楊利強，徐偉杰，關(guān) 欣

腦卒中是一種腦血管病變引起的神經(jīng)功能喪失的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，分為出血性腦卒中和缺血性腦卒中，其中后者占60%～80%，具有死亡率高、發(fā)病率高、致殘率高等特點[1,2]。我國現(xiàn)有1100萬急性腦缺血患者，且每年新發(fā)病大約240萬人，腦卒中已成為我國居民第一位致死原因[3]。腦缺血發(fā)生后會導致缺血核心區(qū)神經(jīng)元發(fā)生不可逆的壞死性死亡，而缺血半影區(qū)和周邊區(qū)域的神經(jīng)元只是受到不同程度的缺血影響，這些神經(jīng)元在血流恢復(fù)后即可幸存下來。研究表明，在缺血后24 h內(nèi)，存活神經(jīng)元會出現(xiàn)突觸結(jié)構(gòu)水腫、傳導功能障礙，同時因損傷而丟失的突觸多達38%[4,5]。這些結(jié)果表明神經(jīng)突觸對缺血性損傷十分敏感，因此，減少缺血周邊區(qū)突觸的丟失或促進這些突觸重新形成，是減輕缺血后神經(jīng)功能缺陷的關(guān)鍵。

MicroRNA(miRNA)是一類由20-24個核苷酸組成的內(nèi)源性小RNA。miRNA通過完全互補或者部分互補靶向mRNA的3’UTR區(qū)，誘導mRNA降解或者抑制mRNA翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達[6～8]。目前，在人類基因組中已經(jīng)證實約1500個基因由miRNAs編碼，在不同的生理和生存環(huán)境下調(diào)節(jié)各種mRNA表達[9]。在這些miRNAs中，miR-132在許多文章中被證實在神經(jīng)元的發(fā)育和功能中起作用[9,10]。miR-132具有組織特異性，在神經(jīng)相關(guān)的組織中高表達，參與軸突生長、突觸的增殖分化、神經(jīng)遷移以及可塑性等過程[11,12]。因此闡明miR-132在調(diào)控突觸再生中的潛在機制，是抵抗缺血性再灌注損傷、恢復(fù)神經(jīng)功能的一個重要方法。本研究擬通過培養(yǎng)皮質(zhì)原代神經(jīng)元利用缺糖缺氧(Oxygen and glucose deprivation，OGD)模擬腦缺血再灌注損傷模型，探討miR-132在腦缺血中的保護作用。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑 SPF級健康雌性成年懷孕Sprague-Dawley大鼠16～18 d；DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco)、DMEM無糖培養(yǎng)基(Gibco)、胎牛血清(Gibco)、Neurobasal Plus Medium(Gibco)、B27(Gibco)、谷氨酰胺(Sigma)、多聚賴氨酸(Sigma)、胰酶(Sigma)；攜帶相應(yīng)miRNAs的重組慢病毒(Vector Builder)；Trizol(Invitrogen)； miRCURY LNATM Universal RT microRNA PCR(Exiqon公司)；SYBR Green Master Mix(TaKaRa)；CCK-8試劑盒(Sigma)；PSD95(abcam)、Synapsin-1(Cell Signaling Technology)、β-actin(Santa Cruz)。

1.2 原代大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細胞的培養(yǎng) 無菌條件下，處死16～18 d懷孕SD大鼠取出胚胎浸泡于DMEM高糖培養(yǎng)基中置于冰上，斷頭取腦組織分離出胎鼠皮質(zhì)組織，在體式顯微鏡下用眼科鑷剔除硬腦膜和血管等結(jié)締組織并將其剪碎。將剪碎組織轉(zhuǎn)移到0.125%胰酶中，37 ℃消化15 min，每5 min震蕩一次。用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基終止消化，并用其清洗3次。用自制的4種不同口徑的巴斯德管按照口徑從大到小的梯度輕柔吹打組織，吹勻皮質(zhì)神經(jīng)細胞懸液，觀察細胞存活率95%以上并計數(shù)接種，接種于事先多聚賴氨酸包被的6孔板中，接種適宜密度為7×105個。在37 ℃，5%CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h，此時神經(jīng)元細胞已貼壁良好，棄去DEME完全培養(yǎng)基，換成nerubasal+B27+谷氨酰胺的培養(yǎng)基，在第3天加入阿糖胞苷抑制神經(jīng)膠質(zhì)細胞，以后每隔2 d進行一次半換液。

