徐小民, 張京順, 蔡增軒, 孟 真, 黃百芬, 陳 苘

(浙江省疾病預(yù)防控制中心, 浙江 杭州 310051)

野生毒蘑菇是我國食源性疾病的主要致病因子,且一半以上的死亡病例來自毒蘑菇中毒[1]。毒蘑菇中毒的臨床癥狀包括胃腸炎、精神神經(jīng)紊亂、溶血、光敏性皮炎、橫紋肌溶解癥、急性肝衰竭和腎衰竭等[2]。2019年我國毒蘑菇中毒的總體死亡率為2.86%,而肝毒性毒蘑菇中毒的死亡率為20%[1]。導(dǎo)致肝毒性中毒的毒蘑菇主要包括鵝膏菌、褐鱗傘和盔孢傘等3類[3,4],毒素主要為鵝膏毒肽(amanitin)、鬼筆毒肽和毒傘肽,其中,鬼筆毒肽不經(jīng)消化道吸收,且只存在于鵝膏菌中。毒傘肽目前還沒有市售標(biāo)準(zhǔn)品,兩者都不適合作為相關(guān)中毒事件病因鑒定的標(biāo)志物。鵝膏毒肽在3類毒蘑菇中均有發(fā)現(xiàn),主要包括α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽和γ-鵝膏毒肽3種,含量和毒性最高的主要為α-鵝膏毒肽和β-鵝膏毒肽[4-7],其中α-鵝膏毒肽對人的半數(shù)致死量(LD50)為0.1 mg/kg[4]。

鵝膏毒肽類毒素中毒潛伏期較長,一般6～24 h后才出現(xiàn)普通胃腸炎癥狀[4,8],患者容易被迷惑而延誤治療。研究表明,含鵝膏毒肽的毒蘑菇中毒最佳治療時間在36～48 h之前[9],而肝毒性癥狀(轉(zhuǎn)氨酶等生化指標(biāo)的異常升高)出現(xiàn)需要中毒2～3 d后[4,8],此時再對癥治療,死亡率較高。要在轉(zhuǎn)氨酶等生化指標(biāo)升高前做到早診斷、早治療,有效降低死亡率,需要建立中毒標(biāo)志物的有效理化檢測方法。鵝膏毒肽在體內(nèi)會迅速代謝,中毒24 h后很難在血液中檢出,尿液中雖然仍能檢出,但濃度較低[10]。尿液中α-鵝膏毒肽比β-鵝膏毒肽穩(wěn)定,能被檢出的濃度更高，時間更久[10,11],更適合作為肝毒性毒蘑菇中毒病因鑒定的生物標(biāo)志物。

尿液中鵝膏毒肽的檢測主要包括CE[12]、LC-MS/MS[11,13-17]和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[9]。文獻(xiàn)報道的尿液中鵝膏毒肽檢測方法中,CE的檢出限(LOD)為1.5 μg/L[12], LC-MS/MS受基質(zhì)抑制效應(yīng)限制,LOD在0.22～1 μg/L之間[11,13-17],采用這兩種文獻(xiàn)方法,在轉(zhuǎn)氨酶等生化指標(biāo)異常之前的48～72 h內(nèi),僅少部分中毒患者尿液能檢出毒素,72 h后基本檢不出毒素。文獻(xiàn)[9]報道的ELISA檢測尿液中鵝膏毒肽的LOD可以達(dá)到0.08 μg/L,但存在假陽性結(jié)果的可能,目前還沒有能達(dá)到這個LOD水平的質(zhì)譜確證方法。

本研究擬基于在線固相萃取(SPE)的精準(zhǔn)凈化功能,探索尿液中α-鵝膏毒肽質(zhì)譜檢測時基質(zhì)抑制效應(yīng)消除方法,建立了尿液中痕量毒素的在線SPE-LC-MS/MS定性定量檢測技術(shù),以解決中毒患者生化指標(biāo)異常前72 h(甚至96 h)內(nèi)毒素鑒定難的問題,為中毒患者的早診斷、早治療,有效降低死亡率提供檢測技術(shù)支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LCMS-8060在線固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(日本島津公司);超純水裝置(美國Millipore公司); Sartorius 1-14高速離心機(jī)(德國Sartorius公司)、HC-3018高速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司); WH-861旋渦混合器(江蘇太倉華利達(dá)實驗設(shè)備有限公司)。

