王艷花 薦紅舉 邱 曉 李加納,*

白菜型油菜粒色主效基因的調(diào)控機制分析

王艷花1,2薦紅舉1邱 曉2李加納1,*

1西南大學農(nóng)學與生物科技學院/ 油菜工程研究中心, 重慶 400715;2薩斯喀徹溫大學, 加拿大薩斯卡通 S7N5A8

白菜型油菜(L., 2= 20, AA)為十字花科蕓薹屬作物, 屬于栽培油菜基本種。我國是白菜和白菜型油菜的起源中心, 與甘藍型油菜相比, 其起源和栽培歷史悠久, 遺傳資源豐富, 具有天然而穩(wěn)定的黃籽資源。大黃油菜是白菜型油菜中一種天然的黃籽資源, 其粒色鮮黃, 黃籽性狀能夠穩(wěn)定遺傳, 且具有大粒、含油量高、自交親和性好等優(yōu)點, 是研究油菜粒色性狀的良好材料。本研究對白菜型油菜粒色主效基因進行了進一步的功能驗證, 并對的粒色調(diào)控機制進行了初步解析。序列比較結果表明,在不同遺傳背景白菜型油菜黃籽、紅褐籽、黑籽品種中存在固定的差異位點, 同一粒色材料所得序列一致, 可用于預測粒色表型; 酵母雙雜交分析表明, BrTT1可以與另外2個轉錄因子R2R3-MYB (BrTT2)和WD40 (BrTTG1)以及一個催化酶(BrTT3)相互作用。qRT-PCR結果表明, 超量和干擾的表達, 導致類黃酮合成路徑結構基因及其他關鍵調(diào)節(jié)基因、的異常表達或不表達, 從而阻礙了原花色素的正常積累。研究結果進一步明確了在白菜型油菜粒色形成中的調(diào)節(jié)活性。

白菜型油菜;; 類黃酮代謝; 酵母雙雜

油菜是世界上重要的油料作物, 菜籽油是重要的食用油和生物柴油來源, 菜籽餅粕是優(yōu)良的動物蛋白飼料[1-4]。白菜型油菜作為在世界范圍內(nèi)廣泛種植的蕓薹屬油料作物之一, 包含許多優(yōu)異、穩(wěn)定的天然黃籽資源。自20世紀70年代以來, 國內(nèi)外許多研究者對油菜黃籽性狀的大量研究表明, 在相同遺傳背景下, 黃籽油菜的含油量、蛋白質(zhì)含量均高于黒籽油菜, 且黃籽油菜具有皮殼率低、木質(zhì)素和多酚含量低、抗營養(yǎng)物質(zhì)(植酸、單寧、芥子堿、硫苷等)含量低等一系列優(yōu)良品質(zhì)性狀[5-19]。通過對這些黃籽材料粒色性狀的研究, 可以為白菜型黃籽油菜育種方案的制訂提供指導, 促進白菜型油菜品種的改良。同時由于甘藍型油菜中不存在天然的黃籽資源, 白菜作為甘藍型油菜的供體親本之一, 研究者常利用種間雜交或人工合成等方法將白菜型油菜中的黃籽性狀導入甘藍型油菜[20-26]。通過對白菜型油菜黃籽性狀的研究, 以期為甘藍型黃籽油菜遺傳機理的分析奠定基礎。

