李曉玲 鄭亦佳 陳丹妮 蔣艷琳 楊天燕 孟瑋 郭易佳 褚夢(mèng)潔

摘要：哈氏仿對(duì)蝦和細(xì)巧仿對(duì)蝦是東海經(jīng)濟(jì)蝦類資源中主要的仿對(duì)蝦屬種類，為調(diào)查研究浙江省舟山市近海這2種蝦類種質(zhì)資源現(xiàn)狀及親緣關(guān)系，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得2種仿對(duì)蝦線粒體DNA細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ，基因長(zhǎng)度為 632 bp 的序列片段，共檢測(cè)到101個(gè)變異位點(diǎn)，其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)99個(gè)，哈氏仿對(duì)蝦有4種單倍型，細(xì)巧仿對(duì)蝦有3種單倍型。統(tǒng)計(jì)堿基組成發(fā)現(xiàn)，二者在目的片段上的A+T含量分別為62.0%、62.9%，均顯著高于C+G含量。細(xì)巧仿對(duì)蝦的單倍型多樣性與核苷酸多樣性均高于哈氏仿對(duì)蝦，采用鄰接法構(gòu)建分子系統(tǒng)樹(shù)，并基于木村雙參數(shù)遺傳距離計(jì)算2種仿對(duì)蝦的分化時(shí)間約在5.93百萬(wàn)年前。初步摸清了哈氏仿對(duì)蝦和細(xì)巧仿對(duì)蝦遺傳多樣性現(xiàn)狀并比較了兩者間的遺傳差異，研究結(jié)果以期為仿對(duì)蝦屬經(jīng)濟(jì)物種的遺傳信息和系統(tǒng)發(fā)育提供分子生物學(xué)參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：哈氏仿對(duì)蝦;細(xì)巧仿對(duì)蝦;線粒體CO Ⅰ基因;遺傳差異

中圖分類號(hào)：S917

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）16-0082-05

仿對(duì)蝦屬（Parapenaeopsis）隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門（Arthropoda）、甲殼動(dòng)物亞門（Crustacea）、軟甲綱（Malacostraca）、十足目（Decapoda）、枝鰓亞目（Dendrobranchiata）、對(duì)蝦科（Penaeidae），是廣泛分布于我國(guó)東海海域的一種廣溫性、廣鹽性中小型對(duì)蝦類[1]。國(guó)內(nèi)關(guān)于仿對(duì)蝦的研究大部分集中在形態(tài)學(xué)[2-3]、資源調(diào)查[4-6]以及人工繁育技術(shù)[7-8]等方面，且研究對(duì)象多針對(duì)屬或種的分類階，而對(duì)于親緣關(guān)系較近的種間比較研究則相對(duì)較少。哈氏仿對(duì)蝦（P. hardwickii）和細(xì)巧仿對(duì)蝦（P. tenella）作為東海經(jīng)濟(jì)蝦類資源中占有重要地位的仿對(duì)蝦屬種類，對(duì)二者遺傳多樣性的比較研究尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

線粒體DNA具有母系遺傳、進(jìn)化速度快、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單等特點(diǎn)[9]，位于其上的CO Ⅰ、CO Ⅱ、Cyt b、16S rRNA等基因被廣泛應(yīng)用于甲殼動(dòng)物群體遺傳學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析[10-13]。其中，線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ（cytochrome oxidase subunit Ⅰ，CO Ⅰ）基因作為DNA條形碼，成為近年來(lái)普遍接受和青睞的物種分類鑒定的分子標(biāo)記之一[14]。本研究基于線粒體CO Ⅰ基因序列，分析比較東海海域常見(jiàn)的2種仿對(duì)蝦——哈氏仿對(duì)蝦和細(xì)巧仿對(duì)蝦遺傳多樣性現(xiàn)狀，并結(jié)合GenBank中下載的近緣種序列比對(duì)分析，探討兩者的親緣關(guān)系，以期從分子生物學(xué)角度為仿對(duì)蝦屬物種種質(zhì)資源背景提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)資料。

