周興卓 沈麗霞 王莉娜

樟樹在中國資源較為豐富，是中國亞熱帶闊葉林的主要樹種之一[1]。樟樹根系樟科植物樟的干燥根，具有活血化瘀、祛風(fēng)除濕、通利關(guān)節(jié)等多種作用，臨床上主要用于關(guān)節(jié)酸痛、跌打損傷等疾病的治療[2]。研究表明，樟樹根中具有黃酮類、揮發(fā)油類等成分，是樟樹根中主要活性成分[3]。目前，樟樹根中總黃酮的提取工藝主要通過正交試驗(yàn)優(yōu)化[4]，而未見通過響應(yīng)面法優(yōu)化的研究報(bào)道。相比于正交試驗(yàn)，響應(yīng)面法具有試驗(yàn)次數(shù)少、周期短等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于中藥有效成分提取工藝優(yōu)化。因此，本試驗(yàn)利用響應(yīng)面法對樟樹根總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為進(jìn)一步開發(fā)利用樟樹根提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材

樟樹根收集于康恩貝中藥有限公司，經(jīng)江西醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校藥學(xué)系黃平藥師鑒定為樟樹根。

1.2 試劑

蘆?。兌?9.1%，批號100080- 201810），購至成都埃法生物有限公司，所用試劑均為分析純，水為去離子水。

1.3 儀器

UV- 2100 紫外分光光度計(jì)（日本島津有限公司）；KQ- 600KDE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SB- 2000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞龍儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮的提取

精確稱取粉碎后的樟樹根樣品1.0g，置于50mL 錐形瓶中，加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇，在一定超聲波功率、超聲溫度下，提取一段時(shí)間，對所得提取液進(jìn)行減壓抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、濃縮，得樟樹根總黃酮樣品。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取經(jīng)蘆丁10.0 mg，置于50 mL 量瓶中，加入70%乙醇溶液溶解定容，得對照品溶液。準(zhǔn)確移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL 于25 m L 量瓶中，各加1mL5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置6min 后分別加入1mL10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6min 后分別加入10mL 4% 氫氧化鈉溶液，搖勻，最后用70%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15min。在波長510nm 處測其吸光值。以蘆丁濃度X (mg/mL) 對吸光度Y 進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為:Y=6.373X+0.0046（r=0.9993）。根據(jù)回歸方程計(jì)算總黃酮得率。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

通過單因素法，對不同乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%），不同提取時(shí)間（15、30、45、60、90 min），不同液料比（10:1、15:1、20:1、25:1、30:1）進(jìn)行考察，結(jié)果顯示在乙醇濃度為70%，提取時(shí)間為30min，液料比為25:1 時(shí)，提取效率最高。

2.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

（1）響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)法以不同乙醇濃度（A）、提取時(shí)間（B）和液料比（c）3 個(gè)因素為自變量，每個(gè)因素取3 個(gè)水平，見表1。

表1 因素水平表

（2）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

使用統(tǒng)計(jì)軟件得到總黃酮得率對編碼自變量A、B 和C 的回歸方程：Y=12.77+0.22A+0.32B+0.04C- 0.31AB- 0.18AC-0.27BC- 0.41A2- 0.45B2- 0.73C2，該模型回歸顯著（P＜0.00 01），模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)r=0.9931，說明該回歸方程回歸效果較好，試驗(yàn)誤差小。模型校正決定系數(shù)R2adj=0.9947，說明該模型可信度高，失擬項(xiàng)的P＞0. 05，表明該模型失擬不顯著，綜上，星點(diǎn)設(shè)計(jì)- 效應(yīng)面法優(yōu)化樟樹根的總黃酮提取工藝是可行的。

（3）響應(yīng)面分析

通過多元回歸方程作響應(yīng)面圖，可以較直觀地反映各因素間的交互作用。響應(yīng)面圖見圖1、圖2 和圖3。

（4）最佳提取條件的確定

通過軟件Design- Expert 分析得出樟樹根總黃酮最佳提取工藝為：乙醇濃71.65%，提取時(shí)間34.66min，和液料比24.75。為便于操作，將測定條件修正為：乙醇濃72%，提取時(shí)間35min，和液料比25。此條件下得樟樹根總黃酮得率為12.81%，與理論預(yù)測值12.84% 非常接近。說明本實(shí)驗(yàn)所建立的樟樹根總黃酮提取工藝參數(shù)真實(shí)可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

圖1 總黃酮提取率受乙醇濃度和提取時(shí)間的交互影響

圖2 總黃酮提取率受乙醇濃度和液料比的交互影響

圖3 總黃酮提取率受提取時(shí)間和液料比的交互影響

3 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)- 效應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，首次對樟樹根總黃酮的超聲提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并建立了回歸模型。最終得樟樹根總黃酮最佳提取工藝條件是：乙醇濃72%，提取時(shí)間35 min，和液料比25。經(jīng)過驗(yàn)證，試驗(yàn)精確度較高，操作簡單，經(jīng)濟(jì)可行，可用于樟樹根總黃酮的提取。