邵 琳,王 玥,曲 晗,郝良玉,王洪利,田栢會,李志萍,李乾學,沈明浩,*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學,吉林長春 130000;2.軍事科學院軍事醫(yī)學研究院軍事獸醫(yī)研究所,吉林長春 130122;3.長春理工大學,吉林長春 130022)

沙門氏菌是引起食物中毒極為重要的食源性致病菌[1]。近些年,世界范圍內(nèi)的食品安全惡性事件頻繁發(fā)生,防不勝防[2-3]。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道,全球每年感染沙門氏菌的人數(shù)過萬[4]。據(jù)資料統(tǒng)計,每年由沙門氏菌造成的食物中毒事件占食物中毒事件總數(shù)的40%～60%[5],在我國,由沙門氏菌引起的食物中毒屢居首位[6]。沙門氏菌(Salmonella)隸屬于腸桿菌科[7],它是寄生于生物腸道內(nèi),生化反應和抗原構(gòu)造相似的革蘭氏陰性桿菌的統(tǒng)稱[8]。尤其以腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)為代表的病原菌在食品衛(wèi)生安全、疾病預防和環(huán)境監(jiān)測[9-11]等方面形成了巨大的威脅,對人體的健康也造成了很大危害。目前應用于沙門氏菌的檢測方法包括熒光PCR檢測[12]、生物傳感器檢測[13]、ELISA檢測[14]等,這些檢測方法存在靈敏度低、耗時長,不適用于現(xiàn)場的快速檢測等缺點,無法滿足實際應用需求。近年來,適配體技術(shù)已經(jīng)逐漸應用于食源性致病菌的檢測領(lǐng)域。

適配體(Aptamer)是通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(shù)(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)篩選得到的一段短的單鏈DNA或RNA[15]。近年來,適配體檢測技術(shù)在生化分析和食品安全等方面的應用得到了全面的發(fā)展。適配體幾乎可與每一個目標分子進行化學修飾,并且它能夠與相應的靶標分子例如金屬離子、有機小分子藥物、蛋白質(zhì)乃至整個細胞進行高親和力和強特異性的結(jié)合[16]。目前國內(nèi)外已成功篩選出了與食源性致病菌特異性結(jié)合的適配體,此項研究具有發(fā)展成快速檢測技術(shù)的潛力[17]。但所篩選出的適配體其特異性和親和力不好,并且與其配套的檢測設備檢測信號不夠靈敏,這對于實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測形成了一定的困難。對于沙門氏菌這種高威脅性的病原菌[18],迫切需要開發(fā)出一種簡易、快速、靈敏度高、低使用成本的檢測技術(shù)。

近些年,拉曼光譜技術(shù)迅猛發(fā)展,應用領(lǐng)域也越來越多[19]。拉曼光譜可以通過透明材質(zhì)容器對被檢測樣品進行定性分析[20];并且其譜峰與被檢測樣品濃度呈正比關(guān)系,因此拉曼光譜還可對被檢測樣品進行定量分析[21-22]。目前拉曼光譜應用于食品檢測方面的相關(guān)研究還相對較少。本研究將適配體篩選技術(shù)及表面增強拉曼光譜技術(shù)結(jié)合,可實現(xiàn)對腸炎沙門氏菌的快速、高效檢測,以期該方法在食品檢測領(lǐng)域得到更廣泛的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis,CICC:21482)、阪崎克羅諾桿菌(Enterobactersakazakii,CICC:21560)、福氏志賀氏菌(Shigellaflexneri,CICC:21534)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae,CICC:10870)、大腸埃希菌O157∶H7(EscherichiacoliEHEC O157∶H7,CICC:21530) 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection,CICC);PBS(Phosphate Buffered Solution) 美國HYclone公司；99.9999%硝酸銀(AgNO3) 德國Sigma-Aldrich(Taufkirchen)公司;LB液體培養(yǎng)基(LB Broth) 上海生工生物工程股份有限公司;PrimeSTAR? Max DNA Polymerase 日本TAKARA公司;Lambde核酸外切酶 美國New England Biolabs公司;去離子水(DNaseRNase-Free Deionized Water) 北京天根生化科技有限公司;豬肉肉糜(Pork minced Pork) 購買于當?shù)爻小?/p>

LabRAM HR Evolution拉曼光譜儀 HORIBA Xcientific;上海智城分析儀器制造有限公司；BSC-1300ⅡA2生物安全柜 蘇州凈化公司；ZXDP-A2080十段編程電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司；GXSI PCR儀 德國艾本德公司。

