張繼光，吳萬富，呂世懂*

1(昆明市糧油飼料產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)中心，云南 昆明，650118)2(云南省糧油產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站，云南 昆明，650118)3(云南昆明國家糧食質(zhì)量監(jiān)測(cè)站，云南 昆明，650118)

茶籽主要包括油茶(CamelliaoleiferaAbel.)樹和茶樹(CamelliasinensisO.ktze)的種子，均屬于茶科(Theacease)、山茶屬(Camellia)多年生木本油料植物。油茶和茶樹在我國的分布較廣泛，長(zhǎng)江以南的地區(qū)分布居多，比如湖南、江西，云南、貴州，四川、浙江等地[1-2]。茶籽油主要是從油茶樹和茶葉樹的種子中提取出來的，油茶樹的種子制取的油叫做油茶籽油，茶葉樹的種子制取的油叫做茶葉籽油。油茶籽油中油酸和亞油酸等不飽和脂肪酸含量高達(dá)80%以上，與橄欖油的脂肪酸組成及含量較接近；而茶葉籽油是近幾年興起的一種特色植物油，其營養(yǎng)成分豐富，含有茶多酚、維生素E、甾醇、山茶苷等多種活性成分，不飽和脂肪酸含量也較高。由于茶葉籽油產(chǎn)量低，營養(yǎng)價(jià)值豐富，被稱為“油黃金”。由于油茶籽油和茶葉籽油都是通過山茶屬的植物種子制取而來，因此在大多數(shù)報(bào)道中，經(jīng)常把2種油都統(tǒng)稱為茶籽油，實(shí)際上它們是有所區(qū)別的，由于受產(chǎn)量和營養(yǎng)成分等的影響，2種茶籽油在價(jià)格上也存在一定的差異，同時(shí)這2種茶籽油在外包裝產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)識(shí)上還存在著混淆，本來是油茶籽油的，執(zhí)行的卻是茶葉籽油標(biāo)準(zhǔn)，反之亦然，所以2種茶籽油在研究和生產(chǎn)中還存在問題。

脂肪酸為油脂的主要成分，包括“飽和”與“不飽和”脂肪酸，在很大程度上決定著油脂的性質(zhì)[6]。模式識(shí)別分析方法是將數(shù)學(xué)和計(jì)算機(jī)應(yīng)用于化學(xué)的一門新興的交叉學(xué)科，對(duì)化學(xué)實(shí)驗(yàn)所獲得的大量數(shù)據(jù)進(jìn)行歸類和篩選，揭示隱含于這些數(shù)據(jù)中的規(guī)律，從中提取有用信息來說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果，已被廣泛應(yīng)用于各種不同產(chǎn)地和類型食品的判別分析。其中應(yīng)用較多的主要包括主成分分析、聚類分析和偏最小二乘判別分析[7-11]。

目前，基于脂肪酸組成對(duì)茶葉籽油和油茶籽油進(jìn)行模式識(shí)別分析方法的研究報(bào)道還較少。本研究結(jié)合油茶籽油和茶葉籽油的脂肪酸組成及含量，利用模式識(shí)別分析方法進(jìn)行判別分析，并找出能區(qū)分它們的關(guān)鍵脂肪酸，以期為其鑒定提供理論和技術(shù)指導(dǎo)，同時(shí)為山茶屬油料作物的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)，也為其他不同類型油脂的區(qū)分與比較提供分析手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

7種茶葉籽油(編號(hào)A1-A7)和7種油茶籽油(編號(hào)B1-B7)購于不同生產(chǎn)廠家，均為成品油，生產(chǎn)年份均為2019年，詳細(xì)信息見表1。

表1 茶葉籽油和油茶籽油樣品信息Table 1 The sample information of camellia seed oils and oil-tea camellia seed oils

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品和試劑

37種脂肪酸甲酯混標(biāo),美國Sigma公司,異辛烷、NaSO4、KOH、甲醇均為分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;KHSO4(分析純)，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;KOH甲醇溶液(2 mol/L)的配制方法：將13.1 g KOH溶于 100 mL甲醇中，輕微加熱，加入無水Na2SO4干燥，過濾，即得澄清溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

