高營 閆強 袁星星 薛晨晨 陳新

摘要：通過對綠豆甲基磺酸乙酯（EMS）誘變試驗，為構(gòu)建綠豆EMS誘變突變體群體提供參考，在拓寬綠豆的遺傳基礎(chǔ)、創(chuàng)造和利用新種質(zhì)等方面具有重要意義。選用蘇綠1號綠豆種子為試驗材料，利用0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%不同濃度的EMS對綠豆種子進行12 h的誘變，研究不同濃度處理條件下綠豆種子萌發(fā)及幼苗生長的影響。研究結(jié)果顯示，EMS濃度為0.4%處理12 h綠豆種子基本都具有萌發(fā)力，而EMS濃度為0.8%處理12 h已經(jīng)使絕大多數(shù)綠豆種子喪失了萌發(fā)力;當(dāng)濃度為0.6%的EMS溶液處理10 h，其萌發(fā)率為47.32%，符合半致死劑量，此時綠豆幼苗的株高、根長與對照相比分別降低了42.3%、44.8%。誘變處理后移栽20 d，出現(xiàn)葉片缺失、增加、卷曲皺縮、掌狀、葉緣不規(guī)則狀等表型。由此可見，綠豆的最佳誘變條件為：EMS濃度0.6%，處理時間10 d。

關(guān)鍵詞：甲基磺酸乙酯（EMS）;誘變;綠豆;種子萌發(fā);半致死劑量

中圖分類號：S522.035.2

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2020）16-0104-04

綠豆[Vigna radiata （Linn.） Wilczek]屬于豆科（Leguminosae）蝶形花亞科（Papilionaceae）豇豆屬（Vigna），染色體組為2n=22[1]。我國是綠豆種植的起源中心之一，在我國種植地域廣泛，種植量僅次于綠豆種植大國印度，并且在云南省、廣西壯族自治區(qū)、山東省、天津市等地均發(fā)現(xiàn)有野生綠豆生長[2]。近年來，隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展和人們生活水平的提高，人們對食物多樣性和均衡性也有了更高的要求。綠豆因其營養(yǎng)成分豐富、藥用價值高而愈來愈受到國內(nèi)外廣大消費者的歡迎。但綠豆進行科學(xué)研究的時間較短，對綠豆進行專業(yè)研究的人員較少，相比其他作物，綠豆的科研進度相對較慢[3-4]。綠豆進行種質(zhì)創(chuàng)新和新品種選育，是未來綠豆育種工作者亟需面對和解決的重要問題。甲基磺酸乙酯（EMS）誘變通過誘發(fā)等位基因位點上某個或者多個堿基突變的一種化學(xué)誘變劑，綜合誘變效果較佳。目前，已經(jīng)在水稻、玉米、油菜、小麥、大豆等作物中廣泛應(yīng)用，對推動作物種質(zhì)資源創(chuàng)新、作物遺傳改良和基因組學(xué)研究起到了重要作用[4-5]。如利用EMS溶液處理水稻，成功獲得了24份半矮化性狀突變體，為水稻矮化育種提供了遺傳材料[6];通過EMS誘變構(gòu)建普通小麥豫農(nóng)201突變體庫，共包含722份突變材料，為小麥功能基因組研究和遺傳改良提供了重要基礎(chǔ)材料[7]。

不同作物的種子對誘變劑的耐受程度存在巨大差異，因此每種作物所選擇的誘變劑量和處理時間很難具有廣適性。國內(nèi)外對綠豆遺傳育種及功能基因組學(xué)的研究相對水稻等作物明顯滯后。因此，明確一種行之有效創(chuàng)制綠豆突變體的方法，可為綠豆優(yōu)異種質(zhì)創(chuàng)制、新品種選育以及功能基因組學(xué)研究提供技術(shù)和材料支撐。本研究通過評價EMS不同濃度和時間誘變處理后綠豆蘇綠1號種子萌發(fā)和幼苗生長狀態(tài)，篩選出最佳誘變的條件，為后續(xù)大規(guī)模構(gòu)建綠豆EMS突變體庫提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為蘇綠1號，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所豆類作物研究室所提供;化學(xué)誘變劑為甲基磺酸乙酯（EMS），從Sigma公司購入。

1.2 綠豆種子誘變處理

1.2.1 EMS溶液配制 取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）21.8 g、磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）6.08 g，溶解定容至1 000 mL，用NaOH溶液將pH值微調(diào)至7.0。將誘導(dǎo)劑EMS溶于該磷酸緩沖液中，配制成0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%共5個濃度EMS溶液。選擇適宜EMS處理濃度0.6%，進行處理時間（分別為0、6、8、10、12 h）對綠豆種子萌發(fā)影響的試驗。