甲醇和乙腈為色譜純(美國Tedia公司);甲酸為分析純(美國ROE Scientific公司);α-鵝膏毒肽標(biāo)準(zhǔn)品(純度>95%,美國Enzo公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取α-鵝膏毒肽標(biāo)準(zhǔn)品,置于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,配制質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于-20 ℃避光保存;用水逐級稀釋并配制質(zhì)量濃度為1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)使用液;移取適量標(biāo)準(zhǔn)使用液,用水配制質(zhì)量濃度為0.000 1～0.05 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 分析條件

在線SPE凈化:ODS微柱(5 mm×2.1 mm, 5 μm,日本島津公司);柱溫:35 ℃;流動相:(A)0.015%(v/v)甲酸水溶液和(B)甲醇;流速:0.5 mL/min。梯度洗脫程序:0～0.5 min, 5%B; 0.5～2.0 min, 5%B～30%B; 2.0～3.0 min, 30%B; 3.0～3.5 min, 30%B～90%B; 3.5～5.0 min, 90%B; 5.0～5.5 min, 90%B～5%B; 5.5～14.0 min, 5%B。進(jìn)樣量:10.0 μL。

LC分離:XBridgeTMBEH C18柱(150 mm×3.0 mm, 2.5 μm,美國Waters公司);柱溫:35 ℃;流動相:(A)水和(B)甲醇;流速:0.4 mL/min。梯度洗脫程序:0～4.0 min, 5%B; 4.0～6.5 min, 5%B～65%B; 6.5～10.0 min, 65%B; 10.0～10.5 min, 65%B～90%B; 10.5～12.0 min, 90%B; 12.0～12.5 min, 90%B～5%B; 12.5～14.0 min, 5%B。

六通閥流路切換見圖1。狀態(tài)1：0～2.05 min,上樣后在線SPE柱凈化,流路切換到廢液槽;LC柱平衡。狀態(tài)2：2.05～2.45 min,被測物洗脫并收集到200 μL定量環(huán)中;LC柱平衡。狀態(tài)3：2.45 min之后,定量環(huán)中的洗脫液注入LC柱,開始LC-MS/MS分析;SPE柱沖洗并平衡等待下一個進(jìn)樣周期。

圖 1 在線SPE-LC-MS/MS系統(tǒng)流路切換示意圖Fig. 1 Diagram of the flow path switching in the online SPE-LC-MS/MS system

MS/MS檢測:離子源為電噴霧電離源,負(fù)離子模式(ESI-);離子源接口電壓為4.5 kV;霧化氣為氮氣,3.0 L/min;干燥氣為氮氣,10 L/min;加熱氣為空氣,10 L/min;碰撞氣為氬氣;脫溶劑管溫度為250 ℃;加熱塊溫度為400 ℃;接口溫度為250 ℃;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式,m/z917.4>205.1(定量離子對),m/z917.4>257.1(定性離子對),碰撞能量均為55 eV。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確吸取0.40 mL尿液,置于2 mL聚丙烯離心管中,加入0.02 mL 10%甲酸水溶液、0.2 mL甲醇和1.0 mL乙腈,渦旋混勻1 min,以14 000 r/min離心2 min,上清液轉(zhuǎn)移至10 mL聚丙烯離心管中,加入2.0 mL二氯甲烷,渦旋混勻0.1 min,以10 000 r/min離心2 min,上層水相供檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件的優(yōu)化