Trace 1310氣相色譜儀〔配有氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)及Chromeleon7數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)〕,美國Thermofisher Scientific公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 脂肪酸組成的測(cè)定

脂肪酸組成的測(cè)定按照GB 5009.168—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪酸的測(cè)定》第三法進(jìn)行[12]。實(shí)驗(yàn)具體過程：稱取油脂樣品 60.0 mg 至10 mL玻璃離心管中，加入 4 mL 異辛烷溶解油樣，緊接著加入200 μL KOH甲醇溶液，蓋上塞子，在渦旋混勻器上猛烈振搖30 s后靜置至澄清。加入1 g KHSO4，在渦旋振蕩器上充分混搖，待上清液澄清后，將上層溶液過0.22 μm的尼龍膜后移入進(jìn)樣瓶上機(jī)測(cè)定。茶籽油中脂肪酸的含量按公式(1)計(jì)算:

(1)

式中：Yi，試樣中某個(gè)脂肪酸占總脂肪酸的百分比，%；ASi，試樣測(cè)定液中各脂肪酸甲酯的峰面積；FFAMEi-FAi，脂肪酸甲酯i轉(zhuǎn)化成脂肪酸的系數(shù)(詳見GB 5009.168—2016[12]的附錄D)；∑ASi，測(cè)定出來的所有脂肪酸甲酯的峰面積之和。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：TR-FAME柱(100 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱溫箱：初始溫度100 ℃， 保持0.2 min，然后以2 ℃/min 升到240 ℃，保持 15 min；載氣為高純氮?dú)?(純度 99.999%)；流速 0.7 mL/min。進(jìn)樣口為SSL進(jìn)樣口，溫度為240 ℃，進(jìn)樣為分流模式，分流比為100∶1；檢測(cè)器溫度250 ℃，氫氣 35 mL/min，空氣 350 mL/min，尾吹氣氮?dú)?0 mL/min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品的脂肪酸組成的數(shù)據(jù)均重復(fù)測(cè)定2次，均以平均值表示，雙試驗(yàn)誤差應(yīng)在GB 5009.168—2016[12]規(guī)定的誤差范圍內(nèi)。顯著性差異分析(獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，P≤0.05)使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，模式識(shí)別分析方法采用SIMCA-P15 (Umetrics, Sweden)軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種茶籽油脂肪酸成分分析

按照1.3小節(jié)的方法和條件，分別對(duì)14個(gè)樣品的脂肪酸組成進(jìn)行分析，其中37種脂肪酸甲酯混標(biāo)的色譜圖如圖1所示，茶葉籽油和油茶籽油脂肪酸組成的色譜圖如圖2和圖3所示，脂肪酸組成的測(cè)定結(jié)果和統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見表2。

圖1 37種脂肪酸甲酯混標(biāo)的氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatograms of 37 mixed fatty acid methyl esters

圖2 茶葉籽油(編號(hào)A1)脂肪酸甲酯的氣相色譜圖Fig.2 The gas chromatogram of fatty acid methyl esters in the Camellia seed oil (No. A1)

圖3 油茶籽油(編號(hào)B1)脂肪酸甲酯的氣相色譜圖Fig.3 The gas chromatogram of fatty acid methyl esters in the oil-tea Camellia seed oil (No.B1)

由圖1可知，37種脂肪酸甲酯均能實(shí)現(xiàn)良好分離，說明所使用的儀器條件是可行的。由表2可知，在14種茶籽油中共檢出脂肪酸14種，主要為油酸、亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞麻酸、花生一烯酸等，其中油酸和亞油酸的含量最高，兩者之和分別占茶葉籽油脂肪酸總含量的80.2%和油茶籽油總含量的89.1%。發(fā)現(xiàn)2種不同類型的茶籽油在脂肪酸組成上較為接近，但在脂肪酸含量上具有差異性，主要表現(xiàn)在油酸、亞油酸、棕櫚酸等有較大的差異。另外，7個(gè)油茶籽油均沒有檢出豆蔻酸，而7個(gè)茶葉籽油中也均沒有檢出二十四烷酸，當(dāng)然這2種脂肪酸并不是各自特有的特征脂肪酸，因?yàn)樗鼈兊暮刻停以谝恍┎枞~籽油也沒有檢出豆蔻酸，而在一些油茶籽油中也沒有檢出二十四烷酸。茶葉籽油中亞油酸平均含量為20.2%，明顯高于油茶籽油(8.78%)，而油茶籽油中油酸的平均含量為80.3%，明顯高于茶葉籽油(60.0%)。除了油酸和亞油酸，棕櫚酸、十七烷酸、硬脂酸、花生一烯酸和二十四碳一烯酸也具有顯著差異。