1.2.2 處理方法 人工挑選飽滿的蘇綠1號綠豆種子作為誘導(dǎo)劑處理材料，用以對比不同處理條件對萌發(fā)率和苗期性狀的影響，每個處理約使用200粒種子，用蒸餾水浸泡種子8 h。將浸泡后的綠豆種子放入配制好的EMS溶液中，置于脫色搖床中并在85 r/min 條件下遮光振蕩12 h[8]。處理結(jié)束后，倒掉容器中EMS溶液，添加5%Na2S2O3緩沖液，置于脫色搖床中沖洗10 min，該清洗步驟重復(fù)3次;重復(fù)處理結(jié)束后，用無菌水繼續(xù)清洗振蕩3次;將不同濃度EMS處理后的綠豆種子置于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，再于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后觀察萌發(fā)情況。EMS最佳處理時間篩選方法“同上”。將誘變處理完畢的種子移栽到含有營養(yǎng)土的種植盆中種植，對植株表型變異進行記錄。

1.3 測定方法和指標(biāo)

觀察種子的萌發(fā)情況，記錄每個處理的發(fā)芽數(shù)，并計算萌發(fā)率。處理后綠豆幼苗移植10 d，測量幼苗的株高、根長，拍照記錄

萌發(fā)率=供試種子發(fā)芽數(shù)/供試種子總 數(shù)×100%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件，對不同處理間種子萌發(fā)率、株高、根長等數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，并進行多重比較（LSD），相關(guān)圖使用Excel制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 EMS濃度對綠豆種子萌發(fā)的影響

依據(jù)其他植物EMS誘導(dǎo)劑濃度和處理時間最佳方案，初步選定EMS濃度0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%（以質(zhì)量分數(shù)計）5個濃度梯度和12 h作為處理條件，觀察并記錄綠豆種子的萌發(fā)情況（圖1-A）。結(jié)果表明，0.4% EMS處理12 h后綠豆種子萌發(fā)速度變慢，但是萌發(fā)率和對照相比沒有顯著降低（P>0.05）。當(dāng)處理濃度為0.8%時，其發(fā)芽率由對照組的95%下降至9%，顯著降低了種子萌發(fā)率;而用1.2%、1.6% EMS處理種子，發(fā)芽率分別為2.35%、2.12%。試驗結(jié)果表明，EMS濃度為0.4%處理12 h綠豆種子基本上具有萌發(fā)活力，而0.8%處理12 h已經(jīng)使絕大多數(shù)綠豆種子喪失了萌發(fā)力（圖1-B）。因此應(yīng)進一步選擇介于 0.4%～0.8%之間的誘變濃度0.6%進行不同時間的處理分析。

2.2 EMS處理時間對綠豆萌發(fā)的影響

以濃度為0.6%的EMS溶液處理綠豆種子， 研究不同處理時間對綠豆萌發(fā)及幼苗生長的影響（圖2-A）。與對照相比，處理6 h綠豆的萌發(fā)率為83.05%。處理8、10、12 h綠豆萌發(fā)率分別為64.62%、47.32%、22.09%，且不同處理間存在極顯著差異（P<0.01）（圖2-B）。表明處理10 h時符合半致死劑量的條件。

2.3 EMS誘變對綠豆幼苗生長的影響

為了明確EMS誘變對綠豆幼苗生長的影響，將處理不同時間后的幼苗進行移栽，在正常環(huán)境條件下生長10 d后觀察幼苗的生長狀態(tài)（圖3-A）。移栽后10 d，處理6 h株高、根長與對照相比均未表現(xiàn)出顯著差異;處理8 h株高比對照降低15.6%，根長縮短36.2%，但與處理6 h差異不顯著，與對照差異極顯著（P<0.01）。當(dāng)處理時間為10 h時，株高、根長分別降低了42.2%、44.8%（圖3-B、圖3-C），此時幼苗真葉展開，未見明顯生長異常，繼續(xù)對幼苗生長狀態(tài)進行觀察，發(fā)現(xiàn)移栽20 d后幼苗3出復(fù)葉表現(xiàn)出明顯的變異表型。與對照相比，處理 10 h 出現(xiàn)葉片缺失、葉片增加、卷曲皺縮、掌狀、葉緣不規(guī)則狀等表型（圖4），而處理12 h幼苗生長發(fā)育受到嚴(yán)重抑制，萌發(fā)的種子極少發(fā)育成幼苗。

