顧健沛 王巍 李士博 王小喬

1.蘭州現(xiàn)代職業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州730207；2.甘肅省藥品檢驗研究院，甘肅 蘭州730060；3.蘭州市食品藥品檢驗所，甘肅 蘭州730040

甘草為豆科（Leguminosae）甘草屬（Glycyrrihiza L.）多年生草本植物，根和根狀供藥用［1]。世界甘草屬植物有29 種6 變種，我國有17～18 種3 變種［2]。《中國藥典》2015 版國家藥典收摘甘草基原植物為甘草（Glycyrrhia uralensis Fisch），脹果甘草（Glycyrrhia.inflata Bat.）和光果甘草（Glycyrrhia.glabra L.）［3]。其中甘草（Glycyrrhia uralensis Fisch）是我國資源分布最廣，同時甘草酸含量最高的種［4]。甘草屬我國傳統(tǒng)大宗藥材，作為藥物使用首載于西漢《五十二病方》，始載于東漢《神農(nóng)本草經(jīng)》［5]。隨著對甘草的不斷開發(fā)，甘草在藥理作用方面不斷有新的發(fā)現(xiàn)，同時，甘草提取物被廣泛地用于化工業(yè)、食品工業(yè)、化妝品等行業(yè)。由于近20 年來對野生甘草過度拆挖，甘草野生資源瀕臨枯竭，為滿足市場的需要，國內(nèi)各原甘草產(chǎn)區(qū)開始大量種植甘草，為進一步揭示甘草的內(nèi)在質(zhì)量，盡可能控制其內(nèi)在質(zhì)量特性，本研究依據(jù)甘草色譜特征，在生長過程中體內(nèi)化學(xué)成分的變化，在符合《中國藥典》2015 版質(zhì)量要求的基礎(chǔ)上分析各類成分的代謝與積累，通過特異性外標(biāo)物的確定，經(jīng)對測試結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)聚類分析，建立了數(shù)字圖譜，以全信息控制甘草質(zhì)量為目的，建立了甘草數(shù)字控制標(biāo)準(zhǔn)，補充了甘草質(zhì)量全信息控制方法，為甘草及藥材質(zhì)量控制提供了新的方法。

1 儀器與試藥

Waters1200 液相色譜儀；島津LC-2010A 高效液相色譜儀；島津SPD-M10Avp 二極管陣列測器。超聲波清洗器（天津AUTOSCIENCE 公司）；sartorius225D電子天平。甘草酸單銨鹽對照品（批號110731-201720），甘草苷（批號11610-201607）購自中國藥品生物制品檢定研究院；乙腈為色譜純，磷酸為分析純，水為二級反滲透實驗用水，色譜柱：Hypersil C18（5μm，4.6mm×250mm）；保護柱：Hypersil C18（5μm，4mm×40mm）；甘草為Glycyrrhiza uralensis Fisch.將樣品切頭取1cm 以下至0.3cm 部分，樣品產(chǎn)自甘肅省各主產(chǎn)區(qū)地區(qū)及寧夏、內(nèi)蒙古等地。

2 方法

2.1 樣品的制備 取500g 樣品，粉碎，過80 目篩，取約1g，精密稱定，置100mL 容量瓶中，加80%的甲醇適量，超聲提取40min，加80%的甲醇至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液用0.45μm 的微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。取甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL 含甘草酸銨0.2mg 的溶液，即得（甘草酸重量=甘草酸銨重量/1.0207）。或按《中國藥典》2015 年版［3]方法配置。取甘草苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL 含甘草苷20μg 的溶液，即得?；虬础吨袊幍洹?015 年版方法配置。

2.2 測試方法與結(jié)果 采用梯度洗脫的方法以A 0.5%磷酸溶液、B 乙腈，二元梯度洗脫。柱溫：30℃，流速：0.8ml/min，進樣量：10μL，梯度洗脫系統(tǒng)見表1，測定結(jié)果見表2，色譜圖見圖1。

表1 甘草測定流動相系統(tǒng)

圖1 甘草色譜圖

2.3 測試結(jié)果分析

2.3.1 實驗方法學(xué)比較?！吨袊幍洹罚?]方法測定甘草苷和甘草酸的含量與課題研究實驗方法測定結(jié)果經(jīng)t檢驗，結(jié)果無顯著性差異，方法基本可行。見表2。