1 材料與方法

1.1 材料采集和DNA提取

本研究用到的哈氏仿對(duì)蝦（HF，13尾）和細(xì)巧仿對(duì)蝦（XF，6尾）均于2018年10月采自浙江省舟山嵊泗列島近海，參考《東海經(jīng)濟(jì)蝦蟹類》[15]和《蝦蟹生物學(xué)》[16]等書(shū)籍，利用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法分類鑒定后，剪取適量肌肉組織，采用傳統(tǒng)的酚-三氯甲烷法[17]提取基因組DNA，溶解于100 μL滅菌水中，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 PCR擴(kuò)增

本研究用于擴(kuò)增2種仿對(duì)蝦CO Ⅰ基因序列的通用引物[18]由上海桑尼生物科技有限公司合成，具體序列見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為25.00 μL，包括0.25 μL濃度為5 U/μL的Taq酶，正反向引物（10 μmol/L）各1.00 μL，10×buffer緩沖液（含Mg2+）2.50 μL，dNTPs（2.5 mmmol/L）2.00 μL，模板DNA（50 ng）1.00 μL，滅菌雙蒸水17.25 μL。PCR擴(kuò)增的程序：94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性 45 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸5 min。

取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3 μL與等量的6×DNA Loading buffer混合均勻，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠于水平電泳槽中，電泳分離15 min左右，取出凝膠用在紫外光呈像系統(tǒng)中觀察并拍照保存，選取條帶明亮、特異性強(qiáng)的擴(kuò)增產(chǎn)物送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用DNASTAR軟件[19]對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行排序、拼接，經(jīng)人工檢驗(yàn)后截取同源片段;使用DnaSP 5.10軟件[20]進(jìn)行序列分析，統(tǒng)計(jì)序列堿基及氨基酸組成、比較密碼子不同位點(diǎn)的使用頻率，計(jì)算保守位點(diǎn)（conserved sites）、變異位點(diǎn)（variable sites）及簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)（parsimony-informative sites），獲取DNA多態(tài)位點(diǎn)信息以及多樣性參數(shù);采用MEGA 5.05（molecular evolutionary genetics analysis）軟件[21]進(jìn)行聚類分析，以鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)并重復(fù)抽樣分析（bootstrap analysis，重復(fù)數(shù)=1 000）;用其中的Kimura 2-parameter model模型計(jì)算個(gè)體間遺傳距離和種間平均遺傳距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 CO Ⅰ基因序列分析

利用DNASTAR軟件進(jìn)行排序，得到2種仿對(duì)蝦類CO Ⅰ部分基因632 bp長(zhǎng)度的同源片段（圖1）。共檢測(cè)到101個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，無(wú)堿基的插入與缺失，其中單一變異位點(diǎn)2個(gè)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)99個(gè)。哈氏仿對(duì)蝦檢測(cè)到4個(gè)單倍型，包含4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，均為單變異位點(diǎn);細(xì)巧仿對(duì)蝦檢測(cè)到3個(gè)單倍型，包含2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，其中單變異位點(diǎn)和簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)各1個(gè)。哈氏仿對(duì)蝦和細(xì)巧仿對(duì)蝦CO Ⅰ基因序列堿基組成信息見(jiàn)圖2。哈氏仿對(duì)蝦CO Ⅰ基因片段的T、C、A、G的含量分別為35.4%、19.9%、26.6%和18.1%，A+T的含量為62.0%;細(xì)巧仿對(duì)蝦 CO Ⅰ 基因片段的T、C、A和G的含量分別為34.8%、19.3%、28.1%和17.8%，A+T的含量為62.9%。2種仿對(duì)蝦A+T的含量均明顯高于C+G的含量，符合多數(shù)甲殼類動(dòng)物線粒體CO Ⅰ基因序列的研究結(jié)果[2，10，13，18]。密碼子第3位點(diǎn)T和A堿基含量明顯高于C和G，其中A堿基比例最高，分別為39.5%（哈氏仿對(duì)蝦）和44.0%（細(xì)巧仿對(duì)蝦）。

2.2 遺傳多樣性分析

使用DnaSP軟件計(jì)算2種仿對(duì)蝦遺傳多樣性參數(shù)。由表2可知，2種仿對(duì)蝦共檢測(cè)到7種單倍型，平均單倍型多樣度（Hd）為0.713 5，平均核苷酸多樣度（π）為0.072 07，平均核苷酸差異數(shù)（k）為45.474。盡管細(xì)巧仿對(duì)蝦數(shù)量低于哈氏仿對(duì)蝦，但遺傳多樣性指標(biāo)均明顯高于后者。

