韓利紅，劉 潮，趙明玉，胡麗娟，胡玉霜

(曲靖師范學院 生物資源與食品工程學院/云南高原生物資源保護與利用研究中心/云南省高校云貴高原動植物多樣性及生態(tài)適應性進化重點實驗室,云南 曲靖 655011)

轉錄因子(Transcription factors，TFs)在植物基因表達調控中起著重要作用。多個轉錄因子家族參與植物的生長發(fā)育和脅迫響應，擬南芥(Arabidopsisthaliana)轉錄因子家族構建了高度復雜的調控網(wǎng)絡[1]。SQUAMOSA啟動子結合類蛋白(SQUAMOSA promoter binding protein-like,SPL)為重要的植物特異性轉錄因子，具有76個氨基酸組成的SQUAMOSA啟動子結合功能域(SQUAMOSA promoter binding protein,SBP)，包含2個高度保守的鋅指結合功能域(Zinc fingers,Zn,Cys-Cys-Cys-His和Cys-Cys-His-Cys)和1個核定位信號區(qū)(Nuclear localization signal,NLS)[2]，陸生植物SPL基因在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，參與植物從幼年期到成年期以及營養(yǎng)期到生殖期轉變中的毛狀體發(fā)育、頂端優(yōu)勢、花序分枝、果實成熟和花粉囊發(fā)育等過程[3]，在植物生長發(fā)育和環(huán)境應激過程中發(fā)揮著重要的調控功能[4]。AtSPL3、AtSPL4和AtSPL5通過響應發(fā)育時期、光周期和赤霉素等信號，促進了花的形成，在植物生長發(fā)育和生殖中存在功能冗余[2,5-6]。

miRNA是一類小分子的非編碼RNA，通過介導靶基因mRNA的降解或翻譯抑制實現(xiàn)基因的轉錄后調控[7]。研究表明，miR156/157/529可調控SPL基因的表達[8-10]。擬南芥16個SPL基因中10個為miR156/157的靶基因。AtSPL3基因3′端存在miR156的靶位點序列，其表達受miR156的翻譯抑制或轉錄裂解調控，短日照條件下，3個SPL基因受miR156負調控[8]。過表達缺乏miR156結合位點的AtSPL3加速了植株的發(fā)育進程，導致提早開花但不影響葉片的發(fā)育[8,11]。miR156調控多個SPL基因的沉默，延遲細胞發(fā)育進程，但維持頂端優(yōu)勢[11]。水稻(Oryzasativa)OsSPL14受OsmiR156調控，其高表達增加分蘗數(shù)并提高莖稈機械強度，提高水稻產(chǎn)量和抗倒伏能力[12-13]。TaSPL3/17在小麥多個組織中均有表達，受miRNA156靶向調控，在獨腳金內(nèi)酯信號通路中發(fā)揮作用[14]，主要參與小麥分蘗和穗發(fā)育[15]。miR156/529具有14～16 nt的同源序列，在植物中也可調控SPL基因表達[9]。8個丹參(Salviamiltiorrhiza)SPL基因表達量與其預測調控miR156/157的表達量存在負相關關系，顯示其可能受miR156/157調控[10]。

桑樹屬于?？粕俾淙~喬木，在我國各地均有栽培，桑葉可作為蠶桑飼料，桑樹皮可做造紙原料，果實可供食用，葉、果和根均可入藥，具有重要的經(jīng)濟價值。目前，關于桑樹SPL基因及其蛋白質的研究鮮見報道。鑒于川桑(Morusnotabilis)基因組數(shù)據(jù)已公布[16]，利用生物信息學方法分析川?；蚪M中SPL轉錄因子家族的基因結構、系統(tǒng)進化、氨基酸保守基序，同時，對SPL的同源基因及其調控miRNA進行預測，并分析基因的組織表達情況，為進一步揭示SPL轉錄因子的生物學功能、克隆桑樹SPL轉錄因子基因和培育優(yōu)質桑樹品種提供借鑒。

1 材料和方法

1.1 桑樹SPL基因序列的獲取與鑒定

以擬南芥和水稻SPL蛋白序列[8,12]為檢索序列，在桑樹基因組數(shù)據(jù)庫(https://morus.swu.edu.cn/morusdb/)中使用默認參數(shù)搜索并下載桑樹SPL基因及蛋白序列。使用SMART數(shù)據(jù)庫(http://smart.embl-heidelberg.de/)和GenBank數(shù)據(jù)庫在線工具CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對候選蛋白的功能域進行確認。使用Expasy數(shù)據(jù)庫對蛋白質的氨基酸數(shù)量、分子質量、等電點、總平均疏水指數(shù)等生理生化特征進行預測。

