黃雪泉 劉明春 蔣能高

松針揮發(fā)油對氯仿誘發(fā)小鼠心室顫動的影響

黃雪泉 劉明春 蔣能高

（廣西柳州畜牧獸醫(yī)學校 廣西 柳州 545003）

試驗采用吸入氯仿復制小鼠心律失常的動物模型，觀察灌胃給藥松針揮發(fā)油對抗氯仿誘發(fā)小鼠心律失常的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，松針揮發(fā)油低劑量組(0.320ml/kg)對氯仿所致小鼠心室顫動與陰性對照組相比具有顯著對抗作用(P<0.05)，中劑量組(1.010ml/kg)、高劑量組(3.194ml/kg)和美西律組(80mg/kg)對氯仿所致小鼠心室顫動與陰性對照組相比具有極顯著對抗作用(P<0.01)。說明松針揮發(fā)油對氯仿誘發(fā)的心律失常具有對抗作用，具有與I類抗心律失常藥的作用。

松針揮發(fā)油 氯仿 誘發(fā) 小鼠 心室顫動

松針(Pine needles)為松科(Pinaceae)松屬(Pinus)植物的針葉，全世界松有一百多種，在廣西境內(nèi)分布的主要為云南松和馬尾松。其松香、松實、松針歷代均入藥用，而松針采集最為方便[1]，目前國內(nèi)外對松針的研究和利用重點均放在了松針及提取物營養(yǎng)方面[2]；但對松針揮發(fā)油藥理作用研究鮮少，本試驗測定松針揮發(fā)油對昆明種小鼠氯仿誘發(fā)小鼠心律失常的影響，觀察其微觀藥用效果，對其藥理作用進行研究，旨在為研究開發(fā)松針揮發(fā)油產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 提取馬尾松松針揮發(fā)油方法 供試參照《中國藥典》2000年版一部附錄XD揮發(fā)油測定法(甲法)[3]，將1000g馬尾松新鮮針葉全剪為3.5cm長的規(guī)格，置入6.5L的高壓鍋內(nèi)，加清水2000ml，稍拌后加蓋緊蓋好；鍋置1000W的電爐上，再用乳膠管連接高壓鍋的出氣管口，乳膠管另一端連接測定器的分叉管口；將測定器套緊回流冷凝管，然后安裝其余部件；整個裝置裝好后，檢查確保牢穩(wěn)、密閉；開電爐加熱，待觀察到有水蒸氣進入乳膠管中時開冷凝水，進行蒸餾提??；提取過程中要求有一操作者坐在冷凝回收系統(tǒng)前，從測定器下端不斷放走冷凝水(冷凝水收集于一燒杯內(nèi)并將其蓋好)，待有2cm左右高度的揮發(fā)油后放之入玻璃小瓶內(nèi)、蓋好；不斷接收至出油量很少為止。對于盛放揮發(fā)油小瓶中可能混入的少量水，可用注射器小心將水抽出；將所得揮發(fā)油裝棕色瓶密封后置-20℃冰箱內(nèi)[4]。全部藥液用高壓滅器滅菌，1210C滅菌15~20min，取出后置于40C冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 藥品及試劑 松針揮發(fā)油藥液配制：量取揮發(fā)油0.79、2.50、7.91ml，分別以1%吐溫-80生理鹽水配為120ml，即得松針揮發(fā)油的高、中、低給藥濃度；配好的藥液裝瓶蓋緊置4℃冰箱存放，每天灌胃前2h將藥取出，使藥液溫度和室溫平衡。聚山梨酯-80(吐溫-80)，江蘇省無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司生產(chǎn)(批號201800401)；美西律片，上海醫(yī)藥(集團)有限公司信誼制藥總廠生產(chǎn)(批號180302)；氯仿，重慶川東化工(集團)有限公司化學試劑廠生產(chǎn)(批號20180615)；生理鹽水，山東辰欣藥業(yè)股份有限公司(批號1808290723)。

1.1.3 儀器和器材 RM6240C型多道生理記錄處理系統(tǒng)為廣東省東莞市塘廈興萬電子廠生產(chǎn)，針型電極為江蘇科倫醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)。

1.1.4 實試動物 用4~5周齡昆明種小鼠150只，雌雄各半，體重25~30g，從廣西醫(yī)科大學實驗動物中心購買(使用許可證：SYXK桂2014-0002)。動物在試驗前適應性飼養(yǎng)一周，動物房溫度20± 3℃、濕70%左右。標準全價顆粒飼料由該實驗動物中心提供。試驗期間動物自由飲水、攝食。

