張 焱,楊書婷,3,韋小翠,顏媛媛,朱宇超,嵇 晶,3, 王 琪,張曉云,何瑞欣,徐雅蝶,程建明,3,*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇南京 210023;2.江蘇省中藥功效物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京 210023;3.江蘇省海洋藥物研究開發(fā)中心,江蘇南京 210023)

2015版《中國藥典》記載馬氏珍珠貝是生產(chǎn)珍珠的珍珠貝品種,并且馬氏珍珠貝和三角帆蚌分別是海水與淡水養(yǎng)殖的主要品種,資源十分豐富,但是目前馬氏珍珠貝軟體在取珠之后棄之不用,造成了大量的資源浪費(fèi)。經(jīng)研究,馬氏珍珠貝軟體中核苷含量為16.23 mg/g(干重),核苷是組成人體結(jié)構(gòu)的基本單位,主要包括堿基、核苷、核苷酸及其衍生物,其具有抗病毒、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、醒酒保肝[1-5]等多種重要功能與作用。因此,從馬氏珍珠貝軟體中分離純化得到核苷,既能對(duì)廢棄資源進(jìn)行廢物利用,提高低值貝類的附加值,又可以得到天然核苷。

目前,對(duì)核苷類成分的分離純化技術(shù)多種多樣。岳明等[6]概括出主要方法有,薄層色譜法、離子交換樹脂、硅膠柱層析、大孔吸附樹脂、活性炭吸附層析等。對(duì)于成分組成復(fù)雜的物質(zhì),一步分離效果較差,需要多種色譜技術(shù)連用才能得到較好分離效果[7-9]。大孔吸附樹脂主要利用氫鍵和范德華力對(duì)目標(biāo)成分吸附[10-11]。并且,大孔樹脂具有穩(wěn)定性高、對(duì)目標(biāo)成分選擇性好、操作簡單高效等優(yōu)點(diǎn)[6]。對(duì)非離子型核苷類成分具有較好的分離能力。因此,本實(shí)驗(yàn)采用大孔樹脂技術(shù),首次對(duì)馬氏珍珠貝上清液中的核苷類成分進(jìn)行富集與純化,以期解決馬氏珍珠貝軟體的資源浪費(fèi)問題,對(duì)其進(jìn)行二次開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬氏珍珠貝(Pinctadamartensii) 采于廣西北海(201807),經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)劉圣金副教授鑒定其品種為馬氏珍珠貝;腺嘌呤、尿嘧啶、胞苷、次黃嘌呤、黃嘌呤、胸腺嘧啶、2′-脫氧鳥苷、2′-脫氧尿苷、2′-脫氧肌苷、胸苷、尿苷、肌苷、胸苷 均購自美國Sigma公司;HPD100、HPD250、HPD300、HPD400、HPD450、HPD500、HPD600、AB-8、D101大孔樹脂 河北滄州寶恩吸附材料科技有限公司;SP207大孔樹脂 北京綠百草科技發(fā)展有限公司;95%乙醇、甲醇 色譜級(jí),德國默克有限公司。

Waters 2695高效液相色譜儀、Waters 2489 UV檢測器 美國Waters公司;DGG-9140型A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;FA2004型電子天平 上海天平儀器有限公司;Milli-Q超純水機(jī) 美國Millipore公司;TS-110×50水浴恒溫振蕩器 上海捷呈實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;R-220旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 BUCHI Labortechnik AG。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 馬氏珍珠貝核苷提取 取新鮮的馬氏珍珠貝軟體,瀝干,稱重,加3倍量蒸餾水煎煮兩次,每次45 min,合并提取液,將合并液減壓濃縮至原軟體質(zhì)量的三分之一左右,8000 r/min離心10 min,棄去沉淀,取離心后的上清,加95%乙醇至最終醇濃度為80%,4 ℃靜置過夜,抽濾。將上清液70 ℃減壓回收,直至提取液無醇味,得到馬氏珍珠貝提取液[12-13]。

