閆梅 潘瓏 葉建翔 陳佛蘭

惠州市第一婦幼保健院，廣東 惠州516007

1997 年Lo 等［1]在孕婦外周血中發(fā)現(xiàn)了胎兒來源的游離DNA 后，通過采集孕婦外周血，提取胎兒DNA，采用高通量測序技術，結合生物信息分析，使得胎兒患染色體非整倍體性疾病風險的無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測（noninvasiveprenatal testing，NIPT）技術應運而生。該方法具有無創(chuàng)取材，高靈敏度，準確率高的特點，與傳統(tǒng)的血清學篩查技術相比較，避免了部分病例因有創(chuàng)操作感染流產(chǎn)的風險。本研究對我院因無創(chuàng)高風險進行產(chǎn)前診斷的285例孕婦的檢測結果進行分析，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014 年1月至2019 年11月我院因無創(chuàng)基因檢測結果異常進行產(chǎn)前診斷的單胎妊娠孕婦285例，排除其本身染色體異常，年齡22～44 歲，平均（32±5.92）歲，孕周17～34 周，平均（20.3±3.25）周，均進行了羊膜腔穿刺術。

1.2 入選標準 納入標準：（1）無創(chuàng)產(chǎn)前篩查異常；（2）唐氏篩查高風險；（3）年齡大于35 歲；（4）曾生育過染色體異常患兒；（5）配偶一方有染色體結構異常者；（6）超聲軟指標異常。排除標準：（1）具有先兆流產(chǎn)史；（2）術前兩次測量體溫高于37.2℃；（3）有出血傾向，血小板＜70×109，凝血功能有異常者；（4）有盆腔或?qū)m腔感染征象者。

1.3 方法 對無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測提示染色體異常的285例孕婦同時進行羊水染色體核型分析及染色體微陣列分析。

1.3.1 無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢查。無菌采集孕婦靜脈血8～10ml EDTA 抗凝，分離血漿，提取胎兒游離DNA，通過末端修復、連接接頭、PCR 擴增及純化構建待測文庫，使用新一代IonTorre nt 測序平臺測序后收集每個樣本獲得DNA 序列信息，比對人類基因組參考序列，得出每個樣本的Z-score 值（Z 值的參考值為-3.0～3.0），來判斷胎兒患染色體非整倍疾病風險。

1.3.2 羊水染色體核型分析。（1）培養(yǎng)瓶法：對送檢的羊水標本離心棄上清，將沉渣分別接種在兩瓶裝有4mL 培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶內(nèi)，37℃5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 天后，觀察細胞生長情況后換液，傳代，收獲制片，G顯帶。（2）核型分析：以ISCN2016 為核型分析標準，計數(shù)兩個獨立培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶中平均分布的20 個以上中期分裂象，分析5 個以上核型，當出現(xiàn)2 個或2 個以上細胞系時增加細胞計數(shù)，鑒定細胞嵌合情況。

1.3.3 染色體微陣列分析。送檢的羊水標本離心，取沉渣，提取DNA，通過PCR 擴增后，酶切，與Affymetrix-CytoScan 750K 芯片進行雜交、洗滌，芯片掃描，采用ChAs2.0 軟件，對片段長度≥100kb 且探針數(shù)≥50 的微缺失／微重復片段進行分析。

1.4 觀察指標 對285例無創(chuàng)產(chǎn)前篩查陽性的病例同時進行羊水染色體核型分析及染色體微陣列分析，對檢測出的陽性病例數(shù)進行統(tǒng)計與無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測陽性病例進行比對，觀察篩查結果的符合情況。

2 結果

2.1 NIPT 異常孕婦羊水染色體核型分析結果 NIPT檢測與羊水染色體核型分析21 三體陽性預測值為80.2%，18 三體陽性預測值為65.2%，13 三體陽性預測值為29.2%，性染色體異常陽性預測值為40.9%，其他染色體異常陽性預測值為2.9%。見表1。

表1 NIPT 異常孕婦羊水染色體核型分析結果

2.2 NIPT 檢查微重復微缺失與染色體微陣列分析結果 285例無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測異常結果中發(fā)現(xiàn)染色體缺失及重復孕產(chǎn)婦29例，通過微陣列分子核型分析技術檢測發(fā)現(xiàn)6例染色體異常，陽性預測值20.7%（6/29），其中5例為致病性的拷貝數(shù)變異（CNV），1例意義不明CNV。見表2。

表2 NIPT檢查微重復微缺失與染色體微陣列分析結果比對

3 討論

根據(jù)《中國出生缺陷防治報告（2012）》［2]統(tǒng)計，我國每年新增出生缺陷兒約90 萬例，發(fā)病率5.6%，染色體疾病是出生缺陷的主要原因，據(jù)報道，染色體異常在死產(chǎn)病例中發(fā)病率占5%～13%［3]，在早期胚胎流產(chǎn)的比例高達50%～60%［4]，目前尚無法對染色體病進行特異性治療，因此對孕產(chǎn)婦進行產(chǎn)前篩查、產(chǎn)前診斷是降低出生缺陷的重要手段。

隨著高通量測序技術的開發(fā)，基于高風險人群的無創(chuàng)產(chǎn)前篩查技術應用逐漸增多，但對普通人群的應用報道較少［5]。本院對大于35 歲對產(chǎn)前診斷有抵觸的高齡孕婦、部分唐氏篩查高風險、唐氏篩查臨界風險、部分超聲軟指標異常及其他不適合進行有創(chuàng)產(chǎn)前診斷的孕婦，常規(guī)建議無創(chuàng)產(chǎn)前篩查，該技術不僅在染色體非整倍體的篩查中具有明顯優(yōu)勢，同時隨著深度測序的應用及NIPT-PLUS 的開展，一些微缺失微重復檢測也應用于臨床。既往研究顯示［6-7]，NIPT 產(chǎn)前篩查21、18 和13 三體、性染色體診斷符合率較高，與本研究結果基本一致。孟繁杰等［8]研究顯示，NIPT 可以有效提高性染色體異常的檢出率，Yao 等［9]研究顯示，基于大規(guī)模平行測序的NIPT，在臨床應用中檢測性染色體異常是可行的。隨著測序深度的不斷提高，在達到100KB分辨率后，無創(chuàng)產(chǎn)前篩查技術可以發(fā)現(xiàn)額外的孕中期染色體核型不能發(fā)現(xiàn)的微小病變［10]，尤其對微缺失微重復的風險預測，但是靈敏度和特異性不高。本研究通過對NIPT 提示微缺失微重復的29例孕婦進行染色體微陣列分析檢測中發(fā)現(xiàn)6例（20.7%）異常病例，其中5例為致病性的CNV，一例為臨床意義不明的CNV，提示可能為家族性變異，與既往研究［11，12]不一致?？赡芘c研究樣本、孕婦血漿中胎兒游離DNA 含量，片段大小，測序深度，檢測及計算方法不同及NIPT 技術在整個實驗過程中人員、儀器、試劑、環(huán)境等質(zhì)量控制原因有關。