1.2 方法

1.2.1 小鼠預篩試驗 自整批小鼠中隨機取30只，逐一將小鼠放入含有2ml氯仿的棉球(以后每換一只小鼠加入1ml氯仿)倒置的600ml燒杯內(nèi)，使吸入氯仿直至呼吸停止。立即取出小鼠，仰位固定，標準肢II導聯(lián)測心電圖，通過心電圖判斷室顫發(fā)生率。心室顫動發(fā)生率在80%以上方能使用該批小鼠進行正式實驗[5]。

1.2.2 分組給藥及造模方法 小鼠隨機分為五組，每組3個重復，每個重復10只，灌胃給藥；實驗組分別給予松針揮發(fā)油高、中、低劑量，給藥劑量如表1所示，給藥容量均為0.2ml/10g體重；陽性對照組給予美西律80mg/kg[6]；陰性對照組給予等容量1%吐溫-80生理鹽水。每日9時灌胃，1次/d，連續(xù)給藥6d。于末次給藥1hr后，取1.5g脫脂棉，浸含氯仿2ml，放入倒置的600ml燒杯中；逐一將小鼠放入燒杯內(nèi)，使吸入氯仿直至呼吸停止。立即取出小鼠，仰位固定，迅速以針型電極插入三肢皮下記錄標準肢體II導聯(lián)心電圖(ECG)，通過心電圖判斷室顫發(fā)生率。比較試驗組與對照組室顫發(fā)生率的差別。

1.2.3 測定小鼠心電圖 （1）用RM6240C型多道生理記錄處理系統(tǒng)測定正常小鼠心電圖，正常小鼠心電圖無Q波，且S-T段短，心電測定參數(shù)為20ms/div，1ms，0.02s，100Hz，zoom(1/2)。（2）測定氯仿空白組誘發(fā)小鼠發(fā)生的室顫，心電測定參數(shù)為5ms/div，200μv，0.02s，30Hz，zoom(1)。（3）分別測定氯仿法松針揮發(fā)油低劑量組(0.320ml/kg)、中劑量組(1.010ml/kg)、高劑量組(3.194ml/kg)的小鼠心電圖，均能抵抗小鼠室顫發(fā)生。心電測定參數(shù)分別為20ms/div，200μv，0.02s，30Hz，zoom(1)；10ms，400μv，0.2s，30Hz，zoom(1)；40ms，200μv，0.2s，30Hz zoom(1)。

1.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件的One-way ANOVA，檢驗各治療組、陽性對照組與陰性對照組的各計量指標的差別，試驗數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準誤表示。

2 結(jié)果(見附表)

附表 松針揮發(fā)油對小鼠室顫模型的保護作用(n=7-10)

組別劑量(ml/kg)室顫率 陰性對照組-73.333±3.331 揮發(fā)油低0.32040.000±5.775※ 揮發(fā)油中1.01024.000±3.063※※ 揮發(fā)油高3.19416.270±2.913※※ 美西律組8023.333±8.820※※

注：與陰性對照組對比※P<0.05，※※P<0.01

從試驗結(jié)果(表1)可知，發(fā)現(xiàn)松針揮發(fā)油低劑量組(0.320ml/kg)對氯仿所致小鼠心室顫動與陰性對照組相比具有顯著對抗作用(P<0.05)，中劑量組(1.010ml/kg)、高劑量組(3.194ml/kg)和美西律組(80mg/kg)對氯仿所致小鼠心室顫動與陰性對照組相比具有極顯著對抗作用(P<0.01)。

3 討論

3.1 松針揮發(fā)油的提取和配制

揮發(fā)油是植物中一類具有芳香氣味、在常溫下能揮發(fā)的油狀液體的總稱。揮發(fā)油在植物界分布很廣，特別是菊科、樟科和姜科等植物中[7]。本實驗使用水蒸氣蒸餾法自馬尾松針葉中提取出總揮發(fā)油，其化學成分復雜。據(jù)文獻記載主要含有萜烯為主的一系列不飽和碳氫化合物及其衍生物，如α-蒎烯、β-丁香烯等。高效毛細管氣相色譜法測定松葉中α-蒎烯的含量說明：松針的干品和鮮品的α-蒎烯的含量差異顯著[8]。故松針采回后應立即進行提取，以減少其揮發(fā)性成分耗散。揮發(fā)油提取后冷藏-20℃冰箱中以減少其揮發(fā)和保持其成分穩(wěn)定。吐溫-80是一種乳化劑也是揮發(fā)油的助溶劑。實驗初時以1%的吐溫-80生理鹽水液溶解松針揮發(fā)油，發(fā)現(xiàn)靜置片刻即分層，故改用5%的吐溫-80生理鹽水液，結(jié)果揮發(fā)油較易溶且不分層[9]。

