卵母細(xì)胞[13-14]。研究顯示，2 mm以下卵泡和2～6 mm卵泡的卵母細(xì)胞孤雌激活胚胎分裂率分別為52.63%、80.39%，二者有顯著差異[7]。

囊胚率是分析胚胎發(fā)育情況的一個指標(biāo)[15]。直至目前，大多數(shù)的科學(xué)研究做豬卵母細(xì)胞孤雌激活試驗時，都熱衷于以胞質(zhì)均勻、包裹多層卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞為研究對象[16]。已有的相關(guān)研究表明，擴(kuò)展的卵丘細(xì)胞可以通過調(diào)節(jié)物質(zhì)的通透性，誘捕卵母細(xì)胞排出的有害物質(zhì)，從而達(dá)到有效抑制卵母細(xì)胞死亡和退化的效果[17]。但從小腔卵泡中抽出的卵母細(xì)胞孤雌激活后的囊胚率卻很高，和 2～6 mm 卵泡的卵母細(xì)胞孤雌激活胚胎的囊胚率差異不顯著，表明卵泡大小對卵母細(xì)胞體外成熟、體外發(fā)育有重要影響。

5 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，正常卵泡、小腔卵泡的卵母細(xì)胞體外成熟后，孤雌激活胚分裂率依次降低，說明孤雌胚胎的分裂能力隨卵泡直徑的增大而增強(qiáng);正常卵泡、小腔卵泡的卵母細(xì)胞體外成熟后，孤雌激活胚囊胚率隨卵泡直徑的增大有一定的增高，但變化不顯著;從豬小腔卵泡中抽出的卵母細(xì)胞有一定的發(fā)育能力，在收集卵母細(xì)胞的時候，也應(yīng)該適當(dāng)挑取一部分直徑小于2 mm的小腔卵泡，增加卵母細(xì)胞的數(shù)量，為試驗提供更多的材料。

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