1.2 桑樹SPL基因的結構與進化分析

從桑樹基因組數(shù)據(jù)庫下載SPL基因和編碼序列。使用GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)進行基因結構示意圖繪制。使用MEME在線工具(http://meme-suite.org/tools/meme)預測桑樹SPL轉錄因子的保守基序(Motif)，基序搜索數(shù)目為10。使用Clustal Ⅹ對SPL蛋白的氨基酸序列進行比對，應用MEGA 7.0軟件使用鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用泊松校驗法計算距離，步長值為1 000。

1.3 桑樹SPL基因直系和旁系同源基因鑒定

使用BLASTn對所有MnSPL、AtSPL和OsSPL基因的cDNA序列進行對比，篩選相似性≥40%且比對長度≥300 bp的序列作為候選同源基因，同時進化樹中分布在同一聚類組且支持系數(shù)≥80，被認定為同源基因[17]。

1.4 miRNA靶標SPL基因的預測

根據(jù)序列互補原則對SPL基因的調控miRNA進行預測。使用psRNATarget在線軟件(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/)對文獻[18-19]中桑樹miRNA的靶標SPL基因進行預測。

1.5 桑樹SPL基因的組織表達分析

桑樹SPL基因轉錄組數(shù)據(jù)由桑樹基因組數(shù)據(jù)庫(https://morus.swu.edu.cn/)下載，基因組織特異性表達取樣部位分別為根、樹皮、冬芽、雄花和葉。使用HemI 1.0軟件繪制SPL基因表達熱圖。

2 結果與分析

2.1 桑樹SPL家族成員的鑒定

使用擬南芥和水稻SPL蛋白序列搜索桑樹基因組蛋白數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)15個桑樹SPL基因編碼的蛋白質存在SBP功能域，根據(jù)相似度和比對得分依次命名為MnSPL1—MnSPL15(表1)。桑樹SPL轉錄因子氨基酸數(shù)量介于159～1 042個，蛋白質分子質量介于17.5～115.1 ku，蛋白質等電點介于5.81～9.44，總平均疏水指數(shù)均為負值，表明桑樹SPL轉錄因子均為親水性蛋白質。

表1 桑樹SPL基因家族成員信息Tab.1 Information of SPL gene family in M.notabilis

2.2 桑樹SPL的系統(tǒng)進化及基因結構分析

蛋白質序列比對顯示，植物SPL家族具有高度保守的SBP功能域(圖1)。所有15個MnSPL均具有完整的SBP功能域，包含Zn1(Cys-Cys-Cys-His)、Zn2(Cys-Cys-His-Cys)和NLS(Lys-Lys)(圖1)。MnSPL4和MnSPL11在Zn1的保守氨基酸分別為Cys-Cys-Cys-Cys和Cys-Gly-Cys-His，MnSPL4在NLS的保守氨基酸為Arg-Arg(圖1)。結果與擬南芥和水稻SPL家族相似。

圖1 桑樹、擬南芥、水稻SPLs的SBP功能域序列比對Fig.1 SBP-domain alignment of the SPLs in M.notabilis,Arabidopsis and O.sativa

為了解植物SPL家族的聚類特征，使用MEGA 7.0軟件對分別來自桑樹、擬南芥、水稻的15、17、19條SPL蛋白序列構建系統(tǒng)進化樹(圖2)。3種植物的SPL蛋白聚為8組，每組均包含至少1個MnSPL成員。聚類組Ⅰ和Ⅶ均含有的MnSPL成員數(shù)目最多，均為3個，且這2組均含有擬南芥和水稻中2～4個SPL成員。

圖2 桑樹、擬南芥、水稻SPL家族的聚類、基因結構和氨基酸保守基序分析Fig.2 Comparative analysis of the phylogenetics,exon-intron structure,and conserved motifs of SPL family in M.notabilis,Arabidopsis and O.sativa

使用GSDS 2.0軟件對SPL的基因結構進行分析，發(fā)現(xiàn)該家族基因結構復雜多變，內(nèi)含子數(shù)為1～11不等，同一聚類組中的內(nèi)含子數(shù)和相位(Intron phase)高度一致。聚類組Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ多數(shù)成員均包含2個內(nèi)含子，相位類型為2-1型；聚類組Ⅲ多數(shù)均包含3個內(nèi)含子，相位類型為2-1-1型；聚類組Ⅵ均包含1個內(nèi)含子，相位類型為2型；聚類組Ⅶ多數(shù)均包含9個內(nèi)含子，相位類型為2-1-0-0-0-1-2-0-0型。

使用MEME在線軟件分析發(fā)現(xiàn)，SPL蛋白含有10個保守性較強的氨基酸基序(圖2)。其中，基序1、2、4、6構成了SBP功能域，存在于桑樹、擬南芥、水稻3種植物所有的SPL蛋白中。其他基序主要存在于聚類組Ⅶ和Ⅷ中，與聚類組Ⅶ和Ⅷ復雜的基因結構一致，說明聚類組Ⅶ和Ⅷ中的成員可能具有更多樣的功能。