1.2.2 核苷類成分含量測定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備 精密稱定黃嘌呤核苷對(duì)照品10 mg,置于50 mL容量瓶中,其余12種核苷對(duì)照品精密稱定10 mg,置于10 mL容量瓶中,加入15%甲醇定容,搖勻。分別精密吸取鳥苷3.5 mL、胞苷1.0 mL、2′-脫氧鳥苷2 mL、肌苷5 mL、次黃嘌呤15 mL、胸腺嘧啶1.5 mL、尿苷1 mL、2′-脫氧尿苷3 mL、腺嘌呤0.5 mL、2′-脫氧肌苷5 mL、胸苷2 mL于50 mL容量瓶中,15%甲醇定容,得核苷混合對(duì)照品。

1.2.2.2 供試品溶液制備 分別精密稱取珍珠貝粉0.5 g,加入30倍量水超聲提取60 min,8000 r/min離心10 min,取上清,重復(fù)提取3次,合并上清液,定容至50 mL容量瓶中,過0.22 μm有機(jī)濾膜。

1.2.2.3 色譜條件 色譜柱:Waters X Select HSS C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);進(jìn)樣體積5 μL,流動(dòng)相A為甲醇,流動(dòng)相B為0.1%磷酸水,流速0.6 mL/min,波長254 nm,梯度洗脫:0～12 min,0.3%～1.0% A,12～20 min,1%～2% A,20～30 min,2%～8% A,30～50 min,8%～15% A。

1.2.2.4 線性關(guān)系考察 取“1.2.2.1項(xiàng)”項(xiàng)下的一系列不同濃度的核苷標(biāo)準(zhǔn)品,按照“1.2.2.3項(xiàng)”色譜條件進(jìn)行HPLC分析。以核苷峰面積為Y,核苷濃度為X做回歸計(jì)算,得回歸方程。

1.2.2.5 精密度考察 使用“1.2.2.2項(xiàng)”方法制備核苷供試品溶液,將同一份供試品在色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次,考察精密度。

1.2.2.6 重復(fù)性考察 使用“1.2.2.2項(xiàng)”方法制備6個(gè)供試品溶液,根據(jù)“1.2.2.3項(xiàng)”色譜條件分析,記錄相應(yīng)的峰面積,計(jì)算RSD,對(duì)方法重復(fù)性進(jìn)行考察。

1.2.2.7 穩(wěn)定性考察 將放置在常溫條件下的樣品,按照“1.2.2.2”供試品溶液制備方法制備一份樣品液,分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣,對(duì)樣品的穩(wěn)定性進(jìn)行考察。

1.2.2.8 加樣回收率考察 將核苷標(biāo)準(zhǔn)品以100%量加入0.5 g樣品中,平行制備六份,進(jìn)入液相檢測,計(jì)算加樣回收率。

1.2.3 大孔樹脂純化工藝考察

1.2.3.1 樹脂型號(hào)對(duì)核苷吸附率與解吸附率的影響 稱取100 g HPD100、HPD250、HPD300、HPD400、HPD450、HPD500、HPD600、AB-8、D101、SP207型大孔樹脂,先以95%乙醇浸泡過夜,浸泡過程中每隔2 h輕輕攪拌一次,濕法裝柱,用95%乙醇洗脫,洗至流出液加水不渾濁,再使用蒸餾水洗脫至流出液無醇味后,備用。

將10種已處理好的樹脂使用濾紙將表面水分吸干后,精密稱取5 g(濕重),轉(zhuǎn)移至100 mL具塞錐形瓶內(nèi),加入稀釋適當(dāng)倍數(shù)的馬氏珍珠貝核苷提取液50 mL,放于搖床上在25 ℃水浴中振蕩吸附24 h,取出。對(duì)吸附后的溶液抽濾,并將得到的濾液放置于50 mL離心管,采用HPLC-UV分析,測定濾液中核苷成分的含量,計(jì)算吸附率[6]。