3.2 心律失常動物模型構(gòu)建

研究抗心律失常藥，需要心律失常動物模型[9]。實驗性心律失常方法較多，如藥物誘導心律失常法、電刺激引起心律失常法、結(jié)扎冠狀動脈引起心律失常法等。但目前尚無一個理想的心律失常動物模型，因此，常需要幾種模型相互配合來分析抗心律失常藥作用機理[10]。考慮本課題實驗研究的目的和實驗室現(xiàn)有條件等因素，本課題采用了氯仿致小鼠心室顫動作為初篩實驗；通過肢體標準II導聯(lián)記錄心電圖來觀察心律失常發(fā)生、持續(xù)時間和心律失常類型等。試驗采用預防給藥法。

3.3 松針揮發(fā)油對小鼠室顫的影響

揮發(fā)油低(0.320ml/kg)、中(1.010ml/kg)、高(3.194ml/kg)劑量小鼠灌胃6d，對氯仿致小鼠室顫具顯著對抗作用(與陰性對照組比P<0.05)，說明其可能可以阻止氯仿致的Adr-R依賴性Ca2+內(nèi)流作用[11]。本試驗中高劑量組的小鼠死亡較多(死亡3只)，懷疑該劑量對小鼠來說還是過高。因為當初給藥劑量的確定是根據(jù)林健等文獻記載的松針揮發(fā)性成分小鼠Po的LD50>18g/kg來折算的，折算結(jié)果可能與實際藥物作用有一定的差距，但此實驗為下一步實驗的用藥劑量提供了參考數(shù)據(jù)。

3.4 氯仿、美西律的作用機理

3.4.1 氯仿的作用機理 氯仿誘發(fā)心律失常，可能與促使Adr-R依賴性Ca2+內(nèi)流有關(guān)；與自主神經(jīng)及其遞質(zhì)的釋放、腎上腺髓質(zhì)分泌以及對心臟的直接作用有關(guān)。腎上腺素激活心肌細胞膜的β受體，使心肌細胞內(nèi)Ca2+過量而誘發(fā)心律失常[11]。本實驗采用以上實驗方法，可以考察松針揮發(fā)油對Ca2+、Na+離子分布及其通道的影響；還考察了揮發(fā)油對多因素如自由基損傷及鈣反常現(xiàn)象的影響；本試驗法是較成熟的，因此能較好的達到試驗目的。

3.4.2 美西律的作用機理 美西律主要作用于希—浦系統(tǒng)，可縮短浦肯野纖維的動作電位時程和有效不應期且縮短動作電位時程更為明顯，故相對延長有效不應期；大劑量還可減慢傳導。美西律可口服應用，且吸收迅速而完全，生物利用度高。用于治療各種快速性心律失常，如早搏、心動過速等[12]。本試驗發(fā)現(xiàn)其對氯仿所致小鼠的室顫具有顯著對抗作用。

3.5 揮發(fā)油灌胃劑量的摸索

松針揮發(fā)油的灌胃劑量，預實驗時以文獻記載[13]的其揮發(fā)性成分小鼠Po的LD50>18g/kg來折算小鼠灌胃給藥劑量:即高劑量為6.39ml/kg小鼠；中劑量為2.02ml/kg小鼠；低劑量為0.64ml/kg小鼠。但以此劑量灌胃幾天后發(fā)現(xiàn)小鼠攝食減少，毛色差，體重下降且高劑量組的小鼠死亡較多。故認為此劑量偏高了，是造成本實驗中高劑量組的小鼠在實驗過程中死亡較多的原因。于是調(diào)整正式實驗的灌胃劑量且以小鼠的中劑量的1/2折算為灌胃的高劑量即1.01ml/kg，調(diào)整灌胃劑量后，在另一個實驗中發(fā)現(xiàn)此劑量對小鼠是合適的，小鼠在實驗過程中死亡減少。將來可以松針揮發(fā)油的準確灌胃劑量進行進一步研究。

4 結(jié)論

實驗結(jié)果表明：松針揮發(fā)油對氯仿誘發(fā)的心律失常具對抗作用，揮發(fā)油能阻止氯仿所致的鈣離子內(nèi)流作用；松針揮發(fā)油具有與I類抗心律失常藥類似的抗心律失常作用。

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（2020–06–05）

S816.76

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1007-1733(2020)09-0008-03