油菜種子的種皮色素、大小、成分影響油菜的產(chǎn)量和品質(zhì)[24-25]。大黃油菜是白菜型油菜中一種天然的黃籽資源, 其粒色鮮黃, 黃籽性狀能夠穩(wěn)定遺傳, 且具有大粒、含油量高、自交親和性好等優(yōu)點, 是研究油菜粒色性狀的良好材料[26]。目前對擬南芥透明種皮的形成機理較為清楚, 可為黃籽油菜種皮色素積累的研究提供借鑒, 但黃籽油菜種皮色素的形成及調(diào)控機理仍有待研究。Li等[27]對擬南芥和白菜型油菜種皮結構的解剖學觀察證實了擬南芥與白菜型油菜種皮結構不同, 擬南芥與油菜種皮色素積累的方式應該存在潛在的差異。作為油菜中重要的粒色調(diào)控基因, 研究其調(diào)控機制具有重要意義[28-31]。然而, 目前關于及其他粒色主效基因在白菜型油菜粒色調(diào)控機制解析的報道較少。在前期研究中, 通過全基因組重測序結合遺傳連鎖圖譜對白菜型黃籽油菜大黃的粒色基因進行了精細定位, 并對粒色候選基因進行克隆及功能分析, 初步鑒定了為控制大黃粒色的主效基因[30]。本研究將搜集不同來源的白菜型油菜黃、黑籽材料, 分析在其他白菜型油菜的序列差異, 并對在大黃油菜中的功能進行驗證, 初步明確了該轉錄因子在類黃酮代謝路徑中可能調(diào)控的靶基因,揭示下游粒色調(diào)控網(wǎng)絡。解析對白菜型油菜粒色的分子調(diào)控機制, 以期為白菜型和甘藍型油菜粒色研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

不同遺傳背景的白菜型油菜共22份, 主要包括粒色純合的6份黃籽材料(Y1~Y6)、9份紅褐籽材料(R1~R9)和7份黑籽材料(B1~B7), 均由西南大學油菜工程研究中心提供(附表1)。

1.2 不同遺傳背景白菜型油菜中BrTT1的克隆及序列分析

選取Y1~Y6、R1~R9、B1~B7籽粒飽滿的種子, 用紙盤發(fā)苗, 溫度設置為22~25℃, 澆足水, 暗光培養(yǎng)2~3 d, 再移到光照培養(yǎng)室, 待長出4片葉子, 選取單株嫩葉, 采用CTAB (Cetyltrimethylammonium Ammonium Bromide)法[32]提取DNA, 利用紫外分光光度計檢測每個單株的DNA濃度, 并稀釋至50 ng μL-1, 凍于-20℃保存?zhèn)溆?。采用TA克隆的方法[33]獲得序列信息。取油菜授粉后21、28、35、42、49、56 d的種子, 取樣后放-80℃冰箱備用, 采用北京Biomed柱式小量植物總RNA抽提試劑盒提取RNA。采用Geneious Basic 4.8.5軟件進行基因序列的比對; 利用MEGA6.0軟件及NCBI數(shù)據(jù)庫BLASTP分析序列。

1.3 BrTT1互作蛋白預測

在BRAD (http://brassicadb.org/brad/)數(shù)據(jù)庫獲取白菜型油菜中與擬南芥類黃酮代謝相關基因的同源基因信息, 根據(jù)STRING (https://string-db.org/cgi/ input.pl)網(wǎng)站在線預測與BrTT1的互作蛋白, 選取預測分值大于0.5的互作蛋白做進一步驗證。

1.4 酵母雙雜分析BrTT1互作蛋白

采用Primer Premier 5.0軟件設計引物Yb-F/-R (附表2), 克隆的CDS序列, 以pGBKT7為載體構建融合表達誘餌載體pGBKT7-BrTT1; 采用Primer Premier 5.0軟件設計基因特異引物(附表2)分別克隆白菜型油菜類黃酮代謝相關基因、、、、、、、、、的CDS序列, 以pGADT7為載體構建融合表達捕獲載體pGADT7-BrTT2、pGADT7-BrTT3、pGADT7-BrTT4、pGADT7-BrTT8、pGADT7-BrTT18、pGADT7-BrTTG1、pGADT7-BrTTG2、pGADT7-BrTT10、pGADT7-BrTT7、pGADT7-BrTT5與pGBKT7-BrTT1質(zhì)粒分別共轉入酵母細胞Y2HGold, 并涂布在SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His及SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His/+X-α-gal的平板上, 在30℃恒溫培養(yǎng)3 d, 同時設陽性對照組(pGADT7-T + pGBKT7-53)和陰性對照組(pGADT7-T + pGBKT7-laminC), 篩選BrTT1的互作蛋白。