使用濾紙將吸附后的樹脂表面溶液吸干,將樹脂再次置于新的100 mL錐形瓶內(nèi),精密量取體積為50 mL的5%乙醇加入,混勻,于搖床上25 ℃振搖解吸24 h,抽濾并收集濾液,進(jìn)入HPLC-UV檢測解吸液中核苷成分的含量,計(jì)算核苷的解吸附率[11]。

吸附率與解吸附率公式如下:Q=(C0-C1)V/M

A=(C0-C1)/C0×100

D=C2/(C0-C1)×100

式中,Q為飽和吸附量(mg/g),A為吸附率(%),D為解吸率(%),C0為吸附前原樣品液中總核苷濃度(mg/mL),C1為吸附后所得濾液中總核苷濃度(mg/mL),C2為解吸后濾液中總核苷濃度(mg/mL),V為溶液體積(mL),M為樹脂重量(g)[12-13]。

1.2.3.2 上樣濃度對(duì)吸附效果的影響 馬氏珍珠貝水提醇沉上清液經(jīng)回收乙醇后,對(duì)其水部位進(jìn)行適量濃縮,制備得到不同的核苷濃度(0.27、0.55、1.09、2.19、4.38 mg/mL)作為上樣液,以考察上樣濃度對(duì)SP207樹脂吸附效果的影響。

1.2.3.3 上樣pH對(duì)SP207大孔樹脂吸附效果的影響 取核苷濃度為2.19 mg/mL的樣品液作為上樣液。pH計(jì)測得上樣溶液(濃度為2.19 mg/mL)pH為4.6。再分別采用適當(dāng)濃度的鹽酸和氫氧化鈉溶液將上樣溶液調(diào)節(jié)為pH3.0、6.0、7.0、8.0,以相同流速2 BV/h通過層析柱,至樣品液全部通過層析柱后,2 BV水除雜,收集未吸附液與水洗液,量取體積,HPLC測定其中核苷含量,計(jì)算吸附率。

1.2.3.4 上樣流速對(duì)大孔樹脂的吸附效果的影響 取核苷濃度為2.19 mg/mL的樣品液作為上樣液。調(diào)節(jié)溶液通過層析柱的流速為1、2、3、4、5 BV/h,至樣品液全部通過層析柱后2 BV水進(jìn)行除雜,收集過柱液與水洗除雜部位,量取體積,HPLC測定其中核苷含量,計(jì)算吸附率。

1.2.3.5 泄漏曲線考察 量取25 mL預(yù)處理好的SP207大孔樹脂,濕法填充層析柱(Φ 1.6 cm×40 cm)。調(diào)節(jié)上樣流速為2 BV/h,取300 mL核苷濃度為2.19 mg/mL上樣液,以10 mL容量瓶為一流份,樣品液全部通過層析柱后,HPLC測定其中核苷濃度,以收集的流份數(shù)為橫坐標(biāo),以流出液中核苷濃度Ct與上樣濃度Co的比值為縱坐標(biāo),制備泄漏曲線。

1.2.3.6 最佳上樣量范圍考察 取核苷濃度為2.34 mg/mL的上樣液,調(diào)節(jié)上樣流速是2 BV/h,分別加入20、25、30、40、50 mL上樣液,待樣品全部流過樹脂后,用2 BV水除雜,再用 3 BV 10%乙醇以2 BV/h洗脫,收集10%乙醇洗脫液,HPLC分析洗脫液,并通過將洗脫液置于蒸發(fā)皿中蒸干以測定該部位固體含量(以下簡稱“固含”),計(jì)算純化后核苷純度及轉(zhuǎn)移率。

