徐引弟，張青嫻，王治方，焦文強(qiáng)，李海利，朱文豪，王克領(lǐng)

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所/河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)主要引起豬支原體肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine,MPS)，同時(shí)也是在豬群中引起呼吸道疾病綜合征的幾種主要病原菌之一[1-5]。由于豬肺炎支原體缺乏細(xì)胞壁，其主要的抗原物質(zhì)存在于細(xì)胞膜，細(xì)胞膜由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成。豬肺炎支原體主要的膜蛋白有選擇性的被共價(jià)類脂束縛，脂蛋白為支原體膜的主要成分，在感染的免疫和診斷中起著重要作用。目前，研究較多的膜蛋白主要有P36、P46、P65、P42、P97和P110等。P36蛋白是豬肺炎支原體的種特異性蛋白，是一種早期免疫原性蛋白，在其感染過程中可能起著主要作用。豬肺炎支原體感染后能產(chǎn)生針對P36特異的抗體，可用于其診斷及免疫保護(hù)性分析。P46蛋白也是一種具有種特異性、可引起早期免疫反應(yīng)的表面脂蛋白。P65蛋白是主要的免疫脂蛋白，有類似脂酶的特性，偏愛短鏈脂肪酸，具有很高的種間保守性和特異性。P97蛋白是一種豬肺炎支原體黏附素蛋白，與纖毛結(jié)合有關(guān)，也是最主要的免疫原性蛋白。豬肺炎支原體的致病過程是一個(gè)非常復(fù)雜的病理過程，黏附因子、細(xì)胞毒性、免疫調(diào)節(jié)及免疫逃逸等是影響其致病力的主要因素。由于豬肺炎支原體主要存在于動物呼吸道表面，致病性黏附因子(如P97、P145和P57蛋白)的黏附能力對其致病性起著首要作用。此外，目前發(fā)現(xiàn)的豬肺炎支原體膜蛋白還有P110、P159、P102、P116、P216、P271、P107等。豬肺炎支原體與豬呼吸道纖毛的黏附機(jī)制還沒有研究透徹，對這些黏附蛋白的研究將有利于其致病機(jī)制的研究和疾病的診斷與防治[6-9]。

為了對豬肺炎支原體的致病機(jī)制及其黏附因子的黏附機(jī)制有進(jìn)一步研究，從而對河南豬肺炎支原體的遺傳變異及分子流行病學(xué)有更深入研究，以防控豬支原體肺炎，在分離鑒定了豬肺炎支原體河南分離株HNMhy1的基礎(chǔ)上，開展了主要免疫原性基因的鑒定分析，并對其分子流行病學(xué)進(jìn)行研究，旨在為研究高效、安全的豬肺炎支原體疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病料與參考毒株

供試毒株于2017年4月分離自河南省濮陽市某大型豬場發(fā)生重癥肺炎呼吸困難的2月齡保育豬的肺臟，命名為HNMhy1，保藏編號為CGMCC No.：13858，保藏日期為2017年5月26日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。參考毒株為豬肺炎支原體168疫苗株，購自南京天邦生物公司。

1.2 主要試劑

PPLO肉湯粉、酵母粉、瓊脂粉均購自美國BD公司，葡萄糖、酚紅購自上海國藥集團(tuán)公司，MEM、馬血清等均購自美國Hyclone公司，青霉素購自華北制藥集團(tuán)公司，L-精氨酸購自美國Roche公司， 2×PCR Mix、DL2000 Marker、Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒均購自生工生物工程(上海)有限公司。

1.3 基因的擴(kuò)增

1.3.1 引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)豬肺炎支原體P36、P46、P97、P110、P65基因序列設(shè)計(jì)引物[10-17]。引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

表1 PCR擴(kuò)增引物Tab.1 Primers of PCR amplification

1.3.2 DNA提取 將豬肺炎支原體 HNMhy1株接種于PPLO液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，參考文獻(xiàn)[10]的方法進(jìn)行培養(yǎng)。1 2000 r/min離心10 min收集菌體，按照DNA提取試劑盒操作說明提取DNA。

1.3.3 PCR擴(kuò)增 PCR體系為25 μL：2× PCR Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 8.5 μL，待測DNA 2 μL。

PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 4 min；然后35個(gè)循環(huán)：95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min；最后72 ℃ 5 min。取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.4 基因序列分析

將陽性PCR產(chǎn)物回收，16 ℃連接PMD19-T載體過夜，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布含AMP、x-gal、IPTG的LB平板，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取白斑于含AMP的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR檢測，將陽性質(zhì)粒送上海生工生物公司測序，測序序列用BLAST軟件進(jìn)行分析。

1.5 基因進(jìn)化分析

使用DNAStar軟件進(jìn)行基因序列統(tǒng)計(jì)和進(jìn)化分析，將豬肺炎支原體分離株HNMhy1的P36基因核苷酸序列與GenBank中的國內(nèi)外其他分離株(表2)進(jìn)行同源性比較，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析分離株遺傳變異特點(diǎn)。

