張秀堯, 蔡欣欣, 張曉藝, 李瑞芬

(溫州市疾病預(yù)防控制中心, 浙江 溫州 325001)

圖 1 百草枯和敵草快的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structures of paraquat (PQ) and diquat (DQ)

百草枯(paraquat, PQ)和敵草快(diquat, DQ)為世界上產(chǎn)量第二和第三的滅生型除草劑(化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1),二者常配伍使用。百草枯對(duì)人類的毒性極大,中毒時(shí)病變主要發(fā)生于肺部,稱為百草枯肺。百草枯可使患者肺細(xì)胞纖維化,氣體交換嚴(yán)重受損,致使患者血液和組織缺氧而最終導(dǎo)致死亡[1-4]。百草枯的中毒多因自殺吞服引起,2016年7月1日起,我國(guó)明令禁止百草枯水劑在國(guó)內(nèi)使用和出售,此后敵草快的銷量逐漸上升,敵草快中毒的患者也隨之增多。敵草快的生產(chǎn)成本較百草枯高,有少數(shù)商家為了牟利,將百草枯改名為“敵草快”或?qū)俨菘輷饺霐巢菘熘谐鍪?。敵草快屬于中等毒性除草?毒理作用與百草枯相似,但毒性小于百草枯,也可引起死亡[5-7]。百草枯和敵草快中毒病人目前無(wú)特效治療藥,中毒病死率高,對(duì)血漿和尿液中百草枯和敵草快濃度的同時(shí)監(jiān)測(cè),可以為臨床早期診斷和預(yù)后提供有價(jià)值的信息。

血漿和尿液中百草枯和敵草快的主要檢測(cè)方法有紫外分光光度法[8]、液相色譜法[9-10]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[11-13],其中液相色譜-質(zhì)譜法是檢測(cè)百草枯和敵草快最常用方法,然而百草枯和敵草快均為強(qiáng)極性水溶性化合物,在反相色譜柱上難以保留。在流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑,如七氟丁酸(HFBA),有助于反相色譜柱保留PQ和DQ[11,13],但離子對(duì)試劑有離子抑制作用,會(huì)降低質(zhì)譜檢測(cè)的靈敏度,同時(shí)還會(huì)給質(zhì)譜系統(tǒng)增加額外的污染,也有采用親水色譜(HILIC)-質(zhì)譜法分離血漿和尿液中PQ和DQ[12,14-17],但流動(dòng)相中需加入高濃度的甲酸銨緩沖鹽,也會(huì)影響質(zhì)譜的響應(yīng)值,同時(shí)親水色譜法分離易受基質(zhì)成分影響,保留時(shí)間不穩(wěn)定。

離子色譜-質(zhì)譜法在環(huán)境和食品檢測(cè)中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛[18-20],近年來(lái)也開(kāi)始應(yīng)用于生物樣品的檢測(cè)[21,22],但多采用陰離子交換色譜與質(zhì)譜聯(lián)用。有關(guān)陽(yáng)離子交換色譜-三重四極桿質(zhì)譜法測(cè)定血漿和尿液中百草枯和敵草快的檢測(cè)方法鮮有文獻(xiàn)報(bào)道?？紤]到百草枯和敵草快在水溶液中以雙電荷聯(lián)吡啶離子狀態(tài)存在,更適合采用陽(yáng)離子交換色譜法分離,本文將血漿和尿液樣品的水稀釋液直接通過(guò)混合型聚合物反相吸附和弱陽(yáng)離子交換的固相萃取柱(Oasis WCX SPE)進(jìn)行凈化,處理液中待測(cè)化合物經(jīng)陽(yáng)離子交換色譜柱分離,三重四極桿質(zhì)譜法檢測(cè),穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)法定量,方法靈敏、準(zhǔn)確、精密。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

離子色譜系統(tǒng)由Dionex ICS-1100離子色譜儀、淋洗液發(fā)生器(RFC-30)、電解再生抑制器(CDRS 600)和自動(dòng)進(jìn)樣器(DV-AS)組成,由變色龍工作站(7.22版)控制(美國(guó)Thermo Scientific公司); QTRAP 6500三重四極桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜儀(美國(guó)AB SCIEX公司); 24孔N-EVAP氮吹儀(美國(guó)Organomation公司); Gradient A10 Mill-Q超純水器(法國(guó)Millipore公司)。

甲醇、甲酸和乙腈均為色譜級(jí)(德國(guó)Merck公司); Oasis WCX混合型聚合物反相吸附和弱陽(yáng)離子交換固相萃取柱(60 mg/3 mL,美國(guó)Waters公司),臨用時(shí)分別用各3.0 mL甲醇和水活化;百草枯二氯化物(純度為97.5%)和敵草快二溴化物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度為98.0%)(德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司),百草枯-d8二氯化物(純度為98.5%)和敵草快-d4二溴化物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度為98.7%) (加拿大CDN公司)。健康人血漿經(jīng)浙江省衛(wèi)生行政部門審批,由溫州市中心血站提供,尿液由健康志愿者提供。