表2 藥典實驗方法與課題研究實驗方法比較

《中國藥典》2015 年版［3]規(guī)定，含甘草苷（C21H2209）不得少于0.50%，甘草酸（C42H62016）不得少于2.0%。

2.3.2 建模樣品選擇。栽培3 年生甘草甘草酸含量能達(dá)到《中國藥典》［3]要求但甘草苷含量不符合規(guī)定，因此，在建模與分析中采用4 年生甘草和合格的直徑在1cm 以下至0.3cm 部分的種植甘草和野生甘草，從甘草中甘草酸含量和甘草苷含量地區(qū)比對而言，甘草的質(zhì)量主要與緯度有關(guān)而與經(jīng)度無關(guān)，甘草數(shù)字圖譜甘草選擇見表3。

表3 甘草數(shù)字圖譜樣品選擇地區(qū)

2.4 數(shù)字圖譜建立樣品的確定與數(shù)字標(biāo)準(zhǔn)特定色譜峰的選擇

2.4.1 數(shù)字圖譜建立樣品的確定。

2.4.2 數(shù)字標(biāo)準(zhǔn)特定色譜峰的選擇。上述樣品經(jīng)測試，以計量標(biāo)準(zhǔn)物甘草酸保留時間為1，計算各出峰與相對保留時間的關(guān)系見表4，統(tǒng)計分布堆積概率見圖2。由圖2 可見，甘草的主要成分分布在相對保留時間0.47、0.9、0.66、0.76、0.90～0.92、0.96 及1.00分布，其他零星分布的色譜峰可能與取樣甘草的生境不同造成，不具共性。

2.4.3 特征區(qū)域色譜峰面積統(tǒng)計。將表4 在特征相對保留時間0.47、0.49、0.66、0.76、0.90～0.92、0.96 及1.00峰面積歸類統(tǒng)計。得相對保留時間面積表，見表5。

以合格甘草為基樣，進行分析，得出以相對保留時間為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)的數(shù)字圖譜；相對保留時間0.49 為甘草苷，相對保留時間1 為甘草酸，甘草以甘草酸為對照，應(yīng)具備相對保留時間為0.47、0.49、0.66、0.76、0.90～0.92、0.96 的數(shù)字特征峰。

2.4.4 數(shù)字圖譜的定量測定?！吨袊幍洹?015 版［3]中同時測定了甘草中甘草酸與甘草苷，但分別以甘草酸銨和甘草苷為對照品，本部分實驗研究擬通過甘草酸為對照，直接測定甘草各成分的存量，快速反映甘草質(zhì)量。甘草酸銨與甘草苷外標(biāo)法測定關(guān)聯(lián)：以甘草酸銨為基準(zhǔn)物標(biāo)化甘草苷：分別取甘草酸銨、甘草苷對照品加甲醇分別制成每1mL 含甘草苷20μg、甘草酸銨0.2mg的溶液，按照2.1.1～2.1.4 的方法。測定結(jié)果見表6。

表4 甘草相對保留時間與峰面積表

圖2 甘草分布堆積概率圖

表5 甘草相對保留時間面積表

每1mg 甘草苷相當(dāng)于2.856mg 的甘草酸銨，以甘草酸銨為基準(zhǔn)物測定甘草中各成分的含量：以面積比值法，限定各相關(guān)成分的限量要求，按標(biāo)準(zhǔn)限量，折成峰面積計算，見表7。限量設(shè)定：根據(jù)測定結(jié)果暫按下表最小比值限量設(shè)定：初步設(shè)定在相對保留時間0.47、0.66、0.76、0.90～0.92、0.96 處的色譜峰面積與相對保留時間為1 的峰面積比值不得小于0.20、0.12、0.08、0.40、0.12。

圖3 甘肅標(biāo)準(zhǔn)數(shù)字指紋圖

3 小結(jié)

表6 甘草酸銨與甘草苷的質(zhì)量相關(guān)性

通過對實驗研究方法和《中國藥典》［3]的實驗方法學(xué)對照研究，對甘草酸與甘草苷的含量測定結(jié)果無顯著性差異，實驗研究方法可信。以甘草酸銨保留時間為對照，計算各色譜峰的相對保留時間，以相對保留時間為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作圖，在相對保留時間0.47、0.49、0.66、0.76、0.90～0.92、0.96、1 處有吸收峰，形成了甘草數(shù)字特征圖譜，反映了甘草主要成分的特征。以甘草酸銨為基準(zhǔn)物，其色譜峰面積與甘草中主要成分即相對保留時間0.47、0.66、0.76、0.90～0.92、0.96 處的色譜峰面積比值不得小于0.20、0.12、0.08、0.40、0.12。通過對甘草數(shù)字質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究所建立的數(shù)字標(biāo)準(zhǔn)，全信息的反映了甘草的主要成分，并通過限量比值對各成分的量進行了規(guī)定，為甘草總體質(zhì)量控制提供了新方法。

表7 甘草峰面積比值

表8 甘草中相關(guān)成分與甘草酸的限量比例