固體含量=M1-M2

其中:M1=樣品重量+蒸發(fā)皿重量;M2=蒸發(fā)皿重量。

純度(%)=總核苷含量/固體含量×100

轉(zhuǎn)移率(%)=洗脫液中總核苷含量/上樣液中總核苷含量×100

1.2.3.7 水洗量對(duì)大孔樹脂洗脫效果的影響 樣品液全部流過層析柱后,用1、2、3、4、5 BV 蒸餾水以2 BV/h的流速除雜,再以3 BV的10%乙醇以2 BV/h洗脫。收集10%乙醇洗脫部位,使用HPLC分析。并測定10%乙醇洗脫部位的固含,計(jì)算核苷的轉(zhuǎn)移率及純度。

1.2.3.8 洗脫劑濃度對(duì)大孔樹脂洗脫效果的影響 樣品溶液全部流過樹脂后,使用2 BV水以2 BV/h進(jìn)行水洗除雜,再以3 BV水、5%、10%、15%、20%乙醇以2 BV/h洗脫,收集洗脫液。將洗脫液HPLC分析,并測定不同乙醇濃度洗脫部位固含,計(jì)算其核苷含量,計(jì)算轉(zhuǎn)移率及純度。

1.2.3.9 洗脫流速對(duì)大孔樹脂洗脫效果的影響 樣品溶液全部流過樹脂后,使用2 BV水以2 BV/h進(jìn)行水洗除雜,再以3 BV 15%醇以1、2、3、4 BV/h洗脫,收集洗脫液。將洗脫液HPLC分析,并測定洗脫液固含,計(jì)算洗脫液中核苷含量,計(jì)算轉(zhuǎn)移率及純度。

1.2.3.10 洗脫體積對(duì)大孔樹脂洗脫效果的影響 樣品溶液全部流過樹脂后,使用2 BV水以2 BV/h進(jìn)行水洗除雜,再以3、6、9、12、15 BV 15%醇以3 BV/h洗脫,收集15%乙醇洗脫部位。將15%乙醇洗脫液采用HPLC分析,并測定其洗脫液中固含,計(jì)算洗脫液中核苷含量,計(jì)算轉(zhuǎn)移率及純度。

1.2.3.11 徑高比對(duì)大孔樹脂洗脫效果的影響 將SP207樹脂分別裝入不同規(guī)格的層析柱內(nèi),使其徑高比為1∶1、1∶3、1∶5、1∶7、1∶10。調(diào)節(jié)溶液流速為2 BV/h,樣品溶液全部流過樹脂后,使用2 BV水以2 BV/h進(jìn)行水洗除雜,再以3 BV 15%醇以3 BV/h洗脫,收集15%乙醇洗脫部位。將15%乙醇洗脫液采用HPLC分析,并測定其洗脫液中固含,計(jì)算洗脫液中核苷含量,計(jì)算轉(zhuǎn)移率及純度。

1.2.3.12 馬氏珍珠貝核苷類成分純化工藝驗(yàn)證 馬氏珍珠貝醇沉上清經(jīng)過回收乙醇后,其水溶液部位進(jìn)行濃縮,制備得到核苷濃度為2.19 mg/mL的核苷部位,作為上樣液。

分別量取3份處理好的SP207樹脂25 mL,濕法裝柱(Φ 1.6 cm×40 cm),其徑高比為1∶7。調(diào)節(jié)溶液流速為2 BV/h,將馬氏珍珠貝核苷提取液緩慢貼壁加入裝有樹脂的層析柱中,待樣品溶液全部流過樹脂后,使用2 BV水以2 BV/h進(jìn)行水洗除雜,再以3 BV 15%醇以3 BV/h洗脫,收集15%乙醇洗脫部位。將15%乙醇洗脫液采用HPLC分析,并測定其洗脫液中固含,計(jì)算洗脫液中核苷含量,計(jì)算轉(zhuǎn)移率及純度。