1.2 腸炎沙門氏菌特異性適配體whole-bacteria-SELEX篩選

1.2.1 構(gòu)建隨機文庫 構(gòu)建腸炎沙門氏菌隨機單鏈DNA文庫:

5′-GCGATCCAAGCTTCTTCAATT-N50-GATACT AGACTGCACATCT-3′;

上游引物:5′-GCGATCCAAGCTTCTTCA-3′;

下游引物:5′-AGATGTGCAGTCTAGTAT-3′。

(以上均由上海生工生物工程有限公司合成,下游引物5′端磷酸化)。

1.2.2 細菌培養(yǎng) 將本實驗室保存的腸炎沙門氏菌20 μL加入5 mL LB液體培養(yǎng)基中,放入搖床200 r/min,37 ℃培養(yǎng)12 h。將菌液用PBS洗3次,每次3500 r/min離心5 min,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 SELEX篩選腸炎沙門氏菌適配體

1.2.3.1 腸炎沙門氏菌與ssDNA隨機文庫的結(jié)合與分離 將合成的ssDNA隨機文庫120 μL金屬浴95 ℃ 15 min,立刻置于冰上15 min備用。將折疊后的ssDNA隨機文庫240 μL與1 mL腸炎沙門氏菌混合,室溫孵育2 h。將混合物3500 r/min洗滌5 min棄上清,用結(jié)合緩沖液洗3次,3500 r/min洗滌5 min。最后用200 μL去離子水溶解。將結(jié)合樣品金屬浴95 ℃ 15 min,立刻置于冰上15 min,12000 r/min離心5 min后收集上清,PCR擴增。剩余樣品-20 ℃保存[23]。

1.2.3.2 篩選后的ssDNA產(chǎn)物PCR擴增 以上一輪篩選所得的ssDNA產(chǎn)物為模板進行PCR擴增。PCR擴增體系為:篩選后的適配體模板3 μL、2×Taq PCR Master Mix酶25 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、去離子水21 μL,總體積為50 μL。PCR擴增條件為a.95 ℃ 5 min,b.95 ℃ 45 s,c.69 ℃ 45 s,d.72 ℃ 45 s,e.72 ℃ 5 min,f.4 ℃保存。擴增時,步驟b～d擴增25個循環(huán)。

1.2.3.3 各輪PCR擴增結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳鑒定 本實驗采用2%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。將PCR產(chǎn)物中加入45 μL 3 mol/L乙酸鈉、5 μL Dr.GenTLE Precipitation Carrier和1 mL的無水乙醇,放入-20 ℃冰箱中沉淀過夜。4 ℃,12000 r/min離心30 min,棄上清,用1 mL 70%乙醇重懸,12000 r/min離心15 min,棄上清,洗滌2次,晾干備用。取100 μL去離子水將核酸溶解,加入12 μL 10×λ酶切反應Buffer與8 μL λ外切酶,37 ℃ 40 min,75 ℃ 10 min。重復以上篩選至第九輪,從第十輪開始采用阪崎克羅諾桿菌、福氏志賀氏菌、肺炎克雷伯氏菌、大腸埃希菌O157∶H7進行扣除篩選至第十五輪。將PCR擴增第十五輪適配體篩選結(jié)果進行挑取單克隆測序。

1.3 ELISA評價適配體親和力

將腸炎沙門氏菌用PBS洗滌3次,每次3500 r/min,離心5 min棄上清,用15 mL ELSA包被緩沖液溶解稀釋細菌,每孔加入100 μL菌液,H行空白對照,4 ℃過夜。每孔用200 μL PBS洗滌3次。每個孔加5%胎牛血清200 μL,4 ℃封閉3 h,用0.5% PBST洗滌3次。將14條候選適配體分別稀釋為500 nmol/L,95 ℃ 15 min、迅速冰上15 min、室溫15 min折疊。每孔加入100 μL,37 ℃孵育2 h。再用200 μL 1×Binding Buffer洗滌3次,在每個孔里加100 μL鏈霉親和素標記辣根過氧化物酶37 ℃ 45 min,200 μL Binding Buffer洗3次,TMB顯色液每個孔加入100 μL,37 ℃箱孵育20 min,50 μL硫酸終止反應,使用酶標儀檢測A450處OD值,以A450處OD值表示適配體親和力的大小。