使用MEGA軟件將CO Ⅰ基因序列翻譯成對(duì)應(yīng)的氨基酸序列，獲得編碼肽鏈長(zhǎng)度為210的氨基酸序列。由圖3可知，2種仿對(duì)蝦間盡管存在4處氨基酸變異位點(diǎn)，但由于同義替換不改變編碼氨基酸，因此哈氏仿對(duì)蝦3種單倍型僅編碼1種氨基酸多肽鏈。細(xì)巧仿對(duì)蝦4種單倍型共編碼了2種氨基酸多肽鏈，其中XF-hap2、XF-hap3和XF-hap4編碼的氨基酸種類一致。

2.3 遺傳距離和聚類分析

對(duì)2種仿對(duì)蝦分別計(jì)算種內(nèi)個(gè)體間與種間遺傳距離，結(jié)果（表3）顯示，2種仿對(duì)蝦種間的遺傳距離為0.178，個(gè)體間遺傳距離分別為0.000～0.005（哈氏仿對(duì)蝦）和 0.000～0.003（細(xì)巧仿對(duì)蝦）。 其中，哈氏仿對(duì)蝦的最大遺傳距離出現(xiàn)在3號(hào)和13號(hào)個(gè)體間，細(xì)巧仿對(duì)蝦的最大遺傳距離出現(xiàn)在3號(hào)和4號(hào)、3號(hào)和5號(hào)之間。為進(jìn)一步比較2種仿對(duì)蝦間的遺傳差異并探究其親緣關(guān)系，以凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）為外群（GenBank登錄號(hào)：HQ127455），采用鄰接法構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。由圖4可知，2種仿對(duì)蝦同種不同個(gè)體間以較高的置信值分別聚類，二者相聚之后再與外群聚類。

3 結(jié)論與討論

受到轉(zhuǎn)錄、翻譯及堿基突變壓力等因素的影響， 不同基因在遺傳密碼子的使用上通常呈現(xiàn)出一定的偏好性[22]。2種仿對(duì)蝦CO Ⅰ基因片段的堿基組成呈現(xiàn)出明顯的高A+T含量特征，這與蝦蟹類線粒體DNA CO Ⅰ序列中普遍存在的現(xiàn)象一致[23]，且密碼子3個(gè)位點(diǎn)堿基組成基本也符合這一規(guī)律。從A+T含量具體大小來(lái)看，密碼子第3位點(diǎn)>第2位點(diǎn)>第1位點(diǎn)，且密碼子第3位點(diǎn)A+T含量明顯高于第1、第2位點(diǎn)。進(jìn)一步比較二者在CO Ⅰ基因片段編碼的肽鏈氨基酸序列組成發(fā)現(xiàn)，除亮氨酸和絲氨酸組成比例有細(xì)微差異外，其余各氨基酸組成大致相同，推測(cè)這與密碼子兼并性有關(guān)，發(fā)生在密碼子第3位點(diǎn)堿基的同義突變沒(méi)有改變其編碼的氨基酸[24]。此外，2種仿對(duì)蝦同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有明顯的相似性，氨基酸序列較高的同源性也表明二者較近的親緣關(guān)系[25]。

遺傳多樣性又稱為遺傳變異，是生物多樣性的基礎(chǔ)，其水平高低揭示了物種進(jìn)化的潛力及抵御不良環(huán)境能力的強(qiáng)弱[26]。本研究對(duì)2種仿對(duì)蝦遺傳多樣性參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，盡管細(xì)巧仿對(duì)蝦樣本數(shù)和單倍型數(shù)較少，但其遺傳多樣性均高于哈氏仿對(duì)蝦。毛智超等比較了哈氏仿對(duì)蝦線粒體CO Ⅰ與16S rRNA基因片段的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)前者變異程度更高，通過(guò)計(jì)算得出的CO Ⅰ基因片段核苷酸多樣性（0.000 87）略低于本研究結(jié)論（0.000 98）[18]，推測(cè)可能與本研究分析的片段長(zhǎng)度較短和樣本數(shù)偏少有關(guān)。合理的取樣數(shù)量是開(kāi)展群體遺傳學(xué)研究的前提和基礎(chǔ)[27]，由于樣本數(shù)量和采樣海域的限制，獲得的信息量有限，在后續(xù)的研究中還將進(jìn)一步擴(kuò)大采樣規(guī)模和數(shù)量，以更加全面準(zhǔn)確地反映該物種的遺傳多樣性現(xiàn)狀[28]。