1.5 超量和抑制表達BrTT1載體構建及遺傳轉化

采用Primer Premier 5.0軟件設計引物gCb-F/-R (附表2), 以白菜型油菜褐籽材料cDNA為模板, 采用TA克隆方法獲得基因的CDS序列, Axygen膠回收試劑盒回收目的基因, 采用Gateway方法將膠回收片段連入骨干載體pEarlyGate101。連接產(chǎn)物轉入大腸桿菌DH5α, 挑選陽性克隆送擎科生物測序。采用液氮冷激的方法將陽性克隆轉化農(nóng)桿菌菌株感受態(tài)細胞GV3101, 構建超量表達載體以pFGC5941為骨干載體, 構建干擾載體, 構建方法參照Ma等[34]。參考Cardoza和Stewart[35]的農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化體系, 將構建好的表達載體送武漢雙螺旋生物公司完成遺傳轉化試驗。

1.6 RNA提取和熒光定量分析方法

根據(jù)BRAD數(shù)據(jù)庫信息, 利用白菜型油菜中已知類黃酮途徑參考基因的CDS序列設計定量引物(附表3), 采集田間或溫室不同發(fā)育時期(開花后21、28、35、42、48、56 d)的黃、黑籽種子, 用液氮冷凍后, 保存于-80℃超低溫冰箱備用。待所有不同發(fā)育時期的種子取樣完成后, 使用EASYspin RNA Rapid Plant Kit (Biomed)提取RNA, 使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa, http://www.takara.com.cn/)合成cDNA。qRT-PCR反應體系為20 μL, 包含10 μL 2× Promega GoqPCR Master Mix、1 μL 20 μmol L-1正向引物、1 μL 20 μmol L-1反向引物、100 ng cDNA第一鏈, 添加ddH2O至20 μL。反應程序為94℃ 2 min; 94℃ 3 s, 60℃ 30 s, 40個循環(huán); 60~95℃, 熔解曲線分析。使用2-DDCt法計算基因的表達量[36],基因作為內(nèi)參基因。

2 結果與分析

2.1 蕓薹屬作物中TT1同源基因家族成員的序列差異分析

在BRAD (http://brassicadb.org/brad/)數(shù)據(jù)庫下載獲取蕓薹屬作物同源基因家族成員, 包括甘藍型油菜和、白菜型油菜、甘藍、芥菜型油菜的氨基酸序列, 采用ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw)及GEN EDOC軟件進行氨基酸序列比對分析。其中與的氨基酸序列存在9處差異, 一致性達95%, 而與的氨基酸序列存在4處差異,與的氨基酸序列存在7處差異, 相似度均大于97.5% (圖1)。白菜型油菜與甘藍型油菜的相似度大于甘藍型油菜與之間的相似度, 且蕓薹屬作物不同種之間的氨基酸序列相似度均大于95%, 說明在進化過程中有一定的序列保守性。

圖1 BrTT1同源基因氨基酸序列比對

2.2 不同遺傳背景白菜型油菜中BrTT1的克隆及表達分析

從22份不同遺傳背景的白菜型油菜(包括6個黃籽材料Y1~Y6、9個紅褐籽材料R1~R9和7份黑籽材料B1~B7)中克隆了基因序列(圖2-A, B)。根據(jù)BRAD數(shù)據(jù)庫信息可知, 該基因包含有2個外顯子和1個內(nèi)含子。Geneious軟件對測序得到的序列比對結果表明, 所有的黑籽材料(B1~B7)序列一致; 9份不同來源的紅褐籽材料(R1~R9)擴增獲得的序列表現(xiàn)一致, 且與黑籽材料序列相比,在第834 bp處(以起始密碼子ATG為起點)多1個堿基A, 979 bp處存在1處堿基替換T→C; 黃籽材料Y2、Y3、Y4、Y5、Y6擴增得到的序列與前期對大黃油菜粒色主效基因的研究結果一致, 黃籽序列相同; 與序列相比,內(nèi)含子區(qū)域存在17處SNP (single nucleotide polymorphisms)差異、2處片段缺失, 在外顯子區(qū)域存在7處SNP差異, 分別是A→C、T→A、G→T、A→T、G→A、C→A、A→T, 發(fā)生有義突變的為A→C、C→A、A→T, 第2個外顯子中的最后2個SNP (CNP, ANP)導致的DNA結合區(qū)域發(fā)生2個氨基酸變化(S氨基, H氨基), 這可能導致的功能丟失[31]。