離線SPE柱多為一次性的,尿液可以直接上樣[11,14-16]。在線SPE柱需要多次重復(fù)使用,尿液直接上樣時,尿液中存在的蛋白質(zhì)和無機(jī)鹽可能沉積在柱頭,多次進(jìn)樣后會使柱壓升高,甚至堵塞色譜柱。本文采用乙腈沉淀蛋白質(zhì),實際樣品分析時發(fā)現(xiàn),部分尿液中鹽含量較高,采用75%(v/v)乙腈-水沉淀蛋白質(zhì)時,底部會出現(xiàn)約50 μL的水層,因鵝膏毒肽水溶性較強(qiáng),造成分離失敗。加入甲醇(0.2 mL)可以增加無機(jī)鹽的溶解性,即使對于含鹽量較高的尿液,提取時也不會出現(xiàn)少量的水層,使得蛋白質(zhì)能沉淀完全,保證提取效率和結(jié)果的穩(wěn)定性。采用乙腈-甲醇(5∶1, v/v)沉淀蛋白質(zhì)和無機(jī)鹽(有機(jī)相比例為75%(v/v)),可以保證在線SPE柱良好的分離效果,并提高使用壽命。

α-鵝膏毒肽極性強(qiáng),易溶于水,而蛋白質(zhì)沉淀后的提取液含有75%(v/v)的有機(jī)溶劑,高比例有機(jī)相進(jìn)樣時會導(dǎo)致被測物色譜峰展寬。文獻(xiàn)[13-16]多采用氮吹等方法去除有機(jī)溶劑,耗時較長,不利于快速應(yīng)對相關(guān)的中毒事件。反相液液微萃取技術(shù)可以從高比例有機(jī)相中分離少量的水相,以達(dá)到快速去除有機(jī)溶劑、濃縮水溶性被測物的目的[18,19]。傳統(tǒng)液液萃取主要利用無機(jī)鹽來分離水相和有機(jī)相,反相液液萃取的目的是要得到含被測物的水相,用于色譜分離,因此無機(jī)鹽不適合作為兩相分離的促進(jìn)劑。疏水性強(qiáng)的氯仿或二氯甲烷被證明是反相萃取時有效的兩相分離促進(jìn)劑。本文采用毒性較低的二氯甲烷分離蛋白質(zhì)沉淀后的尿液和有機(jī)相(乙腈和甲醇)。在4份提取液中分別加入1.0、1.5、2.0和2.5 mL二氯甲烷,結(jié)果表明,當(dāng)二氯甲烷加入量≥2.0 mL時,能定量分離提取液中的水相和有機(jī)相,水相中α-鵝膏毒肽的提取效率大于95%。

沉淀蛋白質(zhì)和反相液液微萃取去除有機(jī)相和脂溶性基質(zhì)的簡單操作,可以作為α-鵝膏毒肽在線SPE-LC-MS/MS法檢測的快速且有效前處理方法。在實際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn),尿液在線SPE柱400次進(jìn)樣后,柱效未見明顯改變。

2.2 在線SPE分離條件選擇

在線SPE分離除了實現(xiàn)高效的凈化,還要保證洗脫液與后續(xù)LC-MS/MS進(jìn)樣分離的兼容性,關(guān)鍵是要保證較窄的SPE洗脫色譜峰,以滿足后續(xù)200 μL定量環(huán)的收集容量，以及需要保證洗脫液中較低比例的有機(jī)相,以防止后續(xù)液相色譜分離時的峰展寬。實驗中,將圖1中色譜流動相流速設(shè)為0 mL/min, SPE模塊按正常分析,將廢液端直接連接到質(zhì)譜儀,以監(jiān)測在線SPE的分離效果。改變在線SPE洗脫梯度程序中2.0～3.0 min時甲醇的比例,使其分別為30%、35%和40%,結(jié)果見圖2。按流速0.5 mL/min計算,甲醇比例為30%時,收集2.05～2.45 min的洗脫液正好滿足定量環(huán)的收集容量,且此時有機(jī)相比例最低。

圖 2 在線SPE洗脫梯度程序中2.0～3.0 min時流動相中 甲醇體積分?jǐn)?shù)分別為30%、35%和40%時α-鵝膏毒肽的洗脫曲線 Fig. 2 Elution curves of α-amanitin with volume fractions of methanol of 30%, 35%, and 40% at 2.0-3.0 min in the online SPE elution gradient procedure

