詹 力,王星敏,2,*,唐付杰,李仁炳

(1.重慶工商大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院,重慶 400067;2.重慶市特色農(nóng)產(chǎn)品加工儲(chǔ)運(yùn)工程技術(shù)研究中心,重慶 400067)

黃酮類化合物屬植物次生代謝產(chǎn)物[1],作為功能成分廣泛應(yīng)用于藥物、保健食品及化妝品開(kāi)發(fā)等。藥食同源物桑葉含有黃酮類、生物堿類、多糖類等[2]成分,而蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷是桑葉黃酮類物質(zhì)的代表,具有降血壓[3]、抗氧化[4]等藥理活性,臨床上用于高血壓病及糖尿病的輔助治療[5]?，F(xiàn)有桑資源黃酮類物質(zhì)開(kāi)發(fā)利用技術(shù)包括有機(jī)溶劑提取法、微波輔助法、超聲提取法、酶提取法及超臨界萃取法等[6],孫蓮等[7]采用超聲波提取桑葉中黃酮類物質(zhì),測(cè)得蘆丁含量1.01 mg/g、異槲皮苷0.74 mg/g、紫云英苷0.23 mg/g;邸學(xué)等[8]采用有機(jī)溶劑萃取法檢測(cè)到桑葉中蘆丁含量0.13 mg/g、異槲皮苷0.21 mg/g、紫云英苷0.07 mg/g。分析提取黃酮類物質(zhì)發(fā)現(xiàn),有效成分存于細(xì)胞原生質(zhì)體中,需克服細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)雙重阻力,才能擴(kuò)散至提取介質(zhì)中[9];致密的植物細(xì)胞壁組織結(jié)構(gòu)形成的天然屏障[10],阻礙異槲皮苷等黃酮類天然活性物質(zhì)的溶出。酶解法具有高效及專一性,選取植物組織特定酶,可催化降解木質(zhì)素、纖維素、半纖維素等細(xì)胞壁組成成分,從而減少天然成分溶出的傳質(zhì)阻力,提高天然產(chǎn)物提取量[11]。如李俠等[12]應(yīng)用超聲-纖維素酶法提取綠豆皮黃酮類化合物,得率可達(dá)到0.831%,比單獨(dú)超聲波提取的得率提高了18.54%;李艷鳳等[13]利用復(fù)合酶(纖維素酶、果膠酶及半纖維酶)酶解提取銀杏葉中黃酮類化合物發(fā)現(xiàn),適宜條件下復(fù)合酶對(duì)銀杏葉的細(xì)胞組織有較強(qiáng)的破壁力,總黃酮提取率比不加酶提高了36.6%。如何增大植物細(xì)胞的破壁能效、提高有效成分的溶出效率,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)桑資源的高效利用,對(duì)提升桑蠶業(yè)的整體效益和持續(xù)發(fā)展尤顯重要。

基于此,本文提出復(fù)合酶催化酶解桑葉植物組織強(qiáng)化浸提天然活性物質(zhì),選取黃酮類物質(zhì)異槲皮苷溶浸量為評(píng)價(jià)指標(biāo),采用均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化獲得異槲皮苷的適宜溶出參數(shù),探究復(fù)合酶催化水解植物組織及其對(duì)黃酮類物質(zhì)破壁溶出作用,為實(shí)現(xiàn)桑資源開(kāi)發(fā)利用最大化提供技術(shù)研究及理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干桑葉粉 采摘自重慶市北碚區(qū)蠶桑研究院;乙腈(色譜純) 重慶川東化工集團(tuán)有限公司;蘆丁(標(biāo)準(zhǔn)品)、異槲皮苷(標(biāo)準(zhǔn)品)、紫云英苷(標(biāo)準(zhǔn)品) 成都普菲德生物技術(shù)有限公司;纖維素酶(100 U/mg) 和氏璧生物科技有限公司;半纖維素酶(20 U/mg)、木瓜蛋白酶(800 U/mg) 上海源葉生物科技有限公司;漆酶(10 U/mg) 北京酷爾化學(xué)科技;無(wú)水乙醇、檸檬酸、磷酸(分析純)、溴化鉀(色譜純) 重慶川東化工集團(tuán)有限公司。