圖2 不同粒色的BrTT1基因的核苷酸序列比對

A: 不同粒色的白菜型油菜種子表型(黑色、紅褐色和黃色); B: 來自不同粒色的的核苷酸序列。TT1-B: 從黑籽中擴增得到的序列; TT1-R: 從紅褐籽種子中擴增得到的序列; TT1-Y: 從黃籽中擴增得到的序列。核苷酸多態(tài)性通過顏色突出顯示, 共有序列下方的線代表內(nèi)含子區(qū)域。標尺= 5000 μm。

A: phenotypes oflines (black, reddish-brown, and yellow) with different seed colors; B: nucleotide sequences of.from the three lines with different seed color. TT1-B was-sequence amplified from the black seeds; TT1-R was-sequence amplified from the reddish-brown seeds; TT-Y was-Y sequence amplified from the yellow seeds. Nucleotide polymorphisms were highlighted by color, the line below the consensus sequence represents the intron region. Bar = 5000 μm.

2.3 BrTT1在白菜型油菜不同粒色形成期種子中的表達分析

在紅褐、黑籽種子中的表達量均高于黃籽中, 且黑籽和紅褐籽種子中的表達沒有顯著差異(圖3)。表明-的內(nèi)含子中2個片段的缺失以及外顯子的SNP差異可能對在種子形成期的表達具有重要影響。前期研究已知全長序列為4586 bp, 包含啟動子片段1796 bp、終止子下游序列986 bp、編碼區(qū)序列1804 bp。等位基因序列分析發(fā)現(xiàn),在黃、褐籽的啟動子序列相同[37]。因此推測內(nèi)含子中片段缺失以及外顯子的SNP差異會影響到mRNA的剪接或穩(wěn)定性。說明在白菜型油菜油菜中粒色調(diào)控過程中均發(fā)揮重要的作用。

圖3 BrTT1基因在3種不同粒色種子形成期的表達分析

B1: 黑色種子系; R2: 紅褐籽種子系; Y2: 黃籽種子系。DAF: 開花后天數(shù)。

B1: a black seed line; R2: a reddish-brown seed line; Y2: a yellow seed line. DAF: days after flowering.

2.4 BrTT1互作蛋白預測

將BrTT1 (Bra028067)信息提交至STRING (https://string-db.org/cgi/input.pl)網(wǎng)站在線預測與BrTT1的互作蛋白(圖4), 結果顯示, 在白菜型油菜中與BrTT1互作的蛋白共有20個(表1), 其中類黃酮途徑的互作蛋白有12個, 分別為BrTT2、BrTTG1、BrTT8、BrTTG2-A、BrTTG2-B、BrTT7、BrTT10-1A、BrTT10-2、BrTT12、BrTT5、BrTT3和BrTT18。

2.5 酵母雙雜交篩選BrTT1互作蛋白

分別設計可能與BrTT1互作的類黃酮代謝基因(打分值在0.568~0.996)的特異引物(附表3), 克隆各基因CDS序列分別構建AD載體, 克隆基因CDS序列構建pGBKT7-BrTT1載體。將各捕獲載體分別與誘餌載體pGBKT7-BrTT1共轉化到酵母菌株Y2H Gold中, 同時設陽性對照組(pGADT7-T + pGBKT7-53)和陰性對照組(pGADT7-T + pGBKT7-laminC)。由圖5可知, BrTT1與BrTT2、BrTT3、BrTTg1均有較強的互作, 而與類黃酮途徑其他蛋白則沒有發(fā)生互作, 推測BrTT1在類黃酮途徑中可能的互作蛋白有BrTT2、BrTT3、BrTTg1。

圖4 白菜型油菜BrTT1的互作蛋白預測分析

表1 預測白菜型油菜BrTT1的互作蛋白的信息

圖5 酵母雙雜篩選BrTT1可能的互作蛋白

酵母細胞涂布于-Leu/-Trp/-Ade/-His的培養(yǎng)基, pGADT7- T/pGBKT7-53作為陽性對照, pGADT7-T/pGBKT7-laminC作為陰性對照。X-α-gal的染色深度表示互作強弱。

Yeast cells were co-transformed and plated on -Leu/-Trp/-Ade/-His plates, with pGADT7-T/pGBKT7-53 as the positive control and pGADT7-T/pGBKT7-laminC as the negative control. X-α-gal activity was determined by colony-lift filter assay; the color intensity of the colonies depicts the qualitative binding strength of the interaction.