1.4 TEM樣品制備

腸炎沙門氏菌-Aptamer-AgNPs TEM樣品制備:分別將濃度為200、300、400、500 nmol/L的適配體與洗滌好的腸炎沙門氏菌均勻混合,室溫孵育1.5 h,3500 r/min離心5 min,棄上清,加入1 mL Binding Buffer緩沖液重懸,3500 r/min離心5 min,棄上清,重復此操作洗滌3次,加入新鮮配制的AgNO3溶液100 μL,充分混合均勻,避光孵育5 min,再勻速加入新鮮配制的NaBH4溶液100 μL,混合均勻,2000 r/min離心20 s,棄上清,用100 μL去離子水重懸,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。漩渦振蕩將樣品混勻,將碳支持膜浸入樣品中,5 s后取出,用濾紙去除多余液體,加熱干燥5 s,固定,放置于透射電子顯微鏡中,觀測并拍照。

納米銀(AgNPs)TEM樣品制備:取0.017 g AgNO3溶解于10 mL去離子水中,AgNO3溶液濃度為0.1 mmol/L;將0.019 g NaBH4溶解于50 mL去離子水中,NaBH4溶液濃度為0.1 mmol/L。取100 μL AgNO3放入1.5 mL離心管中,勻速加入100 μL NaBH4,混勻。合成納米銀粒子為黃綠色膠體溶液,4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 表面增強拉曼技術(shù)快速檢測腸炎沙門氏菌方法的建立

1.5.1 腸炎沙門氏菌-AgNPs樣品制備 取1 mL腸炎沙門氏菌3500 r/min離心2 min,棄上清,用Binding Buffer,3500 r/min離心2 min,洗滌3次,棄上清;100 μL濃度為0.1 mmol/L的新鮮配制的AgNO3溶液重懸,避光孵育5 min,緩慢勻速加入100 μL濃度為0.1 mmol/L的新鮮配制的NaBH4溶液,混勻后順離20 s,棄上清,用100 μL去離子水重懸,取10 μL滴到載玻片上,涂勻晾干備用。

1.5.2 腸炎沙門氏菌-Aptamer-AgNPs樣品制備 取1.3中親和力較高的適配體折疊后與腸炎沙門氏菌室溫條件下結(jié)合孵育20 min,3500 r/min離心5 min,棄上清,用1 mL Binding Buffer洗滌3次,每次3500 r/min離心5 min,棄上清;沉淀用100 μL濃度為0.1 mmol/L的新鮮配制的AgNO3溶液重懸,避光孵育5 min,緩慢勻速加入100 μL濃度為0.1 mmol/L的新鮮配制的NaBH4溶液,混勻后2000 r/min離心20 s,棄上清,用100 μL去離子水重懸,取10 μL滴到載玻片上,涂勻晾干備用。此樣品用于腸炎沙門氏菌特異性適配體SERS檢測與腸炎沙門氏菌基于SERS技術(shù)重復性檢測。

1.5.3 混合細菌樣品制備 將腸炎沙門氏菌、阪崎克羅諾桿菌、福氏志賀氏菌、大腸埃希菌O157∶H7、肺炎克雷伯氏菌3500 r/min離心2 min,棄上清,1 mL Binding Buffeer洗滌2次,棄上清,用80 μL Binding Buffer重懸混合細菌,加入折疊好的適配體120 μL室溫條件下孵育1.5 h,3500 r/min離心5 min,棄上清,用1 mL Binding Buffer洗滌2次,每次3500 r/min離心5 min,棄上清;沉淀用100 μL濃度為0.1 mmol/L的新鮮配制的AgNO3溶液重懸,避光孵育5 min,緩慢勻速加入100 μL濃度為0.1 mmol/L的新鮮配制的NaBH4溶液,混勻后2000 r/min離心20 s,棄上清,用100 μL去離子水重懸,取10 μL滴到載玻片上,涂勻晾干備用[24]。

1.5.4 拉曼檢測 分別使用107、106、105、104、103、102和101CFU/mL 7個濃度洗滌好的腸炎沙門氏菌與300 nmol/L折疊后的腸炎沙門氏菌特異性適配體結(jié)合,在復合物表面原位還原納米銀殼,進行拉曼信號采集。

分別將等量的腸炎沙門氏菌、肺炎克雷伯氏菌、大腸埃希菌O157∶H7、福氏志賀氏菌、阪崎克羅諾桿菌與折疊后的腸炎沙門氏菌特異性適配體結(jié)合,在復合物表面原位還原納米銀。將等量混合五種細菌與腸炎沙門氏菌特異性適配體結(jié)合,在復合物表面原位還原納米銀,分別采集拉曼信號。