2.3 在線SPE與LC-MS/MS切換

在線SPE與LC-MS/MS的切換分為非定量環(huán)和定量環(huán)兩種模式[20],非定量環(huán)的模式儀器配置簡單,除雜后的SPE流路可以通過六通閥直接切換到LC-MS/MS分析流路,但SPE柱和LC柱間的壓力差會影響分離的重復(fù)性。本文采用定量環(huán)模式,以定量環(huán)為接口,通過快速的閥切換,SPE和LC-MS/MS兩個模塊互相獨立,無論是流動相還是壓力,均不會互相干擾,保證了系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

2.4 在線與離線SPE凈化效果的比較

根據(jù)在線SPE優(yōu)化后的洗脫曲線(見圖2, 30%甲醇),本文只收集2.05～2.45 min的洗脫液進(jìn)入200 μL定量環(huán),之前的水溶性基質(zhì)和之后的脂溶性基質(zhì)均切換至廢液槽,從而實現(xiàn)精準(zhǔn)凈化的目的。在線SPE凈化后,空白尿液和陽性尿液(0.53 μg/L)中α-鵝膏毒肽的色譜圖見圖3,基本未見干擾峰,且基線控制在較低水平。

根據(jù)文獻(xiàn)[16]報道的離線SPE柱(HLB柱,60 mg/3 mL,美國Waters公司)凈化方法操作,結(jié)果見圖3c,其響應(yīng)值低于在線凈化的50%,且離線凈化后的基線噪聲太高,在0.5 μg/L這個水平很難分辨是否為α-鵝膏毒肽陽性。

圖 3 在線和離線SPE凈化后尿液中α-鵝膏毒肽的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of α-amanitin cleaned by online SPE and offline SPE a. blank matrix; b. positive sample (0.53 μg/L); c. positive sample (0.53 μg/L).

2.5 質(zhì)譜檢測

如圖4所示,α-鵝膏毒肽在ESI+模式下,除了m/z為919.4的[M+H]+峰,還存在高比例的m/z為941.4的[M+Na]+峰和m/z為957.4的[M+K]+峰,影響了質(zhì)譜檢測的靈敏度和穩(wěn)定性。采用ESI-檢測時,響應(yīng)較高的為m/z為917.4的[M-H]-峰,其他峰的響應(yīng)均較低。為實現(xiàn)尿液中α-鵝膏毒肽的高靈敏分析,本文采用ESI-模式,選擇917.4>205.1為定量離子對,917.4>257.1為定性離子對,二級質(zhì)譜碎裂途徑和特征離子碎片見前期研究[21]。

圖 4 α-鵝膏毒肽的全掃描質(zhì)譜圖和二級質(zhì)譜圖Fig. 4 Full scan mass and MS/MS spectra of α-amanitin

2.6 基質(zhì)效應(yīng)的考察

根據(jù)美國食品藥品管理局(FDA)有關(guān)生物分析方法驗證指南[22],本文考察了α-鵝膏毒肽在2個水平下6種尿液空白基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng),空白基質(zhì)分別來自于正常男性和女性志愿者、非鵝膏毒肽類毒蘑菇中毒患者等,兩個水平為0.1 μg/L和50 μg/L,分別平行測定6次?；|(zhì)效應(yīng)=樣品基質(zhì)中α-鵝膏毒肽的峰面積/純?nèi)軇┲械姆迕娣e×100%,大于或小于100%分別表示基質(zhì)增強(qiáng)或基質(zhì)抑制效應(yīng)(見表1)。6種基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)平均值為88.7%～96.5%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)≤5.6%,采用本方法檢測,尿液中α-鵝膏毒肽只表現(xiàn)為輕微的基質(zhì)抑制效應(yīng)。因此,可以直接采用純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液來校正樣品中α-鵝膏毒肽的含量,簡化操作流程。

表 1 α-鵝膏毒肽在6種空白尿液中的基質(zhì)效應(yīng)(n=6)

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1線性范圍、檢出限和定量限

尿液中α-鵝膏毒肽在0.1～50 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r2)為0.998 3。以3倍和10倍信噪比對應(yīng)的含量定義為LOD和LOQ,結(jié)果分別為0.03 μg/L和0.1 μg/L。