用水溶解標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)并稀釋成1.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,于-20 ℃保存。臨用時(shí)再用水稀釋成混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,其中百草枯和敵草快的質(zhì)量濃度分別為2.0 μg/mL和1.0 μg/mL;用水稀釋制成混合內(nèi)標(biāo)工作溶液,其中百草枯-d8和敵草快-d4的質(zhì)量濃度分別為0.20 μg/mL和0.10 μg/mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1樣品前處理

吸取100 μL血漿或尿液,置于2 mL Eppendrof管中,加入10 μL混合內(nèi)標(biāo)工作溶液,混勻,放置30 min,再加入900 μL水,混勻,以1.0 mL/min的流速上樣于Oasis WCX SPE柱,分別用3.0 mL水和甲醇淋洗,再用2.0 mL含2%(v/v)甲酸的88%(v/v)乙腈水溶液洗脫,洗脫流速為1.0 mL/min,洗脫液收集于5 mL Eppendorf管中,于50 ℃氮?dú)獯蹈?加入1.0 mL水,旋渦溶解,溶解液轉(zhuǎn)移入0.5 mL帶濾頭自動(dòng)進(jìn)樣瓶中,待測(cè)。

1.2.2色譜條件

分析柱為Ionpac CS 18型色譜柱(250 mm×2 mm, 6.0 μm),保護(hù)柱為CG18(50 mm×2 mm, 7.0 μm), CDRS 600陽(yáng)離子抑制器(2 mm,外加水模式),甲磺酸(MSA)淋洗液由RFC-30在線自動(dòng)產(chǎn)生。梯度淋洗程序:0～4.0 min, 30 mmol/L MSA; 4.0～7.0 min, 30 mmol/L MSA～60 mmol/L MSA; 7.0～11.0 min, 60 mmol/L MSA; 11.0～11.1 min, 60 mmol/L MSA～30 mmol/L MSA; 11.1～15.0 min, 30 mmol/L MSA。淋洗液流速為0.30 mL/min;柱溫為45 ℃;通過(guò)三通裝置在抑制器流出液中泵入3%(v/v)甲酸乙腈溶液,流速為0.30 mL/min,進(jìn)樣體積為10 μL。

1.2.3質(zhì)譜條件

電噴霧電離(ESI)源,正離子掃描方式,多離子監(jiān)測(cè)(MRM)模式檢測(cè)。離子化電壓(IS): 4 500 V,離子源溫度(TEM): 600 ℃,氣簾氣(CUR)壓力:277 kPa,噴霧氣(GS1)壓力:277 kPa,輔助加熱氣壓力(GS2): 414 kPa,碰撞器(CAD)壓力強(qiáng)度:Medium;優(yōu)化后的各待測(cè)物的母離子、子離子、去簇電壓和碰撞能量等參數(shù)見(jiàn)表1。

表 1 百草枯、敵草快及同位素內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)

* Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件考察

2.1.1質(zhì)譜條件優(yōu)化

圖 2 百草枯和敵草快前體離子的質(zhì)譜圖Fig. 2 Mass spectra of precursor ions of paraquat and diquat

圖 3 百草枯和敵草快及同位素內(nèi)標(biāo)物的子離子質(zhì)譜圖Fig. 3 Mass spectra of product ions of paraquat, paraquat-d8, diquat and diquat-d4

2.1.2離子色譜條件優(yōu)化

百草枯和敵草快屬季銨鹽化合物,極性大,反相色譜柱難以保留,有文獻(xiàn)采用離子對(duì)反相色譜法[11,13,24]和親水作用色譜法[14-17,23]分離百草枯和敵草快,也有使用基于離子液體機(jī)理的Trinity P1[25]和Trinity Q1色譜柱來(lái)分離[26]。百草枯和敵草快極易被玻璃和不銹鋼等材料吸附,(超)高效液相色譜儀的管路和色譜柱大都是不銹鋼材質(zhì),同時(shí)硅膠基色譜柱上殘留的硅羥基對(duì)帶正電荷的PQ和DQ會(huì)有二級(jí)吸附作用,表現(xiàn)為較寬且拖尾的色譜峰,為了減少吸附,往往在流動(dòng)相中加入較高濃度的甲酸銨或離子對(duì)試劑,而高濃度的緩沖鹽和離子對(duì)試劑對(duì)質(zhì)譜信號(hào)有抑制作用,且會(huì)對(duì)質(zhì)譜系統(tǒng)產(chǎn)生不利影響。