1260高效液相色譜儀 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司;pH計(jì) 上海雷磁精密儀器有限公司;TDZ5-WS高速離心機(jī) 上海君竺儀器制造有限公司;EL104電子天平(0.0001 g) 塞多利斯科學(xué)儀器有限公司;Nexus 670傅里葉變換紅外光譜儀 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 復(fù)合酶設(shè)計(jì)及酶解反應(yīng) 稱取過(guò)60目篩的干桑葉粉2 g于錐形瓶中,加入分配比為漆酶、纖維素酶、半纖維素酶、木瓜蛋白質(zhì)量比為2∶1∶1∶26的復(fù)合酶,按體積比為1∶5加入無(wú)水乙醇10 mL及蒸餾水50 mL后,用質(zhì)量濃度為0.5 g/mL的檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH,混勻后于一定溫度水浴酶解一段時(shí)間后,取出冷卻至室溫,過(guò)濾、離心(4000 r/min,10 min)、定容于100 mL得酶解提取液,待測(cè)。其中,復(fù)合酶組配根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果、采用均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化獲得。

1.2.2 黃酮類物質(zhì)含量測(cè)定 采用高效液相色譜法測(cè)定酶解提取液或乙醇浸提液中黃酮類物質(zhì)的質(zhì)量濃度,色譜柱為Agilent TC-C18(2)柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相為體積比為20∶80的乙腈和0.5%磷酸溶液,流速為1 mL/min[14],檢測(cè)波長(zhǎng)為358 nm,柱溫為25 ℃,進(jìn)樣量為10 μL。繪制桑葉異槲皮苷、蘆丁及紫云英苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為:Y=18597X-5.827(R=0.9994)、Y=20400X-20.394(R=0.9995)、Y=13147X-21.014(R=0.9985)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算異槲皮苷、蘆丁、紫云英苷的溶出質(zhì)量濃度,進(jìn)而計(jì)算桑葉黃酮類物質(zhì)溶浸量,計(jì)算公式如下:

式(1)

式中,A為黃酮類物質(zhì)溶浸量,mg/g;c為各黃酮類物質(zhì)溶出濃度,g/L;v為提取液體積,mL;m為桑葉質(zhì)量,g。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,考察酶解時(shí)間(水平值為30、45、60、90、120、150、180 min)、酶解溫度(水平值25、30、35、40、45、50、55 ℃)、復(fù)合酶投加量(水平值為0.150、0.225、0.300、0.375、0.450、0.525、0.600、0.675、0.750 g)及pH(水平值為4.0、4.3、4.6、4.9、5.2、5.5、5.8)對(duì)異槲皮苷、蘆丁、紫云英苷等黃酮類物質(zhì)的溶浸量的影響,并選取異槲皮苷溶浸量為評(píng)價(jià)指標(biāo),確定考察因素的適宜范圍值。其中,各因素的初始值為酶解時(shí)間60 min、酶解溫度35 ℃、復(fù)合酶投加量0.3 g、pH4.5,其余參數(shù)值按1.2.1選取。

表1 均勻設(shè)計(jì)因素水平與編碼

1.2.5 無(wú)酶乙醇溶浸 溶浸工藝中復(fù)合酶投加量為零,反應(yīng)時(shí)間、水浴溫度、pH為均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化所得酶解反應(yīng)得適宜參數(shù),其余參數(shù)與1.2.1中參數(shù)一致。

1.2.6 物相表征

1.2.6.1 掃描電子顯微鏡分析 掃描電子顯微鏡(SEM)是用細(xì)聚焦的電子束掃描樣品,樣品與電子束之間相互作用會(huì)產(chǎn)生大量二次電子,利用二次電子信號(hào)成像觀察樣品表面及斷口形貌并對(duì)此進(jìn)行分析[15]。本試驗(yàn)采用SEM法分析經(jīng)酶解催化反應(yīng)前后桑葉表面物相結(jié)構(gòu),其中電鏡工作電壓為15 kV、放大1250倍。

1.2.6.2 桑葉底物表面官能團(tuán)FTIR分析 采用衰減全反射模式測(cè)定桑葉的傅里葉變換紅外光譜,分析酶解反應(yīng)后底物表面化學(xué)物質(zhì)的官能團(tuán)種類及其變化,測(cè)定波數(shù)為4000～500 cm-1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次,結(jié)果取平均值并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差,運(yùn)用Origin 8.5軟件繪制趨勢(shì)曲線圖。利用SPSS 19.0(statistical product and service solutions)軟件和VF 6.0(visual foxpro)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),建立模型,計(jì)算獲得優(yōu)勢(shì)酶解參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 影響黃酮類物質(zhì)溶出的酶催化因素解析