在比較基因組學中，系統(tǒng)發(fā)育和序列相似性比對通常被用來確定可能的直系或旁系同源基因對[17]。為了解植物SPL家族基因來源及復制情況，對桑樹、擬南芥、水稻SPL家族的直系同源和旁系同源關系進行分析。結果(表2)發(fā)現(xiàn)，桑樹MnSPL1—MnSPL9在擬南芥中均存在直系同源基因，而僅有MnSPL1—MnSPL4、MnSPL8在水稻中存在直系同源基因，說明MnSPL與AtSPL存在更近的聚類關系。桑樹中僅有MnSPL2/MnSPL3一對旁系同源基因，擬南芥中有AtSPL1/AtSPL12、AtSPL9/AtSPL15、AtSPL13A/AtSPL13B、AtSPL14/AtSPL16等4對旁系同源基因，水稻中存在OsSPL1/OsSPL6、OsSPL14/OsSPL17旁系同源基因。

表2 桑樹、擬南芥和水稻中SPL家族直系和旁系同源基因分析Tab.2 Orthologous and paralogous SPL gene pairs in M.notabilis,A.thaliana and O.sativa

2.3 miRNA對桑樹SPL家族基因的調控分析

為了解miRNA對MnSPL基因的調控作用，使用psRNATarget在線軟件對桑樹SPL的調控miRNA進行了預測分析。共預測到38個miRNA與14個SPL存在調控關系，期望值≤3的部分展示在篩選表3。miR156a、miR156b、miR156c、miR157均能調控基因MnSPL6、MnSPL7、MnSPL8、MnSPL9、MnSPL10、MnSPL12、MnSPL15的表達(圖3)，除miR156b對MnSPL7和MnSPL12的調控為轉錄抑制調控外，其他調控均屬于裂解抑制(表3)。除了miR156和miR157家族外，miR529家族的部分成員也能通過裂解抑制方式調控桑樹MnSPL基因的表達。

圖3 miR156/157及其靶基因MnSPL的互補序列比對Fig.3 The complementary sequence alignment of miR156/157 and its target MnSPL gene

2.4 桑樹SPL家族基因的組織表達分析

SPL在擬南芥多個發(fā)育進程中發(fā)揮重要作用。為了解SPL家族基因在桑樹生長發(fā)育過程中的作用，通過桑樹基因組數(shù)據(jù)庫下載桑樹根、樹皮、冬芽、雄花和葉組織的轉錄組數(shù)據(jù)，對桑樹SPL家族基因的組織表達進行分析，發(fā)現(xiàn)15個MnSPLs基因在不同組織中均有表達(圖4)。其中，MnSPL1、MnSPL2、MnSPL4、MnSPL6、MnSPL12、MnSPL13在所有5個組織中均有較高表達，MnSPL8、MnSPL14和MnSPL15在冬芽中有較高表達，MnSPL5和MnSPL9在冬芽、雄花組織中均有較高表達。這些特征表明，桑樹SPL家族基因存在功能冗余，不同的SPL基因在不同組織或發(fā)育階段起作用的強度不同，在植物生長發(fā)育中可能發(fā)揮重要作用。

表3 部分miRNAs靶位點的生物信息學分析Tab.3 Bioinformatic prediction of partial miRNAs target sites in MnSPL genes

續(xù)表3 部分miRNAs靶位點的生物信息學分析Tab.3(Continued) Bioinformatic prediction of partial miRNAs target sites in MnSPL genes by psRNATarget

續(xù)表3 部分miRNAs靶位點的生物信息學分析Tab.3(Continued) Bioinformatic prediction of partial miRNAs target sites in MnSPL genes by psRNATarget

圖4 桑樹SPL家族基因組織表達特征Fig.4 Expression profiles of MnSPL genes in different tissues of M.notabilis

3 結論與討論

自首次從金魚草(Antirrhinummajus)中鑒定SPL基因squa以來[20]，發(fā)現(xiàn)SPL轉錄因子家族存在于所有綠色植物物種中，如擬南芥、水稻、丹參、棉花(Gossypiumraimondii)、番茄(Solanumlycopersicum)、小麥(Triticumaestivum)中分別包含17、19、15、17、15、56個成員[8,10,21-24]。不同物種中SPL基因的數(shù)量差異可能與基因重復有關[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，桑樹基因組中含有15個SPL家族基因，與除小麥外的其他物種SPL基因數(shù)量類似，說明桑樹與大多數(shù)植物物種發(fā)生的基因復制事件類似，而小麥中較多的SPL成員與其基因組中多次基因復制事件有關[23]。桑樹SPL轉錄因子氨基酸長度變化范圍較大，這可能與該家族成員功能的多樣性有關。桑樹SPL均具有完整的SBP功能域，包含2個鋅指結合區(qū)和1個核定位信號區(qū)。這些SPL轉錄因子在調節(jié)植物花和果實發(fā)育[24-25]、植物形態(tài)變異[26]、赤霉素信號轉導[5]、非生物脅迫響應[8,27]以及植物對銅及真菌毒素的反應[28-29]中起著關鍵作用。

