李翠新，何 德，孟德中

(西南林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650224)

輕木(OchromalagopusSwartz)又名百色木，為木棉科常綠喬木，是世界上最速生的樹種之一，是世界上最輕的商品木材，原產(chǎn)于南美洲的赤道熱帶地區(qū)，厄瓜多爾輕木的產(chǎn)量占世界首位[1].輕木木材的性質(zhì)決定了木材的用途，可用于航天、航海等領(lǐng)域，也可在工業(yè)及民用領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，如模型制造和風(fēng)力發(fā)電機(jī)葉片等的用材[2].我國(guó)適合輕木生長(zhǎng)的環(huán)境現(xiàn)僅局限于云南、臺(tái)灣、海南等少數(shù)省份，而由于臺(tái)風(fēng)的關(guān)系，僅云南西雙版納地區(qū)引種栽培較成功[3].我國(guó)所需輕木大多來自厄瓜多爾，市場(chǎng)多被美國(guó)壟斷，因此輕木國(guó)產(chǎn)化已迫在眉睫.但輕木的自然繁殖速度慢，種子繁殖率又極低，后代變異較大，導(dǎo)致國(guó)內(nèi)輕木缺口很大.

植物組織培養(yǎng)是20世紀(jì)初興起的一項(xiàng)高新生物技術(shù)，是在細(xì)胞全能性基礎(chǔ)上發(fā)展而來，具有在不受其他干擾的情況下研究被培養(yǎng)部分的生長(zhǎng)和分化規(guī)律的優(yōu)點(diǎn)，且取材少，短生長(zhǎng)周期內(nèi)通過人為控制培養(yǎng)條件可得到大量繁殖[4-5].相較于草本植物的組織培養(yǎng)[6-7]而言，木本植物的快繁要更困難[8]，但也積累了豐富的研究經(jīng)驗(yàn).近年來，在許多木本植物上，如刺楸[9]、酸棗[10]、北美海棠[11]、桃樹[12]、荔枝[13]等植物的離體再生技術(shù)的研究上都取得了重要的研究成果.但輕木的組培快繁研究在國(guó)內(nèi)外還未見報(bào)道.獲得輕木的植物再生系統(tǒng)將有助于輕木在我國(guó)推廣種植，對(duì)維護(hù)種植資源、改善森林生態(tài)環(huán)境、保障國(guó)民經(jīng)濟(jì)持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義.

1 材料和方法

1.1 材料

輕木種子購(gòu)自云南省中國(guó)科學(xué)院西雙版納植物園.

1.2 方法

1.2.1 種子發(fā)芽處理 將輕木種子置于65 ℃熱水中處理，直至水溫自然降溫至25 ℃，繼續(xù)維持25 ℃浸泡24 h.移入超凈工作臺(tái)用75%的乙醇浸泡1 min，無(wú)菌水沖洗2～3次，再用0.1% HgCl2浸泡15 min，消毒完成后再用無(wú)菌水沖洗5次，每次不少于3 min，最后將處理后的種子接種到未添加激素的MS空白培養(yǎng)基中，每瓶接1～2顆種子.待種子發(fā)芽展開4～5片葉片，以葉片作為外植體進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo).

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo) 取在無(wú)菌條件下種子萌發(fā)生長(zhǎng)的葉片，在無(wú)菌條件下將葉片切成約 0.5 cm2的小塊，接種在添加不同質(zhì)量濃度的6-BA培養(yǎng)基上，進(jìn)行葉片愈傷組織的誘導(dǎo).誘導(dǎo)培養(yǎng)基：1號(hào)(MS+0.5 mg/L 6-BA)，2號(hào)(MS+0.3 mg/L 6-BA)，3號(hào)(MS+0.1 mg/L 6-BA).MS培養(yǎng)基均含蔗糖3%，卡拉膠0.5%，pH均為5.8.每個(gè)處理15瓶，每瓶接種葉片3～4片，培養(yǎng)30 d后觀察并統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)情況.

1.2.3 不定芽誘導(dǎo)及繼代增殖 愈傷組織在上述最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基1號(hào)上轉(zhuǎn)接2～3次后進(jìn)行不定芽誘導(dǎo).以1號(hào)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，加入不同質(zhì)量濃度的TDZ和NAA，配制5種增殖培養(yǎng)基：5號(hào)(MS+0.5 mg/L 6-BA)即為上述的1號(hào)培養(yǎng)基，6號(hào)(MS+0.5 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA)，7號(hào)(MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA)，8號(hào)(MS+0.5 mg/L 6-BA+0.02 mg/L TDZ+0.005 mg/L NAA)，9號(hào)(MS+0.5 mg/L BA+0.02 mg/L TDZ+0.008 mg/L NAA).每個(gè)處理15瓶，每瓶接種愈傷組織3個(gè)，45 d后根據(jù)誘導(dǎo)的不定芽數(shù)計(jì)算增殖系數(shù).在篩選出的最佳培養(yǎng)基上再不斷進(jìn)行繼代增殖.