1.2.4 UV法測定核苷含量

1.2.4.1 肌苷和樣品的全波掃描 由于肌苷是馬氏珍珠貝中含量高且活性好的成分。因此,選擇肌苷作為UV的對(duì)照品。

精密稱取肌苷標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg,用15%甲醇溶解定容至100 mL容量瓶內(nèi),配制成濃度為0.1 mg/mL的肌苷溶液儲(chǔ)備液。使用移液管分別量取0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0 mL肌苷對(duì)照品置于10 mL容量瓶內(nèi),用15%甲醇定容,即得系列肌苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液,另取1.2.3.12項(xiàng)下馬氏珍珠貝核苷純化液,在200～400 nm進(jìn)行全波掃描。

1.2.4.2 肌苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取1.2.4.1種配制的肌苷溶液,進(jìn)行紫外分光光度計(jì)分析,并根據(jù)溶液濃度和對(duì)應(yīng)的吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.3 馬氏珍珠貝純化液核苷含量測定 取1.2.3.12項(xiàng)下馬氏珍珠貝驗(yàn)證工藝中的樣品,進(jìn)紫外分光光度計(jì)分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 核苷類成分含量測定方法學(xué)考察

2.1.1 線性關(guān)系考察 13種核苷標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測限和定量限檢測結(jié)果見表1,均在線性濃度范圍內(nèi)關(guān)系良好,R2>0.999。

表1 13種核苷標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測限和定量限檢測結(jié)果

2.1.2 精密度考察 樣品中胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、2′-脫氧尿苷、鳥苷、2′-脫氧鳥苷、肌苷、胞苷、2′-脫氧肌苷、腺嘌呤、胸苷、黃嘌呤的精密度RSD分別為0.32%、0.29%、0.24%、0.52%、0.27%、0.23%、0.17%、0.18%、0.45%、0.32%、0.36%、0.36%、0.28%,精密度符合2015版《中國藥典》規(guī)定,具體結(jié)果見表2。

表2 13種核苷精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.3 重復(fù)性考察 樣品中腺嘌呤、胞苷、黃嘌呤、尿苷、2′-脫氧尿苷、鳥苷、2′-脫氧鳥苷、肌苷、次黃嘌呤、2′-脫氧肌苷、尿嘧啶、胸苷、胸腺嘧啶的重復(fù)性RSD分別為1.24%、0.44%、0.71%、1.64%、0.68%、1.57%、2.60%、1.37%、0.67%、0.42%、0.72%、0.47%、0.80%,表明該方法的重復(fù)性良好,具體結(jié)果見表3。

表3 13種核苷重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.4 穩(wěn)定性考察 樣品中胸腺嘧啶、腺嘌呤、尿嘧啶、胞苷、次黃嘌呤、尿苷、2′-脫氧尿苷、鳥苷、2′-脫氧鳥苷、黃嘌呤、肌苷、2′-脫氧肌苷、胸苷的穩(wěn)定性RSD分別為0.18%、1.88%、1.33%、0.84%、0.97%、0.41%、1.10%、1.43%、2.86%、1.03%、1.64%、0.67%、0.41%,13種核苷在24 h內(nèi)穩(wěn)定,具體結(jié)果見表4。

表4 13種核苷穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.5 加樣回收率考察 樣品中腺嘌呤、尿嘧啶、胞苷、次黃嘌呤、黃嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、2′-脫氧尿苷、鳥苷、2′-脫氧鳥苷、肌苷、2′-脫氧肌苷、胸苷的平均加樣回收率在88.63%～103.33%。RSD值在0.02%～3.91%范圍內(nèi),表明該測定方法的準(zhǔn)確度符合要求,該研究方案科學(xué)可靠,具體結(jié)果見表5。