早在20世紀(jì)60年代，Zuckerkandl等就提出生物在進(jìn)化水平存在“分子時(shí)鐘”這一假說(shuō)[29]，結(jié)合現(xiàn)代基因庫(kù)和古化石證據(jù)能夠大致估算出不同生物門類的起源和進(jìn)化時(shí)間[30]。本研究參考Baldwin等基于CO Ⅰ基因估算對(duì)蝦科3%/百萬(wàn)年的核苷酸分歧速率，根據(jù)種間遺傳距離推算出細(xì)巧仿對(duì)蝦分化時(shí)間較哈氏仿對(duì)蝦早5.93百萬(wàn)年[31]，與同類研究中5.55百萬(wàn)年的結(jié)果相當(dāng)[18]。研究表明，仿對(duì)蝦屬分化時(shí)間為中新世末期至20新世早期，更新世冰期-間冰期的氣候周期性波動(dòng)引起海平面高度的改變，導(dǎo)致物種棲息地范圍經(jīng)歷了不同程度的收縮和擴(kuò)張，推測(cè)西北太平洋邊緣海之間的隔離是造成包括仿對(duì)蝦在內(nèi)的多種海洋生物發(fā)生遺傳分化的主要原因。

本研究隨機(jī)采集了浙江省舟山海域嵊泗列島附近分布的哈氏仿對(duì)蝦和細(xì)巧仿對(duì)蝦，由于二者親緣關(guān)系較近，僅憑形態(tài)學(xué)特征難以準(zhǔn)確區(qū)分，在采樣過(guò)程中容易出現(xiàn)混淆。而基于線粒體CO Ⅰ基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可清晰地將哈氏仿對(duì)蝦和細(xì)巧仿對(duì)蝦分為2支，使之得到有效區(qū)分，顯示出分子測(cè)序技術(shù)在區(qū)分形態(tài)相似種中的優(yōu)越性，能夠較好地驗(yàn)證基于形態(tài)學(xué)鑒定的物種或分類[32-33]，同時(shí)也為今后深入開(kāi)展該海區(qū)蝦蟹類種質(zhì)資源、親緣關(guān)系和遺傳多樣性研究提供基礎(chǔ)資料。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉瑞玉，王永良. 中國(guó)近海仿對(duì)蝦屬的研究[J]. 海洋與湖沼，1987，18（6）：523-539.

[2]徐 琰. 中國(guó)近海仿對(duì)蝦屬分子系統(tǒng)演化和近似種問(wèn)題的研究[D]. 青島：中國(guó)科學(xué)院研究生院：海洋研究所，2005.

[3]宋海棠，俞存根，薛利建. 東海哈氏仿對(duì)蝦的數(shù)量分布和生長(zhǎng)特性研究[J]. 水生生物學(xué)報(bào)，2009，33（1）：15-21.

[4]李明云，倪海兒，竺俊全，等. 東海北部哈氏仿對(duì)蝦的種群動(dòng)態(tài)及其最高持續(xù)漁獲量[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2000，24（4）：364-369.

[5]徐開(kāi)達(dá)，薛利建，賀舟挺，等. 東海北部哈氏仿對(duì)蝦資源量評(píng)估[J]. 福建水產(chǎn)，2010（1）：23-28.

[6]金忠文，汪忠強(qiáng)，尤爾茂. 哈氏仿對(duì)蝦人工繁殖技術(shù)研究[J]. 海洋科學(xué)，2002，26（5）：18-20.

[7]張曹進(jìn)，姚國(guó)興，吳國(guó)鈞，等. 哈氏仿對(duì)蝦人工育苗技術(shù)研究[J]. 水產(chǎn)科技情報(bào)，2011，38（6）：281-283.

[8]Goldstein P Z，Desalle R. Integrating DNA barcode data and taxonomic practice：determination，discovery，and description[J]. BioEssays，2010，33（2）：135-147.