離子色譜儀的管路為全聚醚醚酮(PEEK)材料,不會(huì)非特異吸附PQ和DQ, IonPac CS 18型色譜柱為中等容量羧酸型弱陽(yáng)離子交換聚合物基的色譜柱,特別適合PQ和DQ的分離。采用淋洗液發(fā)生器產(chǎn)生的甲基磺酸作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫分離,PQ和DQ在Ionpac CS 18色譜柱上能很好保留。PQ和DQ在化學(xué)結(jié)構(gòu)上屬于同系物,只能實(shí)現(xiàn)部分分離,采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式進(jìn)行檢測(cè)時(shí),只要二者在質(zhì)譜通道上沒(méi)有相互干擾,即使只有部分分離也不影響定量分析，但PQ和DQ的相對(duì)分子質(zhì)量只相差2,不確定在質(zhì)譜通道上是否有相互干擾。因此本實(shí)驗(yàn)首先進(jìn)樣PQ,然后在DQ質(zhì)譜通道上沒(méi)有觀察到色譜峰，再進(jìn)樣DQ,在PQ質(zhì)譜通道上也沒(méi)有觀察到色譜峰,說(shuō)明它們不存在相互干擾。色譜柱流出液經(jīng)陽(yáng)離子抑制器抑制,去除了流動(dòng)相中甲基磺酸根離子等陰離子后生成純水,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),純水體系進(jìn)入質(zhì)譜離子源不利于PQ和DQ的離子化。有文獻(xiàn)[27]報(bào)道,利用高壓泵以一定的比例泵入乙腈、甲醇等有機(jī)溶劑通過(guò)三通裝置與抑制器流出液匯合后再進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定,可以改善待測(cè)物的電離效果,從而使質(zhì)譜信號(hào)有數(shù)倍增加?？紤]到如果泵入甲醇,與水混合易產(chǎn)生氣泡,且壓力較高,而陽(yáng)離子抑制器中膜的耐壓為692 kPa,而乙腈與水混合后壓力較低,因此選擇泵入乙腈,觀察到PQ和DQ的響應(yīng)值有所增高。實(shí)驗(yàn)比較了以0.10、0.20和0.30 mL/min的流速泵入乙腈時(shí)的質(zhì)譜響應(yīng)值,結(jié)果表明,泵入的流速≥0.20 mL/min時(shí),PQ和DQ質(zhì)譜響應(yīng)值最高,與不泵入乙腈相比,響應(yīng)值有1～2倍提高。但僅泵入乙腈,PQ和DQ在質(zhì)譜上有殘留,使得基線抬高,這可能是離子源上電噴霧針為金屬材料,其吸附PQ和DQ,而引起的殘留效應(yīng)。在乙腈中加入甲酸可以減少殘留效應(yīng),實(shí)驗(yàn)選用含3%(v/v)甲酸的乙腈溶液作為柱后泵入溶劑,流速為0.30 mL/min時(shí),可完全消除殘留效應(yīng)。加標(biāo)血漿樣品中百草枯(1.0 μg/L)和敵草快(0.5 μg/L)的色譜圖見(jiàn)圖4。

圖 4 空白和加標(biāo)血漿樣品中百草枯和敵草快的色譜圖Fig. 4 Chromatograms of paraquat and diquat in blank and spiked plasma samples

2.1.3前處理?xiàng)l件優(yōu)化

血漿和尿液中PQ和DQ的提取和凈化方法有很多,包括乙腈蛋白沉淀法[14-15]、甲醇蛋白沉淀法[16]、液液萃取法(LLE)[28]和固相萃取法(SPE)[13,17,24]等。蛋白沉淀法凈化效果不佳,基質(zhì)效應(yīng)(ME)比較嚴(yán)重;LLE回收率不高,操作煩瑣;基于強(qiáng)(弱)陽(yáng)離子交換機(jī)理[17,24]和反相色譜機(jī)理[13]的固相萃取法已成功用于PQ和DQ的提取和凈化?？紤]到基質(zhì)效應(yīng)和回收率等綜合因素,本法采用混合型聚合物反相吸附和弱陽(yáng)離子交換的固相萃取柱,用于樣品的前處理。

考慮到PQ和DQ中毒大多數(shù)是由自殺引起的,血漿和尿液中PQ和DQ濃度往往較高,故將洗脫液氮?dú)獯蹈珊笕苡?.0 mL水中,稀釋樣品10倍。取來(lái)自6份不同個(gè)體的血漿和尿液樣品,經(jīng)樣品前處理后進(jìn)樣分析,結(jié)果顯示內(nèi)源性物質(zhì)均不干擾待測(cè)物的測(cè)定。因?yàn)镻Q和DQ易被玻璃材料吸附,故操作全程應(yīng)避免接觸玻璃器皿。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1線性范圍、檢出限和定量限