1.2.4 壯苗和生根 繼代增殖產(chǎn)生的不定芽進(jìn)行芽叢切割后，用MS空白培養(yǎng)基進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，然后以1/2 MS為生根的基本培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)不同質(zhì)量濃度的NAA和TDZ，篩選最佳生根培養(yǎng)基.配置生根培養(yǎng)基為：10號(hào)(1/2 MS+0.02 mg/L TDZ+0.005 mg/L NAA)，11號(hào)(1/2 MS+0.01 mg/L TDZ+0.005 mg/L NAA)，12號(hào)(1/2 MS+0.02 mg/L TDZ+0.008 mg/L NAA)，13號(hào)(1/2 MS+0.005 mg/L NAA)，14號(hào)(1/2 MS+0.08 mg/L NAA).每個(gè)處理20瓶，每瓶接種1～2個(gè)再生苗，30 d后統(tǒng)計(jì)生根率及生長(zhǎng)情況.

2 結(jié)果與分析

2.1 種子發(fā)芽率

用于試驗(yàn)的輕木種子共計(jì)201粒，在MS空白培養(yǎng)基上能發(fā)芽的僅36粒，發(fā)芽率為17.9%，輕木種子發(fā)芽困難，發(fā)芽率比較低，利用種子發(fā)芽來獲得大量輕木實(shí)生苗存在難度.種子發(fā)芽情況如圖1所示.

圖1 輕木種子發(fā)芽情況Fig.1 Seed germination of Ochroma lagopus

2.2 葉片愈傷組織的誘導(dǎo)

將輕木種子萌發(fā)生長(zhǎng)出的葉片切成約0.5 cm2的小塊，接種到3種不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10 d后，葉片的切口邊緣開始向外翹卷，開始出現(xiàn)少量白色愈傷組織，18 d開始大量白色愈傷組織，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，愈傷組織逐漸從白色變成綠色，30 d統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)情況，3種培養(yǎng)基誘導(dǎo)葉片愈傷組織情況如表1和圖2所示.由表1可以看出，添加不同質(zhì)量濃度6-BA的培養(yǎng)基，其葉片愈傷組織數(shù)顯著不同，其中愈傷組織誘導(dǎo)率隨著6-BA濃度的增加而增大.在1號(hào)培養(yǎng)基上愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)83.3%，其誘導(dǎo)的愈傷組織表面濕潤(rùn)，質(zhì)地疏松.而在3號(hào)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)效果最差，其愈傷組織誘導(dǎo)率僅為31.0%.本試驗(yàn)得出1號(hào)培養(yǎng)基MS+0.5 mg/L 6-BA為輕木的最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基.

圖2 葉片外植體形成愈傷組織Fig.2 Callus formation from leaf explants

表1 不同培養(yǎng)基對(duì)輕木葉片愈傷組織誘導(dǎo)Tab.1 Callus induction from leaves of Ochroma lagopus in different media

2.3 葉片愈傷組織不定芽誘導(dǎo)及繼代增殖培養(yǎng)基的篩選

在最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，調(diào)節(jié)NAA和TDZ的質(zhì)量濃度，進(jìn)行愈傷組織不定芽的誘導(dǎo).培養(yǎng)15 d左右，5種培養(yǎng)基上的愈傷組織仍繼續(xù)增殖，并伴有少量不定芽的產(chǎn)生.經(jīng)過45 d的培養(yǎng)，通過統(tǒng)計(jì)每種培養(yǎng)基上不定芽總數(shù)，發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)不定芽的結(jié)果不同，不定芽誘導(dǎo)結(jié)果如表2所示.其中5號(hào)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，6號(hào)和7號(hào)培養(yǎng)基中只添加有不同質(zhì)量濃度的NAA.在5、6、7號(hào)3種培養(yǎng)基上，每塊愈傷組織均能分化出不定芽，但不定芽增殖系數(shù)平均值1.1左右，分化能力均較弱.比較6～9號(hào)培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)，增加NAA質(zhì)量濃度，不定芽的分化數(shù)下降，添加TDZ，有助于不定芽的分化.在8號(hào)和9號(hào)培養(yǎng)基中調(diào)節(jié)了NAA和TDZ的質(zhì)量濃度，在8號(hào)培養(yǎng)基中，愈傷組織分化不定芽數(shù)增殖系數(shù)3.48，不定芽長(zhǎng)勢(shì)好(如圖3所示)；比較得出8號(hào)培養(yǎng)基(MS+0.5 mg/L 6-BA+0.02 mg/L TDZ+0.005 mg/L NAA)為最優(yōu)愈傷組織不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基.將帶芽愈傷組織塊切割成2 cm2左右的小塊，接種在篩選出的8號(hào)培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)45 d，芽叢進(jìn)一步繼代增殖.