表5 13種核苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.2 大孔樹脂純化工藝考察

2.2.1 樹脂型號(hào)對(duì)核苷吸附率與解吸附率的影響 不同型號(hào)大孔樹脂對(duì)核苷類成分的靜態(tài)吸附及解吸情況見表6。

表6 不同型號(hào)樹脂對(duì)核苷類成分的靜態(tài)吸附率及解吸附率

實(shí)驗(yàn)篩選了10種樹脂,由于樹脂吸附原理為相似相容原理,不同型號(hào)的大孔樹脂極性不同,導(dǎo)致樹脂吸附和解吸附性不同。由表6結(jié)果可知,在10種大孔樹脂中,SP207對(duì)核苷的吸附率最高，為63.50%,解吸附率也較好，為73.80%。綜合考慮吸附率與解吸附率,最終選擇SP207為純化樹脂,對(duì)其進(jìn)行下一步的上樣工藝考察。

2.2.2 上樣濃度對(duì)吸附效果的影響 上樣濃度對(duì)吸附效果的影響見表7。

表7 不同上樣濃度對(duì)SP207樹脂吸附效果的影響

由表7可以看出,隨著核苷上樣濃度的增加,吸附率先上升后下降,當(dāng)上樣濃度為2.19 mg/mL達(dá)到最大值83.81%。推測可能的原因是當(dāng)上樣濃度較低時(shí),樹脂吸附需要較長時(shí)間,且比吸附量下降,造成吸附率降低;上樣濃度較高時(shí),樹脂的吸附推動(dòng)力大,有利于樹脂對(duì)目標(biāo)成分的吸附,吸附率也將增加。但上樣液的濃度過高時(shí),有效成分泄漏,吸附效果變差,且導(dǎo)致樹脂的再生周期短,因此最終確定SP207大孔樹脂最佳上樣濃度為2.19 mg/mL。

2.2.3 上樣pH對(duì)SP207大孔樹脂吸附效果的影響 上樣pH對(duì)SP207大孔樹脂吸附效果的影響結(jié)果見表8。

表8 上樣pH對(duì)大孔樹脂吸附效果的影響

如表8所示,在SP207樹脂吸附過程中,不同的上樣pH對(duì)樹脂吸附核苷有明顯的影響。本實(shí)驗(yàn)考察了從酸性到堿性的區(qū)間,結(jié)果顯示,隨著pH增加,吸附率呈現(xiàn)先增加后趨于穩(wěn)定最后降低的趨勢。表8中顯示吸附最佳pH為6(82.78%),但與pH為4.6(不調(diào)pH)吸附率(82.14%)相近,因此,考慮工業(yè)生產(chǎn)的方便性。選擇不調(diào)節(jié)pH上樣,即pH4.6上樣。

2.2.4 上樣流速對(duì)大孔樹脂吸附效果的影響 上樣流速對(duì)大孔樹脂吸附效果的影響結(jié)果見表9。

表9 上樣流速對(duì)大孔樹脂吸附效果的影響

如表9所示,隨著上樣速度的增加,核苷吸附率呈現(xiàn)不斷降低。推測可能的原因是上樣流速較低時(shí)可以使上樣溶液緩慢通過樹脂,上樣溶液與樹脂吸附更高效;隨著流速的不斷增加,上樣液與樹脂接觸不充分,導(dǎo)致成分還未被吸附就隨著上樣液流出,導(dǎo)致吸附效率降低。由表9可以看出1～2 BV/h的吸附率相近,因此,考慮工業(yè)生產(chǎn)效率選擇2 BV/h作為上樣流速。

2.2.5 泄漏曲線考察 泄露曲線結(jié)果見圖1。

圖1 SP207樹脂中核苷類成分的泄漏曲線

由圖1顯示,隨著核苷上樣體積的增加,泄漏出現(xiàn)不斷增加的趨勢,直到樹脂達(dá)到飽和后不再增加。上樣體積為10～60 mL時(shí),核苷類成分呈現(xiàn)緩慢泄漏,上樣70 mL時(shí)核苷類成分呈現(xiàn)明顯泄漏。SP207樹脂最大上樣量為210 mL,上樣10 mL時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)泄漏,考慮到吸附效率,需要對(duì)數(shù)值的最佳上樣量進(jìn)行考察。