表2 P36基因參考序列Tab.2 P36 gene reference sequence

2 結(jié)果與分析

2.1 豬肺炎支原體免疫原性基因的擴(kuò)增

根據(jù)豬肺炎支原體P36、P46、P97、P65、P110序列設(shè)計(jì)相關(guān)引物，以臨床分離的豬肺炎支原體 HNMhy1株為模板，通過 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)得到的產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，P36基因擴(kuò)增片段長約948 bp，P46基因擴(kuò)增片段長約1 260 bp，P97基因擴(kuò)增長約片段639 bp，P65基因擴(kuò)增片段長約1 803 bp，P110基因擴(kuò)增片段長約717 bp，與預(yù)期大小均一致(圖1)。

A.P36基因(M.DL2000 Marker；1,3.HNMhy1；2.陰性對照；4.陽性對照);B.P46基因(M.DL2000 Marker；1.陰性對照；2,3.HNMhy1；4.陽性對照);C.P97基因(M.DL2000 Marker；1—3.HNMhy1；4.陽性對照);D.P65基因(M.DL2000 Marker；1,3.HNMhy1；2.陰性對照；4.陽性對照);E.P110基因(M.DL2000 Marker；1—3.HNMhy1；4.陽性對照) A.P36 gene(M.DL2000 Marker;1,3.HNMhy1;2.Negative control;4.Positive control);B.P46 gene(M.DL2000 Marker;1.Negative control;2,3.HNMhy1;4.Positive control);C.P97 gene(M.DL2000 Marker;1—3.HNMhy1;4.Positive control);D.P65 gene(M.DL2000 Marker;1,3.HNMhy1;2.Negative control;4.Positive control);E.P110 gene(M.DL2000 Marker;1—3.HNMhy1;4.Positive control)圖1 P36、P46、P97、P65、P110基因的 PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification results of P36,P46,P97,P65,P110 gene by PCR

2.2 豬肺炎支原體免疫原性基因的序列分析

將擴(kuò)增的豬肺炎支原體分離株HNMhy1的主要免疫原性基因片段回收純化，分別連接pMD19-T載體，然后轉(zhuǎn)化JM109，進(jìn)行測序。將目的片段序列分別與GenBank中的序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)與已公布的豬肺炎支原體菌株的P36、P46、P97、P65、P110序列的同源性較高，均在98%以上，部分毒株同源性高達(dá)100%(表3)。

表3 HNMhy1株擴(kuò)增片段與GenBank中Mhp比對結(jié)果Tab.3 Comparison of nucleotide sequences from amplified fragments of HNMhy1 with corresponding sequences of Mhp in GenBank %

2.3 豬肺炎支原體免疫原性基因的進(jìn)化分析

使用DNAStar軟件進(jìn)行基因序列統(tǒng)計(jì)和進(jìn)化分析，將豬肺炎支原體分離株HNMhy1的P36基因的核苷酸序列與GenBank中其他菌株基因序列進(jìn)行比對，P36與其他毒株的同源性均在98%以上(圖2)?；赑36基因的序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，P36基因與國內(nèi)外報(bào)道的其他毒株的P36基因高度同源，極為保守。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，19株豬肺炎支原體形成2個(gè)大支，其中HNMhy1株與7488株、7422株、J株、168株、韓國分離株(KM014)、比利時(shí)分離株(F7.2C)、瑞士分離株(NCTC10110)、湖北株(ES-2)、江蘇株(ZCF23)、湖南株(HN13、HN6、HN17、HN1001)等在同一分支，而232株與英國株(NCTC10127)、湖南株(HN2、HN3、TZ-1)在另一分支；HNMhy1株與湖南株HN13最近(圖3)?？梢?，HNMhy1株P(guān)36基因極為保守。

3 結(jié)論與討論

豬肺炎支原體感染在世界范圍內(nèi)高度流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬肺炎支原體生長緩慢，很難分離。豬肺炎支原體的基因組全長約900 kb，編碼區(qū)約700 bp，其中約1/3編碼菌體表面蛋白，不同的蛋白質(zhì)在豬肺炎支原體的致病過程中發(fā)揮不同的作用。本研究對分離的豬肺炎支原體HNMhy1株的主要的免疫原性基因P36、P46、P97、P65、P110進(jìn)行了擴(kuò)增測序，與GenBank中的現(xiàn)有序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)與已公布的豬肺炎支原體菌株的序列的同源性均在98%以上，部分毒株同源性高達(dá)100%，表明分離株的P36、P46、P97、P65、P110這5個(gè)主要的免疫原性基因是比較保守的，與國內(nèi)外其他報(bào)道一致[10-20]。

本研究對豬肺炎支原體河南分離株HNMhy1的P36、P46、P97、P65、P110基因的序列進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn) HNMhy1株的主要免疫原性基因高度保守，在遺傳演化中未發(fā)生太大變化。