2.1.1 酶解時(shí)間對(duì)黃酮類物質(zhì)溶浸的影響 酶催化活性中心與底物的接觸受酶解時(shí)間影響[16]。由圖1可知,三種黃酮類物質(zhì)的溶浸量隨酶解時(shí)間先升后降,異槲皮苷、蘆丁在60 min時(shí)均達(dá)到最大值0.49、0.29 mg/g,紫云英苷在此時(shí)也有極大值0.50 mg/g。分析其原因可能是反應(yīng)初期,隨著酶逐步與底物充分接觸,酶解破壁效率逐步提高,黃酮類物質(zhì)溶浸量呈上升趨勢(shì);隨著復(fù)合酶活性中心都被底物結(jié)合充分發(fā)揮了催化酶解作用,進(jìn)而酶解效率逐漸趨于平緩[17];結(jié)合文獻(xiàn)對(duì)比復(fù)合酶酶解時(shí)間僅為單一酶(纖維素酶)[18]的12.5%。

圖1 酶解時(shí)間對(duì)桑葉黃酮類物質(zhì)浸提量的影響

2.1.2 酶解活化溫度對(duì)黃酮類物質(zhì)的影響 復(fù)合酶作為蛋白質(zhì),對(duì)溫度表現(xiàn)敏感。由圖2可知,三種黃酮類物質(zhì)溶浸量隨著反應(yīng)溫度的升高逐漸增加,在50 ℃時(shí)表現(xiàn)出最適宜溫度;此時(shí)異槲皮苷、蘆丁、紫云英苷溶浸量分別為0.89、0.50、0.57 mg/g。分析原因在于,在酶適宜溫度45～65 ℃的范圍內(nèi),溫度升高,活化分子數(shù)會(huì)相應(yīng)增多,進(jìn)而提高酶活性,促進(jìn)酶解活化反應(yīng);溫度升高,天然活性物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)速度雖加快,有利于活性物質(zhì)的滲透、擴(kuò)散、溶解[19],但酶隨溫度熱變性同時(shí)加快,酶活力減小,導(dǎo)致天然活性物質(zhì)溶出量降低[17]。

圖2 酶解溫度對(duì)黃酮類物質(zhì)浸提量的影響

2.1.3 復(fù)合酶投加量對(duì)黃酮類物質(zhì)的影響 酶的投加量也影響單位體積酶活性中心數(shù),進(jìn)而影響單位時(shí)間酶反應(yīng)速度。由圖3可知,當(dāng)復(fù)合酶投加量由0.15 g增至0.6 g時(shí),蘆丁溶浸量也迅速增加,最高可達(dá)0.67 mg/g;而異槲皮苷和紫云英苷酶催化溶出優(yōu)勢(shì)明顯,分別在0.45 g出現(xiàn)最大溶浸量,但繼續(xù)增加復(fù)合酶投加量黃酮類物質(zhì)并不更多溶出。分析原因,酶投加量的增加,加大了與底物接觸的酶活性位點(diǎn)[10];但隨著酶投加量的不斷增加,同時(shí)加大反應(yīng)體系中其他天然產(chǎn)物的溶出競(jìng)爭(zhēng),影響異槲皮苷和紫云英苷的優(yōu)勢(shì)溶出。

圖3 復(fù)合酶投加量對(duì)黃酮類物質(zhì)浸提量的影響

2.1.4 pH對(duì)黃酮類物質(zhì)的影響 酶蛋白分子表面極性基團(tuán)隨體系pH的變化而發(fā)生不同程度的解離,影響酶活性部位構(gòu)象[18]。由圖4可知,異槲皮苷、蘆丁和紫云英苷溶浸量隨體系pH的增大呈先增加后減小再增加再減小的波動(dòng)趨勢(shì),當(dāng)pH為4.3時(shí),三種黃酮類物質(zhì)均達(dá)最高溶浸量,分別為1.67、0.70、0.81 mg/g。分析原因在于,本實(shí)驗(yàn)的復(fù)合酶雖主要為木瓜蛋白酶,其最適pH范圍5～7,但其中少量的漆酶、纖維素酶及半纖維素改變了整個(gè)復(fù)合酶制劑的最適pH。溶液pH改變會(huì)破壞酶的空間結(jié)構(gòu)且失活,影響酶活性中心催化基團(tuán)的功能,從而影響植物細(xì)胞的破壁作用,及酶解反應(yīng)的速率和酶解效率[20-21]。