2.7.2回收率

在空白尿液中添加3個水平(0.1、2和20 μg/L)的α-鵝膏毒肽,每個水平做6個平行試驗,考察方法的回收率。結(jié)果表明,3個水平的平均回收率分別為84.3%、90.8%、和91.7%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為7.2%、4.3%和3.8%。

2.7.3準(zhǔn)確度和精密度

采用空白基質(zhì)制備質(zhì)量濃度分別為0.1 μg/L(LOQ)、0.2 μg/L(2倍LOQ)、2.0 μg/L(標(biāo)準(zhǔn)曲線中間點)和20 μg/L(標(biāo)準(zhǔn)曲線高濃度點)的質(zhì)控樣品,分別測定日內(nèi)(n=6)和日間(連續(xù)3 d,n=3)準(zhǔn)確度和精密度,結(jié)果見表2。尿液中α-鵝膏毒肽的日內(nèi)準(zhǔn)確度為85.1%～96.0%,精密度≤7.8%;日間準(zhǔn)確度為82.9%～94.8%,精密度≤9.5%。

表 2 α-鵝膏毒肽的日內(nèi)和日間準(zhǔn)確度和精密度

圖 5 9名中毒患者尿液中α-鵝膏毒肽的含量(n=3)Fig. 5 Contents of α-amanitin in the urines of the nine poisoning patients (n=3)

2.8 實際樣品檢測

應(yīng)用本方法,開展了多次誤食毒蘑菇中毒事件的應(yīng)急處置,在單純胃腸炎或神經(jīng)中毒癥狀的患者(非肝毒性中毒)尿液中均未檢出α-鵝膏毒肽,說明方法具有很高的特異性。在9名肝毒性中毒癥狀的患者尿液中均檢出了α-鵝膏毒肽(見圖5),含量范圍為0.11～53.1 μg/L,采樣時間為中毒后19～92 h。對于毒蘑菇攝入量較高的中毒患者,中毒19 h后1名患者尿液中α-鵝膏毒肽含量為53.1 μg/L, 1名患者中毒51 h后的尿液中能檢出2.73 μg/L的α-鵝膏毒肽,另1名患者中毒92 h后的尿液中能檢出0.19 μg/L的α-鵝膏毒肽。而對于毒蘑菇攝入量較低的患者,中毒23 h后的尿液中α-鵝膏毒肽僅為0.53 μg/L。文獻(xiàn)[11,13-17]報道的常規(guī)LC-MS/MS方法尿液中α-鵝膏毒肽的LOD為0.22～1 μg/L,尿液中檢出毒素的時間窗口為中毒后72 h內(nèi)[23],本文建立的在線SPE-LC-MS/MS的LOD可以達(dá)到0.03 μg/L,在實際中毒事件病因鑒定方面更具有優(yōu)勢,不僅可以檢出中毒后92 h樣品中α-鵝膏毒肽,而且0.1 μg/L的LOQ使得本方法在痕量毒素水平就能直接給出定量結(jié)果,為毒素體內(nèi)劑量反應(yīng)關(guān)系研究提供了強(qiáng)有力的定量檢測技術(shù)支撐。

3 結(jié)論

本研究建立了在線SPE-LC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)檢測蘑菇中毒患者尿液中痕量α-鵝膏毒肽的分析方法。溶劑沉淀蛋白質(zhì)和反相液液微萃取去除有機(jī)相和脂溶性基質(zhì)的簡單操作,可以作為水溶性毒素在線SPE-LC-MS/MS檢測時快速且有效的配套前處理方法。與文獻(xiàn)方法相比,基于在線SPE精準(zhǔn)凈化技術(shù),可以將尿液中α-鵝膏毒肽檢測靈敏度提高10倍以上,解決了中毒時患者體內(nèi)痕量水平α-鵝膏毒肽的定性確證難題,并將部分患者α-鵝膏毒肽中毒實驗室鑒定的時間擴(kuò)展到90 h以上。痕量水平的定量檢測技術(shù),可以為中毒后迅速代謝的α-鵝膏毒肽在體內(nèi)的劑量反應(yīng)關(guān)系研究提供可靠的技術(shù)支撐。