1.3 皮質(zhì)神經(jīng)細胞氧糖剝奪再灌注損傷模型的建立 在37 ℃、5%CO2、95%O2的培養(yǎng)箱中，用Nerubasal+B27+谷氨酰胺的培養(yǎng)基對皮質(zhì)神經(jīng)元細胞進行培養(yǎng)。本研究擬采用OGD細胞模型模擬缺血再灌注損傷，棄去原培養(yǎng)基更換為預(yù)溫的無糖DMEM培養(yǎng)基，然后將其放入37 ℃、5%CO2、95%N2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。2 h后，將無糖DMEM培養(yǎng)基更換為預(yù)溫的Nerubasal+B27+谷氨酰胺培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2、95%O2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4 實驗分組和皮質(zhì)神經(jīng)細胞轉(zhuǎn)染 實驗分為假手術(shù)組(Sham)、氧糖剝奪再灌注損傷組(OGD)、慢病毒對照組(LV-control)、miR-132低表達組(LV-anti-miR-132)、miR-132過表達組(LV-miR-132)。除假手術(shù)組外，其余各組均進行氧糖剝奪再灌注損傷模型的建立。細胞接種后，在37 ℃、5%CO2、95%O2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。神經(jīng)元培養(yǎng)至第7天將重組慢病毒LV-control、LV-anti-miR-132、LV-miR-132進行稀釋轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h后換液繼續(xù)培養(yǎng)至第10天進行OGD處理。

1.5 皮質(zhì)神經(jīng)元存活率的檢測 將細胞接種于96孔板，氧糖剝奪2 h再灌注24 h處理后，換液并依照實驗要求每孔加入CCK-8試劑10 μl，37 ℃孵育4 h，用酶標儀在波長450 nm處讀取吸光度，計算皮質(zhì)神經(jīng)元細胞存活率。

1.6 Real-time PCR檢測各組miR-132的表達 將處理完后的細胞取出，用Trizol提取細胞總RNA，應(yīng)用miRCURY LNATM Universal RT microRNA PCR進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，采用SYBR Green Master Mix法進行實時定量PCR擴增檢測各組miR-132的表達水平，引物序列(見表1)。擴增條件為：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s；40個循環(huán)。每個樣品重復(fù)3次，獲得各孔的CT值，用2ΔΔCT計算各組的miR-132相對表達水平。

1.7 Western blot檢測蛋白表達 將按實驗要求處理完后的細胞取出，加入細胞裂解液，4 ℃裂解30 min，制備蛋白樣品，BCA法檢測各組樣本蛋白濃度。取20 μg蛋白樣品上樣進行SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，室溫下10%脫脂牛奶封閉孵育2 h，隨后封閉一抗PSD95(1∶1000)、Synapsin1(1∶1000)、β-actin(1∶2000)，4 ℃搖床孵育過夜。TBST洗膜3次，HRP標記的二抗(山羊抗兔、山羊抗鼠)稀釋液(1∶10000)封膜，室溫搖床孵育1 h，再次TBST洗膜3次。加ECL化學發(fā)光底物，將PVDF膜充分浸入發(fā)光底物后放入暗盒，在暗室內(nèi)紅外線燈下用X光片進行曝光。蛋白條帶用Image J軟件進行灰度值分析。

表1 Real-time PCR的引物序列

2 結(jié) 果

2.1 OGD處理后各組神經(jīng)元細胞內(nèi)miR-132表達水平的檢測 實時定量PCR結(jié)果(見圖1)。與Sham組神經(jīng)元細胞中miR-132表達量相比，OGD誘導缺血損傷后miR-132表達水平明顯減少(P<0.05，見圖1)。與OGD組相比，過表達組(LV-miR-132)miR-132表達水平顯著上升(P<0.01，見圖1)，而低表達組(LV-anti-miR-132)只有降低趨勢無顯著性差異(見圖1)。