2.2.6 考察最佳上樣量范圍 最佳上樣量范圍結(jié)果見表10。

表10 考察最佳上樣量范圍

表10顯示,隨著上樣體積的增加,核苷轉(zhuǎn)移率呈現(xiàn)逐漸下降趨勢,純度是先上升后下降再上升。分析原因,當(dāng)上樣體積少時(shí)核苷樹脂對(duì)其吸附充分,但雜質(zhì)吸附量也相應(yīng)增加,導(dǎo)致轉(zhuǎn)移率高但純度低;隨著上樣體積的增加,一定體積的樹脂吸附能力逐漸減弱,因此,轉(zhuǎn)移率降低;同時(shí)對(duì)雜質(zhì)的吸附能力降低會(huì)導(dǎo)致純度升高。但當(dāng)隨著上樣量的繼續(xù)增加導(dǎo)致核苷泄漏增加,核苷轉(zhuǎn)移率降低,最終同樣導(dǎo)致純度降低。因此,核苷最佳上樣體積為25 mL。

2.2.7 水洗量對(duì)大孔樹脂洗脫效果的影響 水洗量對(duì)大孔樹脂洗脫效果的影響結(jié)果見表11。

表11 水洗量對(duì) SP207樹脂洗脫效果的影響

由表11可知,隨著水洗量的增加,核苷轉(zhuǎn)移率逐漸降低,核苷純度逐漸升高。分析原因,隨著水洗體積的增加不僅除去雜質(zhì)由于核苷為水溶性成分,因此也會(huì)洗脫核苷,導(dǎo)致轉(zhuǎn)移率降低,純度增加。綜合考慮核苷轉(zhuǎn)移率及純度,最終選擇2 BV水作為水洗量。

2.2.8 洗脫劑濃度對(duì)大孔樹脂洗脫效果的影響 洗脫劑濃度對(duì)大孔樹脂洗脫效果的影響結(jié)果見表12。

表12 不同乙醇濃度對(duì)核苷類成分的洗脫情況

由表12可知,隨著乙醇濃度的增加,核苷轉(zhuǎn)移率逐漸增加,核苷純度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。分析原因,SP207為中等極性樹脂,根據(jù)相似相容原理,當(dāng)洗脫液極性減小時(shí),核苷洗脫量增加導(dǎo)致核苷轉(zhuǎn)移率增加,純度升高。但隨著醇濃度的升高,雜質(zhì)也逐漸洗脫,導(dǎo)致純度降低。綜合考慮核苷轉(zhuǎn)移率及純度,最終選擇15%乙醇作為洗脫溶劑。

2.2.9 洗脫流速對(duì)大孔樹脂洗脫效果的影響 洗脫流速對(duì)大孔樹脂洗脫效果的影響結(jié)果見表13。

由表13可知,在SP207樹脂的洗脫過程中,通常流速增加,洗脫劑與核苷類成分交換的時(shí)間減少,導(dǎo)致交換不充分,從而被洗脫下來的核苷量會(huì)隨之減少。當(dāng)洗脫速度為2、3 BV/h時(shí),兩者之間的核苷轉(zhuǎn)移率、除雜率與純度的效果均相近,考慮生產(chǎn)效率,優(yōu)先選擇3 BV/h的洗脫流速。

表13 洗脫流速對(duì)SP207樹脂洗脫效果的影響

2.2.10 洗脫體積對(duì)大孔樹脂洗脫效果的影響 洗脫體積對(duì)大孔樹脂洗脫效果的影響結(jié)果見表14。

表14 洗脫體積對(duì)SP207樹脂洗脫效果的影響

表14顯示,隨著洗脫體積的增加,核苷轉(zhuǎn)移率時(shí)逐漸增高,純度呈現(xiàn)先增后降低的趨勢。分析原因,隨著洗脫體積的增加,可以使核苷類成分洗脫更加充分,但雜質(zhì)也會(huì)被洗脫。因此,核苷轉(zhuǎn)移率會(huì)增加,但當(dāng)核苷全部洗脫后,再繼續(xù)增加洗脫體積雜質(zhì)增加導(dǎo)致核苷純度降低。由表14可以看出,當(dāng)3 BV洗脫時(shí)大部分核苷已經(jīng)被洗脫,隨洗脫體積增加轉(zhuǎn)移率增加不明顯。因此,從轉(zhuǎn)移率、純度以及工業(yè)成本、效率等因素。最終,選擇3 BV為核苷洗脫體積。