對(duì)系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和混合內(nèi)標(biāo)工作溶液進(jìn)行分析,其中百草枯的質(zhì)量濃度分別為1.0、3.0、10、20、100和150 μg/L,敵草快的質(zhì)量濃度分別為0.5、1.5、5.0、10、50和75 μg/L,百草枯-d8和敵草快-d4的質(zhì)量濃度分別為2.0 μg/L和1.0 μg/L,采用MultiQuant定量軟件處理,以定量離子對(duì)與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值(Y)對(duì)物質(zhì)的質(zhì)量濃度(X, μg/L)進(jìn)行線性回歸(權(quán)重取1/X)。結(jié)果表明,百草枯和敵草快分別在1.0～150 μg/L和0.5～75 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,回歸方程分別為Y=0.508X+0.029 3和Y=0.365X+0.016 6,相關(guān)系數(shù)均>0.999。

在空白血漿和尿液樣品中分別加入系列低濃度的待測(cè)物進(jìn)行測(cè)定,以兩對(duì)分子離子對(duì)的信噪比均≥3和≥10時(shí)的樣品濃度作為檢出限(LOD)和定量限(LOQ),結(jié)果測(cè)得血漿和尿液中百草枯和敵草快的檢出限分別為0.3 μg/L和0.2 μg/L,定量限分別為1.0 μg/L和0.5 μg/L,能夠滿足中毒檢測(cè)的要求。

表 3 血漿和尿液中PQ和DQ的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率(n=5)

2.2.2加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)

按歐洲藥品管理局(EMEA)的要求[29]在定量限、3倍定量限(low QC)、中等濃度(medium QC)和高濃度(high QC)進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn),在空白血漿和尿液中加標(biāo)使百草枯和敵草快的質(zhì)量濃度分別為1.0、3.0、20、120 μg/L和0.5、1.5、10、60 μg/L,每個(gè)水平平行測(cè)定6次,血漿中百草枯和敵草快的平均加標(biāo)回收率分別為93.5%～117%和91.7%～112%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為3.4%～16.7%和2.8%～13.2%;尿液中百草枯和敵草快的平均加標(biāo)回收率分別為90.0%～118%和99.2%～116%, RSD分別為5.6%～14.9%和2.4%～17.3%(見(jiàn)表2)。結(jié)果符合EMEA的要求。

2.2.3基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

在空白血漿和尿液的前處理液中加入PQ(1.0、3.0、20、120 μg/L)和DQ(0.5、1.5、10、60 μg/L)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液制成基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液,測(cè)定PQ和DQ的峰面積(A),再測(cè)定相同水平溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液中PQ和DQ的峰面積(B),平行測(cè)定5次。根據(jù)公式ME=A/B×100%[30]計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。

提取回收率為空白血漿和尿液加標(biāo)樣品中PQ和DQ的峰面積(C)與相同水平基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中PQ和DQ的峰面積之比,公式為提取回收率=C/A×100%[30]。PQ和DQ的評(píng)估水平分別為1.0、3.0、20、120 μg/L和0.5、1.5、10、60 μg/L,平行試驗(yàn)5次(見(jiàn)表3)。結(jié)果顯示,PQ和DQ在血漿和尿液中存在一定的基質(zhì)效應(yīng),可以通過(guò)穩(wěn)定同位素稀釋法進(jìn)行定量,校正樣品的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收的不完全。

表 2 空白血漿和尿液樣品中PQ和DQ的加標(biāo)回收率

2.2.4穩(wěn)定性試驗(yàn)

各取3份加標(biāo)血漿和尿液樣品,其中百草枯和敵草快質(zhì)量濃度為10 μg/L和5 μg/L,將樣品處理液在自動(dòng)進(jìn)樣器上室溫放置72 h,每間隔24 h測(cè)定1次,與標(biāo)稱值比較,結(jié)果顯示百草枯和敵草快的相對(duì)偏差均在±10%之間。

取低水平(百草枯3.0 μg/L和敵草快1.5 μg/L)和高水平(百草枯130 μg/L和敵草快65 μg/L)的血漿和尿液樣品,儲(chǔ)藏于具塞聚丙烯離心管中,分別在經(jīng)過(guò)3個(gè)冷凍(-20 ℃)與室溫融化過(guò)程、冷藏(2～6 ℃)保存5 d和-20 ℃冷凍保存1個(gè)月后再測(cè)定,與標(biāo)稱值比較,測(cè)得百草枯和敵草快的相對(duì)偏差均在15%以內(nèi),符合要求。

3 結(jié)論

本文建立了測(cè)定血漿和尿液中百草枯和敵草快的離子色譜-三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)方法,通過(guò)對(duì)精密度、準(zhǔn)確度和靈敏度等方法學(xué)考察,驗(yàn)證了方法的有效性,結(jié)果表明該方法可用于百草枯和敵草快的中毒檢測(cè)。