2.6 轉基因株系中BrTT1的差異表達

為進一步探索的功能, 本研究構建了的超量表達載體和RNAi干擾載體轉化白菜型油菜浩油11號。并通過PCR檢測鑒定獲得干擾表達的轉基因株系(附圖1)和超量表達的轉基因株系(附圖2)。在干擾株系中,基因的表達顯著低于對照株系B (圖6-A), 從而導致干擾株系轉基因種子種皮色素積累減少(圖6-B), 表明干擾可以減少轉基因種子中黑色素的生物合成和沉積。與非轉基因褐籽材料相比, 過量表達所得轉基因種子中,的表達量及成熟種子的粒色并無顯著差異(圖6-A, B), 表明在白菜型油菜粒色中具有重要的調(diào)節(jié)功能。

2.7 轉基因株系中類黃酮代謝相關基因的差異表達

為進一步了解可能的調(diào)控活性, 取過表達和抑制表達后, 轉基因株系發(fā)育階段的種子(開花后10、20、30、40 d)為材料, 通過qRT-PCR表達譜分析了類黃酮途徑基因的表達水平。根據(jù)差異表達情況, 可將這些基因分為3類(圖7), 第1類為正調(diào)控表達基因, 主要包括、、、、、和, 即的下調(diào)表達降低了這些基因的表達, 而的上調(diào)表達則提高了它們在發(fā)育中種子的表達, 表明這組基因可能受到的正向調(diào)控; 第2類包括、和, 其表達模式與第1類相反, 即下調(diào)表達可增加這些基因的表達, 而上調(diào)則可降低這組基因表達, 表明這些基因受負向調(diào)控; 第3組包括、、和, 其表達對表達的變化無反應, 在2種不同類型的轉基因品系中均未觀察到明顯的變化, 表明這些基因未受調(diào)控。

圖6 過量和干擾表達BrTT1基因

A: 轉基因種子中的差異表達; O1~O4: 過量表達轉基因株系; Ri1~Ri4: 干擾表達轉基因株系; B: 非轉基因黑籽材料; DAF: 開花后天數(shù)。B: 左、中、右分別為過量表達、干擾表達基因、非轉基因褐籽對照成熟種子表型。標尺= 5000 μm。

A: differential expression analysis ofin seeds of the transgenic lines; O1–O4: over-expression lines; Ri1–Ri4: RNAi expression lines; B: non-transgenic lines as the control; DAF: days after flowering. B: left, middle and right represent seed color phenotype in transgenic lines of over-expression, RNAi expression, and the non-transgenic black seed lines, respectively. Bar = 5000 μm.

圖7 RNAi和超量表達BrTT1基因的轉基因株系中類黃酮相關基因的表達分析

O1~O4: 過量表達轉基因株系; Ri1~Ri4: 干擾表達轉基因株系; DAF: 開花后天數(shù)。

O1–O4: over-expression lines; Ri1–Ri4: RNAi expression lines; DAF: days after flowering.