進化過程中的基因復制事件所產(chǎn)生的同源基因對物種進化及其快速擴張具有至關重要的作用[30]。對8種代表性陸生植物SPL基因的研究發(fā)現(xiàn)，串聯(lián)復制可能是SPL祖先基因擴張的主要機制，而片段復制可能是開花植物在進化過程中擴張的主要機制，這種片段復制可能在開花植物的器官結構、形態(tài)多樣性及發(fā)育過程中起作用[31]。在以往的研究中，使用SBP-box序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，將植物SPL家族歸為2組或3組，再進一步細分為8個或9個亞組，同一聚類組中基因結構相似，植物SPL家族基因結構和功能高度保守[8,21,32]。本研究以擬南芥、水稻和桑樹SPL轉錄因子全序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)SPL轉錄因子歸為8個聚類組，3個物種SPL轉錄因子并未以物種特有的方式聚集在一起，而是分散在多個聚類組中，除聚類組Ⅱ和聚類組Ⅵ缺少擬南芥或(和)水稻成員外，其他6個聚類組中均包含3個物種的成員。同一聚類組成員具有相似的基因結構和氨基酸基序，表明這些基因可能來源于共同的祖先基因，并在植物生長發(fā)育中發(fā)揮相似的功能。桑樹與擬南芥、水稻分別有12、6個直系同源基因，顯示桑樹與擬南芥有更多的共同祖先基因，桑樹與擬南芥的親緣關系比與水稻更密切，桑樹中僅有1對SPL旁系同源基因，擬南芥和水稻中則分別有4對和2對旁系同源基因，表明擬南芥中該家族基因可能發(fā)生了較多的串聯(lián)復制。這些同源基因分散在不同的聚類組中，說明這些基因可能在物種分化之前已經(jīng)存在于祖先物種中。

植物SPL家族基因受miRNA的調控作用。擬南芥中AtSPL6、AtSPL9、AtSPL15等10個SPL基因受miR156/157的調控，其在植物形態(tài)發(fā)育中發(fā)揮了多種功能[11]，AtSPL6可作為正向調節(jié)因子在TIR-NB-LRR受體介導的植物先天免疫中發(fā)揮作用[31]，AtSPL9和AtSPL15調控了芽的成熟[32]。本研究預測分析顯示，AtSPL6、AtSPL9、AtSPL15在桑樹中的同源基因MnSPL8和MnSPL9也受miR156/157的調控，說明這些基因可能有類似的功能。以前聚類分析顯示，miR156/529的靶基因聚類在同一進化亞組中，表明這些基因來源于同一祖先基因[33]。本研究中，miR156/529的靶基因MnSPL7、MnSPL8、MnSPL9、MnSPL10、MnSPL12、MnSPL15歸在聚類組Ⅰ—Ⅳ中，與以往研究結果一致。然而，這些靶基因的組織表達并不一致，miR156/529結合位點的差異影響了基因的表達[33]，基因復制如何影響miR156/529的調控作用及其調控模式有待進一步研究。

不同組織中SPL基因表達譜分析有助于了解桑樹基因表達的動態(tài)。桑樹部分SPL基因在所有組織中均有表達，這些特異性表達基因可能與植物的生長發(fā)育有關。植物SPL基因能響應多種生物或非生物脅迫，可能參與植物對高溫、干旱等脅迫的防御過程[34]。擬南芥AtSPL7能直接結合到銅響應元件(CuREs)上，通過調控多個基因表達間接調控銅離子內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡[28]，AtSPL7的同源基因MnSPL4在桑樹多個組織中均有較高表達，AtSPL8能調節(jié)小孢子囊發(fā)育、大孢子發(fā)生、萼片上的毛狀體形成、雄蕊絲伸長等[35]，其同源基因MnSPL5主要在冬芽和雄花中有較高表達。過表達基因AtSPL1和AtSPL12通過調節(jié)ABA信號網(wǎng)絡增強了擬南芥和煙草(Nicotianatabacum)生殖期的耐熱性[36]，AtSPL1/AtSPL12的直系同源基因MnSPL2/MnSPL3在桑樹多個組織中有較高的表達。同源基因在基因結構和氨基酸基序上都表現(xiàn)了高度的相似性，其在植物中可能發(fā)揮相似的功能，這些基因在桑樹中的作用機制有待進一步研究。