表2 不同培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織不定芽的誘導(dǎo)Tab.2 Induction of adventitious buds from callus in different media

2.4 生根培養(yǎng)基的篩選

將繼代增殖生長(zhǎng)的芽叢切割后用MS空白培養(yǎng)基進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，幼苗長(zhǎng)勢(shì)良好，莖稈粗壯且伸長(zhǎng)明顯，葉片伸展開，顏色綠而且葉片較大.在壯苗培養(yǎng)過程中，幼苗的基部繼續(xù)長(zhǎng)出少量愈傷組織，有可能是因植株中殘存激素造成的影響(如圖4所示).將壯苗后的不定芽再次從基部切苗后接種到不同的生根培養(yǎng)基10～14號(hào)中，培養(yǎng)14 d后開始有根萌出.繼續(xù)培養(yǎng)16 d后統(tǒng)計(jì)生根情況，結(jié)果如表3所示，在13號(hào)和14號(hào)培養(yǎng)基中沒有添加TDZ，只添加NAA時(shí)，苗木的生根情況好于添加了NAA和TDZ的培養(yǎng)基10～12號(hào)，并且隨著NAA質(zhì)量濃度的加大，生根率也有適當(dāng)提高.14號(hào)培養(yǎng)基生根率達(dá)82.1%，有多條長(zhǎng)的白色主根，須根數(shù)量也較多，在苗根部切口仍有少量愈傷組織產(chǎn)生(如圖5所示).

圖4 不定芽的壯苗培養(yǎng) 圖5 14號(hào)培養(yǎng)基上的輕木生根苗 Fig.4 Strong seedling culture of adventitious buds Fig.5 Rooting seedling of Ochroma lagopus on No.14 medium

在前期使用MS培養(yǎng)基壯苗時(shí)并不能誘導(dǎo)苗根的分化，原因可能是無(wú)機(jī)鹽濃度過高或是鹽中毒.當(dāng)使用1/2 MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基時(shí)生根情況明顯好轉(zhuǎn).在本次設(shè)計(jì)的五種生根培養(yǎng)基中，14號(hào)培養(yǎng)基1/2 MS+0.008 mg/L NAA為最適的生根培養(yǎng)基.

表3 生根培養(yǎng)基中生根結(jié)果
Tab.3 Rooting results in rooting medium

編號(hào)NAA質(zhì)量濃度/(mg·L-1)TDZ質(zhì)量濃度/(mg·L-1)接種數(shù)生根苗數(shù)生根率/%生根狀況描述100.0050.0220840.01條短小白色主根,須根少.110.0050.01251144.01條短小白色主根,須根少.120.0080.02261142.3多條短小白色主根,須根少.130.0050.00241666.7多條較長(zhǎng)的白色主根,須根數(shù)目較多.140.0080.00282382.1多條長(zhǎng)的白色主根,須根數(shù)目較多.

3 結(jié)論與討論

由于輕木生長(zhǎng)的環(huán)境現(xiàn)僅局限于云南、臺(tái)灣、海南等少數(shù)省份，直接獲取輕木植株的組織進(jìn)行組培研究比較困難.本研究利用輕木種子發(fā)芽長(zhǎng)葉后，以葉片作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，解決了輕木取材難的問題.

以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，主要研究了不同質(zhì)量濃度的6-BA對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織的影響.愈傷組織誘導(dǎo)率隨著6-BA濃度增加而增大，最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA，誘導(dǎo)率最高，達(dá)83.3%.誘導(dǎo)培養(yǎng)基中能添加的6-BA最大質(zhì)量濃度，還需要進(jìn)一步試驗(yàn).

以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，只添加有不同質(zhì)量濃度的NAA，愈傷組織分化能力均較弱.調(diào)節(jié)NAA和TDZ的質(zhì)量濃度誘導(dǎo)愈傷組織不定芽，培養(yǎng)基MS+0.5 mg/L 6-BA+0.02 mg/L TDZ+0.005 mg/L NAA誘導(dǎo)的不定芽數(shù)最多，長(zhǎng)勢(shì)好，增殖系數(shù)達(dá)3.48，添加激素TDZ有利于不定芽的分化.

在生根試驗(yàn)過程中，利用1/2 MS做基礎(chǔ)培養(yǎng)基，減少了因無(wú)機(jī)鹽濃度過高引起的鹽中毒.在1/2 MS培養(yǎng)基中只添加NAA，有利于生根，且隨著NAA質(zhì)量濃度的加大，生根率也有適當(dāng)提高，試驗(yàn)設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基1/2 MS+0.008 mg/L NAA生根率最高，達(dá)82.1%.繼續(xù)增加NAA的質(zhì)量濃度，能否有利于生根率，還需要進(jìn)一步的試驗(yàn).

本試驗(yàn)成功獲得了輕木的組織培養(yǎng)生根苗，是國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道有關(guān)輕木的組織培養(yǎng)，既滿足市場(chǎng)對(duì)輕木苗木的需求提供了技術(shù)支持，也為今后輕木國(guó)產(chǎn)化、產(chǎn)業(yè)化以及發(fā)展利用提供了一定基礎(chǔ)研究.