2.2.11 徑高比對(duì)大孔樹脂洗脫效果的影響 徑高比對(duì)大孔樹脂洗脫效果的影響結(jié)果見表15。

表15 徑高比對(duì)SP207樹脂洗脫效果的影響

由表15可知,隨著徑高比的增加核苷轉(zhuǎn)移率與純度均呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢,且在徑高比為1∶7時(shí)達(dá)到最高,此時(shí)核苷轉(zhuǎn)移率為89.00%,純度為33.52%?？紤]核苷轉(zhuǎn)移率及純度等因素,最終選擇轉(zhuǎn)移率與純度均最高的1∶7為其徑高比。

2.2.12 馬氏珍珠貝核苷類成分純化工藝驗(yàn)證 采用以上篩選出的工藝條件,對(duì)馬氏珍珠貝進(jìn)行純化,純化結(jié)果見表16。

由表16可知,馬氏珍珠貝水提醇沉上清液經(jīng)回收乙醇后經(jīng)過SP207大孔樹脂純化核苷類成分,其核苷轉(zhuǎn)移率處于較高水平,總轉(zhuǎn)移率為89.49%。核苷類成分純度從1.81%提高到36.10%。由于HPLC測定的僅僅是核苷與堿基,不包含核苷酸類成分,為了更加全面地測定核苷類成分,本實(shí)驗(yàn)將采用UV-Vis法對(duì)核苷類成分進(jìn)行測定。

表16 馬氏珍珠貝核苷類成分純化工藝驗(yàn)證

2.3 UV法測定核苷含量

2.3.1 肌苷和樣品的全波掃描 全波長掃描結(jié)果顯示,252 nm為樣品及對(duì)照品最大吸收波長,結(jié)果見圖2。

圖2 肌苷和樣品全波掃描結(jié)果

2.3.2 肌苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取1.2.4中配制的肌苷溶液,進(jìn)紫外分光光度計(jì)分析,結(jié)果圖3。

圖3 肌苷標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.3.3 馬氏珍珠貝純化液核苷含量測定 對(duì)馬氏珍珠貝驗(yàn)證工藝中的核苷含量進(jìn)行測定,結(jié)果顯示UV測的純度為58.19%,結(jié)果見表17。由于UV檢測到的成分中包含了HPLC中未能檢測到的核苷類成分,因此含量檢測結(jié)果更高。

表17 UV測定核苷含量結(jié)果

3 結(jié)論

本文主要研究馬氏珍珠貝純化工藝,以馬氏珍珠貝水提醇沉液中的核苷類成分為指標(biāo),采用HPLC測定含量。對(duì)大孔樹脂型號(hào)、上樣工藝、洗脫工藝進(jìn)行考察,富集得到純度為36.10%的核苷部位,總轉(zhuǎn)移率89.49%。在貝類軟體的純化過程中,極有可能存在其他核苷類成分,為全面測出總核苷類成分純度,故進(jìn)一步對(duì)核苷純化部位進(jìn)行UV測定,結(jié)果顯示經(jīng)SP207純化后的核苷純度為58.19%。此結(jié)果說明,此大孔樹脂純化方法適用于馬氏珍珠貝中核苷類成分的分離富集,為馬氏珍珠貝的后續(xù)開發(fā)奠定了基礎(chǔ),同時(shí)也為其他同類成分的富集分離提供了分離純化工藝參考。