參數(shù)設置為:激發(fā)光源532 nm,強度14 mW,物鏡50倍,積分時間5 s,積分次數(shù)2次,狹縫寬度100 μm,拉曼掃描范圍500～2000 cm-1。

1.6 豬肉樣品加標實驗

取新鮮LB液體培養(yǎng)加入瓊脂粉15 g,加入1 L去離子水同時攪拌混勻,調(diào)節(jié)pH至7.2±0.2,高壓滅菌,倒入平板培養(yǎng)皿內(nèi)冷卻,4 ℃保存?zhèn)溆?。? g肉糜樣品浸泡在一定量的10 mL 10 mmol/L磷酸鹽緩沖液中,在滅菌鍋中進行滅菌處理。滅菌后的樣品在10000 r/min條件下離心15 min,去除掉樣品中的固形物雜質(zhì)。上層清液分裝在離心管內(nèi),利用本實驗建立的檢測方法進行檢測,得到結(jié)果與傳統(tǒng)平板計數(shù)法相比較,并計算其回收率[25]。

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理使用Origin software 8.5和GraphPad Prism 7軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 腸炎沙門氏菌特異性適配體whole-bacteria-SELEX篩選結(jié)果

共進行十五輪篩選,第一輪～第九輪為正向篩選,第十輪～第十五輪為扣除篩選,各輪篩選均有有效結(jié)果,其中第一輪、第八輪、第十五輪篩選電泳結(jié)果如圖1所示,第一輪～第十五輪結(jié)合力逐漸增強,條帶越來越清晰明亮,符合預期結(jié)果。

圖1 腸炎沙門氏菌適配體篩選結(jié)果電泳圖

2.2 腸炎沙門氏菌候選適配體ELISA親和力評價

將篩選后的第十五輪核酸適配體文庫進行PCR擴增、單克隆測序,將測序結(jié)果進行序列分析,繪制進化樹。從中選取拷貝數(shù)較高的14條候選核酸適配體進行后續(xù)評價。

對14條適配體進行親和力評價,結(jié)果如圖2所示?？梢悦黠@看出4、10、12號候選核酸適配體OD值較高,因此,選擇4、10、12號候選核酸適配體進行后續(xù)SERS評價。

圖2 十四條候選適配體親和力評價

通過DNAMAN軟件對所選擇出的4、10、12號候選核酸適配體進行二級結(jié)構(gòu)預測,所得結(jié)果如圖3所示,由預測圖可以看出含有凸環(huán)與莖環(huán)結(jié)構(gòu),在莖環(huán)的鏈接處分析可能是目標腸炎沙門氏菌的結(jié)合位點,通過堿基堆積、帶電基團的靜電作用、芳香化合物堆積與氫鍵相作用形成腸炎沙門氏菌穩(wěn)定的結(jié)合位點。

圖3 候選適配體二級結(jié)構(gòu)預測圖

2.3 表面增強拉曼光譜對腸炎沙門氏菌候選適配體親和力評價

從圖4可以看出,該光譜735 cm-1處有明顯特征譜峰,并且735 cm-1處峰形尖銳,對拉曼增強掃描信號結(jié)果峰圖進行歸屬峰分析表明,735 cm-1來自胞嘧啶與尿嘧啶的代謝產(chǎn)物。且腸炎沙門氏菌-Aptamer4-AgNPs的圖譜明顯高于腸炎沙門氏菌-Aptamer10-AgNPs與腸炎沙門氏菌-Aptamer12-AgNPs的圖譜,由ELISA與SERS實驗結(jié)果均表明4號適配體親和力最高,特異性最好。腸炎沙門氏菌特異性核酸適配體序列Aptamer4為:TTTTTGCGATCCAAGCTTCTTCAAT TGGAGTGCTACCGAGATACATGGGTGGGCTCAAACAA TCGTGGGCTCGCTTGATACTAGACTGCACATCT。結(jié)果表明本研究方法能特異性增強腸炎沙門氏菌檢測的信號,峰強高,峰形明顯,直觀可見。

圖4 腸炎沙門氏菌SERS檢測結(jié)果圖

2.4 腸炎沙門氏菌電子顯微鏡表征

結(jié)果如圖5所示,在一定的濃度范圍內(nèi),適配體濃度增加,納米銀的吸附量也隨之增加,因此SERS檢測信號也得到了增強。

圖5 腸炎沙門氏菌及腸炎沙門氏菌與不同濃度適配體結(jié)合后原位還原樣品的TEM表征

將單獨制作的納米銀粒子(AgNPs)樣品取出,對其均一度進行透射電子顯微鏡表征,掃描結(jié)果如圖6所示,納米銀粒子的均一度良好,粒子的直徑在4～5 nm左右。