圖4 pH對(duì)黃酮類物質(zhì)浸提量的影響

2.2 酶解反應(yīng)提取異槲皮苷的適宜工藝條件的探索

表6 黃酮類物質(zhì)的不同浸提方法優(yōu)勢(shì)比較

表2 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 回歸分析方程結(jié)果

表4 顯著性分析結(jié)果

表5 驗(yàn)證結(jié)果

2.3 復(fù)合酶催化強(qiáng)化作用解析

2.3.1 桑葉底物表面官能團(tuán)結(jié)構(gòu)分析 谷緒頂?shù)萚23]采用紅外光譜圖解析植物底物表面官能團(tuán),證明微生物預(yù)處理破壞桑葉細(xì)胞壁,利于細(xì)胞中1-脫氧野尻霉素的釋放;何士成等[24]也通過(guò)FTIR圖譜表明,經(jīng)堿液處理后,檸條、水稻秸稈和小麥秸稈的木質(zhì)素結(jié)構(gòu)受到一定程度的破壞。因此本文采用紅外光譜分析酶解反應(yīng)后底物表面化學(xué)物質(zhì)的官能團(tuán)種類及其變化,如圖5所示,經(jīng)過(guò)酶解后的桑葉殘?jiān)?920 cm-1處的吸收峰增強(qiáng),為C-H伸縮振動(dòng)[25],說(shuō)明酶解作用破壞了植物組織使得更多的胞內(nèi)物質(zhì)溶出;桑葉的紅外譜圖中位于1390 cm-1是源于纖維素中的葡萄糖和半纖維素中木聚糖結(jié)構(gòu)分子上的-CH2與O-H的彎曲振動(dòng)的吸收峰[26],同樣酶解后的樣品在此處特征峰增強(qiáng),說(shuō)明復(fù)合酶中半纖維素酶作用于半纖維素使其發(fā)生分解,半纖維素與木質(zhì)素之間的交聯(lián)結(jié)構(gòu)被破壞。在2330、1564及1133 cm-1處的特征吸收峰分別是-C≡C-、>C=C<以及羧基的C-O的伸縮振動(dòng)[25],表明酶解反應(yīng)促進(jìn)桑葉木質(zhì)素中苯基丙烷結(jié)構(gòu)單元分解,有利于桑葉植物組織中空隙的形成。酶解反應(yīng)前后桑葉底物紅外譜圖反映出復(fù)合酶制劑在反應(yīng)過(guò)程中對(duì)桑葉結(jié)構(gòu)的破壞,即酶解反應(yīng)對(duì)活性物質(zhì)溶出的促進(jìn)作用。

圖5 桑葉底物紅外光譜分析

2.3.2 桑葉植物組織結(jié)構(gòu)形貌分析 實(shí)驗(yàn)采用SEM法對(duì)比未經(jīng)處理和經(jīng)酶解活化反應(yīng)后的桑葉粉末殘?jiān)谋砻嫖锵嘟Y(jié)構(gòu)變化,結(jié)果如圖6所示。由圖6(a)可知,未經(jīng)處理的桑葉結(jié)構(gòu)完整致密,圖6(b)可知經(jīng)酶解活化后的桑葉表面受到一定程度的破壞,組織結(jié)構(gòu)疏松空隙明顯增大,且出現(xiàn)眾多孔洞,說(shuō)明復(fù)合酶對(duì)植物組織有破壁作用,新增的不規(guī)則空隙減少天然產(chǎn)物溶出的阻力,進(jìn)而提高其溶浸量。

圖6 桑葉SEM掃描圖片

2.3.3 黃酮類物質(zhì)破壁溶出作用解析 經(jīng)過(guò)均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化得到的適宜酶解浸提條件下逐次增大反應(yīng)底物的量由A1到A7(1,2,3,4,5,6,7 g),以期找到該條件下一定量復(fù)合酶的最大破壁效率。以各黃酮類物質(zhì)的濃度增量為縱坐標(biāo),參加反應(yīng)的底物增量為橫坐標(biāo)繪制趨勢(shì)變化圖,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。由圖知各黃酮類物質(zhì)在A5-A4點(diǎn)之前的增量趨勢(shì)線都是呈上升,說(shuō)明該點(diǎn)為復(fù)合酶酶解破壁的最大效用點(diǎn),即0.675 g復(fù)合酶在35 ℃下、30 min內(nèi)對(duì)4 g桑葉粉進(jìn)行酶解破壁作用效果最好。而后面兩個(gè)點(diǎn)的增量仍不穩(wěn)定,甚至在A7-A6點(diǎn)處出現(xiàn)了驟然上升的趨勢(shì),這是因?yàn)榇祟愄烊换钚援a(chǎn)物極性較大,通過(guò)相似相容原理也能被反應(yīng)體系中乙醇部分溶出[27]。所以針對(duì)酶解破壁的效率來(lái)說(shuō),此酶解條件下最佳酶料比為0.169∶1,復(fù)合酶能夠高效快速的破壞細(xì)胞壁,使細(xì)胞質(zhì)溶出,分解蛋白質(zhì)、淀粉和果膠等雜質(zhì),提高目標(biāo)成分的提取效率[28]。

圖7 黃酮類物質(zhì)溶浸隨底物質(zhì)量變化的影響

3 結(jié)論