3 討論

原花色素是一種廣泛存在于植物果實、樹葉、種皮中的植物色素, 其生物合成及合成途徑中主要基因功能的解析已在擬南芥、葡萄等植物中有較詳細的研究, 主要由公共苯丙烷途徑、類黃酮途徑及原花色素途徑組成的復合途徑[38-46]。油菜的種皮顏色是由原花色素決定, 且黃籽油菜種皮中不含有原花色素[47-48], 在油菜中原花色素的合成路徑及調(diào)控機制尚未完全清楚。模式植物擬南芥原花色素代謝途徑主要涉及到12個結構基因、6個轉錄因子及3個轉運蛋白的調(diào)控[49]。植物類黃酮代謝反應猶如一個鏈條式結構, 該結構中涉及的每一個酶的突變都可能導致整個代謝路徑的中斷, 原花色素積累受阻[50-51]。在白菜型油菜中, BrTT1被認為是調(diào)節(jié)種皮色素的生物合成和沉積的主要轉錄因子[30-31]。本研究對22份不同粒色(黑籽、紅褐籽和黃籽)的白菜型油菜品系中進行了克隆測序。序列比較表明,序列在不同粒色材料中存在固定的差異位點。與黑籽和紅褐籽中的相比, 來自黃籽的序列在2個外顯子區(qū)域共有7個SNP位點, 而在內(nèi)含子區(qū)域具有2個片段缺失, 這可能導致黃籽中調(diào)節(jié)活性喪失。qRT-PCR分析表明,在黃籽品系和RNAi轉基因系中的表達非常低。這些結果進一步證明,在白菜型油菜粒色性狀中具有重要的調(diào)控作用, 白菜型種子粒色表型可以通過序列多態(tài)性來確定, 與前研究結果在白菜和甘藍型油菜中沉默或下調(diào)表達, 導致種皮中黃酮類化合物的減少, 從而形成黃籽的研究結果相一致[28-31]。在芥菜型油菜中, 從不同的粒色材料(黃籽和褐籽)克隆了, 并鑒定到8個單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點, 但未檢測到的差異表達[28]。

擬南芥AtTT1作為調(diào)節(jié)因子能夠與轉錄因子R2R3-MYB ()和WD40轉錄因子()相互作用, 從而調(diào)節(jié)結構基因如()、()和()的表達[52-54]。酵母雙雜分析表明, BrTT1可以與BrTT2、BrTT3和BrTTG1相互作用, 已有研究表明在擬南芥中TT1與TT2和TTG1的相互作用, 其中TT2的異位表達可以部分恢復突變體的表型[49]。此外, 本研究檢測到BrTT1與BrTT3的相互作用, 在白菜型油菜中,()編碼二氫黃酮醇4-還原酶,受2個轉錄因子BrMYB2-2和BrTT8調(diào)控[55-56]。盡管通過酵母雙雜系統(tǒng)檢測到白菜型油菜中BrTT1與BrTT3的相互作用, 且干擾和過量表達的轉基因品系中的表達受到了明顯的影響, 但仍需要更多試驗來進一步證明BrTT1和BrTT3在白菜型油菜中是否存在相互作用。

在甘藍型油菜中,、、、、和在黃籽種子中表達量較低, 黃籽與褐籽之間的表達差異顯著。此外,的沉默表達降低類黃酮合成相關基因的表達, 如、、、和[31]。本研究表明, 白菜型RNAi轉基因品系中下調(diào)的表達導致、、、、、和的表達降低。和編碼2個轉錄因子(WD40和WRKY),編碼查爾酮合酶(CHS), 這是類黃酮途徑中催化丙二酰輔酶A和4-香豆酰輔酶A縮合的第一種酶[39-41]。、、和是類黃酮生物合成早期和中期重要的結構基因。這些基因的表達均受到的正向調(diào)控。此外, 與的表達呈負向調(diào)控的結構基因主要包括、和。編碼黃烷酮3'-羥化酶(F3'H),編碼漆酶15 (LAC15), 將原花青素(PA)聚合成更大的聚合物并進一步氧化原花色素, 從而使種皮呈現(xiàn)褐色[57], 這一類基因受負調(diào)控。根據(jù)我們之前對大黃油菜中相應的功能表達譜的研究,、、、、和在黃籽種子中表達較低, 但在近等基因系褐籽種子中表達較高。該結果與本研究RNAi轉基因系中類黃酮代謝的下調(diào)表達的結果相一致。進一步表明是調(diào)節(jié)白菜型油菜粒色性狀的關鍵基因之一。的調(diào)控活性的分子解析為蕓薹屬作物種皮中類黃酮的生物合成研究提供借鑒。