圖6 AgNPs TEM表征

2.5 基于SERS適配體技術(shù)檢測腸炎沙門氏菌

2.5.1 腸炎沙門氏菌基于SERS技術(shù)重復性檢測 對腸炎沙門氏菌-Aptamer4-AgNPs樣品進行5次隨機拉曼光譜掃描,掃描結(jié)果如圖7所示,拉曼掃描結(jié)果顯示5次峰圖重復性良好,峰強與峰形幾乎沒有偏差,吻合度高。

圖7 腸炎沙門氏菌SERS重復性檢測

2.5.2 不同濃度腸炎沙門氏菌SERS檢測 如圖8所示,隨著細菌濃度升高,拉曼增強掃描光譜信號強度隨之升高,當細菌濃度低至102CFU/mL時,仍能獲得拉曼響應信號。這說明該方法檢測限能夠達到102CFU/mL細菌濃度。細菌濃度與拉曼信號強度成線性相關(guān),線性方程為Y=0.05X-0.85,R2=0.95。

圖8 腸炎沙門氏菌SERS檢測靈敏度評價

2.5.3 腸炎沙門氏菌與其他菌混合樣品SERS檢測 如圖9所示,五種混合細菌-Aptamer4-AgNPs與腸炎沙門氏菌-Aptamer4-AgNPs能檢測出明顯的峰。從這組數(shù)據(jù)看出此研究方法能夠在混合細菌樣品中準確地檢測出目標細菌腸炎沙門氏菌。

圖9 混合細菌樣品中腸炎沙門氏菌檢測結(jié)果

2.6 豬肉樣品加標回收率測定

本研究的新檢測方法與傳統(tǒng)的平板計數(shù)方法所測得的結(jié)果相對照,結(jié)果如表1所示,腸炎沙門氏菌的檢測回收率在93.37%～100.18%之間,所得回收率高。與傳統(tǒng)平板計數(shù)法相比,本實驗所建立的檢測方法的一致性良好,可以應用于豬肉實際樣品中腸炎沙門氏菌的檢測。

表1 豬肉樣品中腸炎沙門氏菌的檢測回收率

3 討論與結(jié)論

本文以腸炎沙門氏菌為研究目標,采用whole-bacteria-SELEX篩選技術(shù)進行篩選核酸適配體,與其他SELEX篩選方法相比,本實驗僅需十五輪就篩選出親和力高、特異性強的核酸適配體。與傳統(tǒng)ELISA檢測相比,本實驗采用ELISA與表面增強拉曼光譜技術(shù)相結(jié)合的檢測方法,該方法不僅延用了ELISA檢測的優(yōu)點,例如成本低、操作簡單等,還結(jié)合表面增強拉曼光譜技術(shù),使檢測方便快捷,且具有高靈敏度、高選擇性,能快速準確識別被測樣品。本研究通過SERS技術(shù)快速檢測腸炎沙門氏菌和篩選特異性適配體重復性良好,在五次隨機檢測中得到基本吻合的峰,與其他類似拉曼檢測實驗相比,本實驗的重復性吻合度更好,峰強更高。

本實驗通過SERS技術(shù)對篩選出的適配體進行特異性檢測,采用類似文獻中的實驗方法,本實驗也可從五種混合細菌中特異性檢測出腸炎沙門氏菌,峰形明顯,說明本實驗篩選出的適配體具有高特異性。本實驗還對SERS檢測腸炎沙門氏菌的細菌濃度進行探究,發(fā)現(xiàn)細菌濃度在102～107CFU/mL與拉曼信號強度呈線性關(guān)系,且R2=0.95,與相類似實驗的結(jié)果相近,最低檢測限為102CFU/mL,也符合實驗要求,本實驗SERS檢測全過程僅需45 min左右,比其他檢測方法節(jié)省了許多時間,且根據(jù)拉曼光譜的特性,SERS檢測的靈敏度高,準確性好。同時將此研究方法應用于市售豬肉樣品中腸炎沙門氏菌的實際檢測發(fā)現(xiàn),所建立方法準確度好、靈敏度高,可適用于豬肉實際樣品的在線監(jiān)測[26]和快速預警[27],可有效避免由腸炎沙門氏菌感染等引發(fā)的食品安全問題[28],并有效提高食品安全水平。