3 討論與結(jié)論

EMS濃度對綠豆種子萌發(fā)率的影響研究表明，EMS溶液處理對綠豆種子的萌發(fā)有抑制作用，且濃度越高，抑制作用越明顯，該結(jié)論與EMS溶液處理廣金錢草種子的結(jié)果[9]一致。濃度過高或過低均會導(dǎo)致誘變效果不佳，濃度過高綠豆種子發(fā)芽率極低。高濃度處理導(dǎo)致種子的萌發(fā)機制破壞，產(chǎn)生過多的有害物質(zhì)，細胞滲透壓不平衡，細胞失水導(dǎo)致種子不萌發(fā)。

確定種子的EMS誘變半致死劑量，根據(jù)設(shè)置的不同梯度的濃度和時間觀察幼苗的致死率，致死率達到50%左右時為佳[10]。羊草種子的EMS誘變處理以濃度為1.5%、處理時間12 h時的劑量為半致死劑量[11]。EMS誘變處理紅小豆的最佳組合為濃度0.7%、處理時間20 h[12]。通過0.6% EMS不同處理時間的試驗結(jié)果顯示，綠豆種子的萌發(fā)率與EMS溶液誘變處理時間呈負相關(guān);當(dāng)處理時間為 10 h 時，萌發(fā)率為47.32%，接近半致死劑量，初步斷定綠豆誘變的最佳時間為10 h。

EMS誘變處理不同品種的種子，會對其萌發(fā)和生長狀況造成不同程度的影響[10]。EMS誘導(dǎo)處理油菜種子時，對幼苗的抑制作用要弱于對根的抑制作用[13]。通過對處理后綠豆幼苗的株高、根長、葉形等表型分析可知，隨著處理時間的延長，株高降低幅度增加，根長縮短幅度稍不明顯，因此EMS誘變對株高的抑制效果強于根長;而且在處理時間為10 h時，出現(xiàn)葉片缺失、葉片增加、卷曲皺縮、掌狀、葉緣不規(guī)則狀等表型，變異類型最為豐富。本研究結(jié)果表明，誘變處理對綠豆種子的萌發(fā)及幼苗的生長具有抑制作用;EMS誘變處理綠豆種子的最佳條件為：濃度0.6%、處理時間10 h。

參考文獻：

[1]陳 新，袁星星，陳華濤，等. 綠豆研究最新進展及未來發(fā)展方向 [J]. 金陵科技學(xué)院學(xué)報，2010，26（2）：59-68.

[2]田 茜，張文蘭，李 群，等. 綠豆的品質(zhì)特性及綜合利用研究進展[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2016，32（9）：77-82.

[3]溫日宇，劉建霞，宋亞靜，等. 疊氮化鈉對綠豆種子和幼苗生長的誘變效應(yīng)[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017（12）：1933-1936.

[4]王麗俠，程須珍，王素華. 綠豆種質(zhì)資源、育種及遺傳研究進展[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42（5）：1519-1527.

[5]劉 翔. EMS誘變技術(shù)在植物育種中的研究進展[J]. 激光生物學(xué)報，2014，23（3）：197-201.

[6]王 峰，徐 飚，楊正林，等. EMS誘變水稻矮生資源的鑒定評價[J]. 核農(nóng)學(xué)報，2011，25（2）：197-201.

[7]徐艷花，陳 鋒，董中東，等. EMS誘變的普通小麥豫農(nóng)201突變體庫的構(gòu)建與初步分析[J]. 麥類作物學(xué)報，2010，30（4）：625-629.

[8]崔 霞，梁 燕，王玲慧. 不同濃度化學(xué)誘變劑甲基磺酸乙酯對番茄種子發(fā)芽的影響[J]. 北方園藝，2013（14）：28-30.

[9]梅凌鋒，唐艷梅，唐曉敏，等. 3種化學(xué)誘變劑對廣金錢草種子萌發(fā)的影響[J]. 廣東藥學(xué)院學(xué)報，2015，31（3）：310-315.

[10]崔清志，劉曉虹，陳惠明. EMS誘變技術(shù)研究進展[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（5）：7-9，13.

[11]臧 輝，武自念，孔令琪，等. 甲基磺酸乙酯（EMS）誘變對羊草種子萌發(fā)及幼苗生長的影響[J]. 分子植物育種，2018，16（17）：5765-5769.

[12]劉建霞，溫日宇，劉文英，等. EMS不同處理濃度和時間對紅小豆誘變的影響[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（5）：715-717，721.

[13]原小燕，李加納，劉列釗. EMS對油菜種子萌發(fā)的影響[J]. 西南師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2010，35（3）：217-221.