4 結論

前期研究對白菜型黃籽油菜大黃的粒色性狀進行了基因精細定位、克隆及擬南芥中遺傳轉化分析, 初步明確了大黃油菜粒色性狀受1對隱性基因控制。本研究在此基礎上明確在其他白菜型油菜黃籽、紅褐籽、黑籽品種中的序列及表達特性, 同一粒色材料所得序列完全一致, 且不同粒色材料存在固定的差異位點, 為更多不同遺傳背景的白菜型油菜粒色研究奠定基礎。通過酵母雙雜及超量和干擾的表達, 解析控制粒色可能的順式作用元件, BrTT1與R2R3-MYB轉錄因子(TT2)及TTG1轉錄因子互作影響類黃酮合成路徑結構基因的表達, 初步解析調(diào)控油菜粒色的分子機制, 為白菜型油菜優(yōu)質(zhì)育種提供新思路, 同時也為甘藍型油菜粒色調(diào)控網(wǎng)絡的研究提供借鑒。

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附圖1 PCR擴增檢測RNAi得到的陽性轉基因植株

Supplementary Fig. 1 PCR amplification of a transgene fragment in transgenic plants withdown-regulated by RNAi using genomic DNA isolated from the seedlings as templates

檢測引物為F35S3ND/FBTT1I (附表2), 檢測片段1.0 kb。+表示陽性對照。

The primer of F35S3ND/FBTT1I (Supplementary Table 2) was used for the amplification of a fragment size at about 1.0 kb. + is a positive control.

附圖2 PCR擴增檢測過表達得到的陽性轉基因植株

Supplementary Fig. 2 PCR amplification of a transgene fragment in transgenic plants over-expressingusing genomic DNA isolated from the seedlings as templates

檢測引物為F35S3ND/FBTT1I (附表2), 檢測片段1.0 kb。+表示陽性對照。

The primer of F35S3ND/CB-R (Supplementary Table 2) was used for the amplification of a fragment size at about 1.0 kb. + is a positive control.

附表1 不同來源的白菜型油菜黃、紅、黑籽材料

Supplementary Table 1 Yellow- and red- and black-seeded materials in B. rapa

附表2 用于載體構建的引物序列

Supplementary Table 2 Primers sequences for vector construction

附表3 用于差異表達分析的引物序列

Supplementary Table 3 Primer sequences for differential expression analysis

Regulatory mechanism of the seed coat color geneinL.

WANG Yan-Hua1,2, JIAN Hong-Jiu1, QIU Xiao2, and LI Jia-Na1,*

1College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University/ Chongqing Engineering Research Center for Rapeseed, Chongqing 400715, China;2University of Saskatchewan, Saskatoon S7N5A8, Canada

(L., 2= 20, AA) is a specie ofgenus, belonging to the basic species of cultivated rapeseed. China is the original center of Chinese cabbage and. Compared with, it has a long history of origin and cultivation and rich genetic resources, which has natural and stable yellow seed resources. Dahuang has the natural yellow seed resource in. Its seed coat color is bright yellow, the yellow seed trait can be stably inherited, and Dahuang has the advantages of large grain, high oil content and good self-adhesiveness. Sequence comparison showed that nucleotide polymorphisms were solely found insequences from different seed color lines (yellow, red or brown, and black), which could be used to predict seed color phenotype. Yeast two-hybrid analysis indicated BrTT1 could interact with two other transcriptional factorsR2R3-MYB (BrTT2) and WD40 (BrTTG1), and one catalytic enzyme (BrTT3). Quantitative RT-PCR analysis of transgeniclines with the gene down-regulated by RNA interference and up-regulated by overexpression revealed that two contrasting groups of genes were regulated byin the biosynthesis and deposition of flavonoids pigments in the seed of. These results further define the regulatory activity ofin seed coat color formation inspecies.

;; flavonoid; yeast two-hybrid

10.3724/SP.J.1006.2020.04036

本研究由中國博士后科學基金面上項目(2019M653319), 重慶市自然科學基金博士后科學基金項目(cstc2019jcyj-bsh0102)和高等學校學科創(chuàng)新引智基地項目(“111”項目)(B12006)資助。

This study was supported by the Project of China Postdoctoral Science Foundation (2019M653319), the Project of Chongqing Natural Science Foundation Postdoctoral Science Foundation (cstc2019jcyj-bsh0102), and Project of Intellectual Base for Discipline Innovation in Colleges and Universities (“111” Project) (B12006).

李加納, E-mail: ljn1950@swu.edu.cn, Tel: 023-68250642

E-mail: hawer313@163.com

2020-02-17;

2020-07-02;

2020-07-15.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200714.1154.004.html