2.2 miR-132表達水平對OGD處理后神經(jīng)元細胞活性的影響 如CCK-8結(jié)果所示，miR-132低表達明顯增加OGD導致的神經(jīng)元細胞的損傷作用(P<0.05，見圖2)，而miR-132表達上調(diào)對OGD導致的神經(jīng)元損傷有一定的抵抗能力。與Sham組相比，OGD組細胞存活率為53.6%，出現(xiàn)顯著減少(P<0.05，見圖2)；同OGD組相比較，低表達組(LV-anti-miR-132)細胞存活率呈現(xiàn)進一步減少(P<0.05，見圖2)，而過表達組(LV-miR-132)細胞活力出現(xiàn)一定程度的升高(P<0.01，見圖2)。

2.3 miR-132表達水平對OGD處理后神經(jīng)元細胞突觸相關(guān)蛋白的影響 通過Western blot檢測了OGD缺血損傷后miR-132不同表達水平對神經(jīng)元突觸相關(guān)蛋白的影響，結(jié)果(見圖3)：與Sham組比較，OGD組Synapsin-1和PSD95蛋白表達減少(P<0.05，見圖3)；同OGD組相比，過表達組(LV-miR-132)Synapsin-1和PSD95的蛋白表達水平明顯上調(diào)(P<0.01，見圖3)，說明miR-132可能通過調(diào)控突觸的可塑性，改變突觸相關(guān)蛋白的表達水平抵抗OGD導致的缺血損傷。而低表達組(LV-anti-miR-132)相較與OGD組Synapsin-1和PSD95的蛋白表達水平有一定的下降趨勢,但是無顯著性差異。

圖1 Real-time PCR檢測不同處理對皮質(zhì)神經(jīng)元中miR-132表達水平的影響

圖2 CCK-8檢測各組皮質(zhì)神經(jīng)元細胞的存活率

圖3 Western blot檢測miR-132表達水平對突觸相關(guān)蛋白的影響

3 討 論

本研究證實，OGD誘導原代皮質(zhì)神經(jīng)元細胞缺血損傷后miR-132表達水平下降；低表達miR-132可以加劇OGD誘導原代皮質(zhì)神經(jīng)元細胞死亡率，過表達miR-132表達水平則可以減輕OGD誘導的缺血損傷，增加原代皮質(zhì)神經(jīng)元細胞的活力，這其中的作用機制可能與miR-132調(diào)控突觸的可塑性，改變突觸相關(guān)蛋白的表達水平存在一定的聯(lián)系。

MiRNA-132是一種富集于腦內(nèi)的神經(jīng)組織特異性表達的miRNA[13]。MiR-132在神經(jīng)功能方面具有重要作用，參與了許多神經(jīng)生理和病理過程而被稱為“NeurimmiR”。體外研究證實miR-132過表達會增加GluR1、谷氨酸受體亞型NR2A、NR2B等突觸相關(guān)蛋白的水平[14]。此外，體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，在嗅球、海馬和紋狀體等再生能力旺盛的腦區(qū)，高表達的miR-132會促進神經(jīng)干細胞分化成的新生神經(jīng)元整合到神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中，增加突觸連接的形成和神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞[12,15]。還有研究證實，過表達的miR-132可以通過抑制靶基因p250GAP表達水平增加突觸的分支和樹突棘的數(shù)目來促進突觸發(fā)生和維持突觸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[16,17]。在腦缺血模型中發(fā)現(xiàn)，miR-132低表達，不利于神經(jīng)元存活和突觸功能重塑；而miR-132過表達可以減少腦缺血后神經(jīng)元死亡，促進神經(jīng)再生，建立新的突觸連接[18]。

我們的研究結(jié)果與其他研究基本一致，皮質(zhì)神經(jīng)元細胞經(jīng)過OGD缺血損傷后會出現(xiàn)大量的神經(jīng)元死亡，miR-132低表達會加劇損傷導致神經(jīng)元死亡率進一步降低，而過表達miR-132可以減輕OGD造成的缺血損傷，提高神經(jīng)元的存活率。Western blot結(jié)果顯示：相較于OGD組，過表達miR-132可以上調(diào)Synapsin-1和PSD95的蛋白表達水平且具有顯著差異，miR-132低表達會使Synapsin-1和PSD95的蛋白表達水平出現(xiàn)一定程度的下降但無顯著差異。所以我們推測miR-132可能是通過影響突觸相關(guān)蛋白的表達水平，調(diào)控突觸的可塑性在OGD缺血損傷中起到保護作用，但是更具體的機制需要進一步研究。