2.2 基于茶葉籽油和油茶籽油的化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

2.2.1 PCA和CA

PCA是將多個(gè)變量通過線性變換選出較少個(gè)數(shù)重要變量的一種多元統(tǒng)計(jì)分析方法，它研究的是如何通過少數(shù)幾個(gè)主成分來揭示多個(gè)變量間的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，即從原始變量中導(dǎo)出少數(shù)幾個(gè)主成分，使它們盡可能多地保留原始變量的信息，且彼此間互不相關(guān)[13-14]。CA又稱群分析，是根據(jù)“物以類聚”的道理，對(duì)樣品或指標(biāo)進(jìn)行分類的一種多元統(tǒng)計(jì)分析方法，討論的對(duì)象是大量的樣品，要求能合理地按各自的特性來進(jìn)行分類，沒有任何模式可供參考或依循，即是在沒有經(jīng)驗(yàn)知識(shí)的情況下進(jìn)行的[15-17]。將茶籽油的脂肪酸含量表(表2)輸入多元統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件中進(jìn)行分析，得到主成分得分圖如圖4所示，各變量載荷圖如圖5所示，聚類分析結(jié)果如圖6所示。

表2 七種茶葉籽油和七種油茶籽油脂肪酸組成測(cè)定結(jié)果 單位：%Table.2 The test results of fatty acid composition in seven Camellia seed oils and seven oil-tea Camellia seed oils

圖4 茶葉籽油和油茶籽油的主成分得分圖Fig.4 PCA score scatter plot of the Camellia seed oils and oil-tea Camellia seed oils

由圖4可知，油茶籽油和茶葉籽油之間有一個(gè)明顯的區(qū)分，油茶籽油聚在了左邊，而茶葉籽油聚在了右邊。從圖6可知，2種茶油實(shí)現(xiàn)了各自的聚類，這說明基于2種茶籽油中的脂肪酸含量，通過PCA和CA可以實(shí)現(xiàn)這2種茶油的區(qū)分。由圖5可知，所有變量都比較分散，難以發(fā)現(xiàn)有價(jià)值的信息。因此，利用正交偏最小二乘判別分析(orthofonal partial least squares dissromination analysis,OPLS-DA)來進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖5 基于主成分分析的茶葉籽油和油茶籽油脂肪酸變量載荷圖Fig.5 Loading plot of 14 fatty acids utilized from PCA in the Camellia seed oils and oil-tea Camellia seed oils

圖6 茶葉籽油和油茶籽油的聚類得分圖Fig.6 The cluster score plot of Camellia seed oils and oil-tea Camellia seed oils

2.2.2 OPLS-DA

不同于PCA和CA的分析方法，OPLS-DA是一種有監(jiān)督的模式識(shí)別方法，在基于對(duì)樣品進(jìn)行人為分組的基礎(chǔ)上，通過建立變量與樣品類別之間的關(guān)系模型，來實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品類別的預(yù)測(cè)以及進(jìn)一步挖掘變量的手段[18-20]。在PCA模型的基礎(chǔ)上，創(chuàng)建了OPLS-DA模型，得到判別分析的得分圖和S-plot圖，如圖7和圖8所示。

由圖7可知，OPLS-DA得分圖可以區(qū)分2種茶油，且聚類效果優(yōu)于PCA。圖8可知，S形的兩個(gè)角的變量可能是2種不同茶油中的典型脂肪酸成分差異物。其中變量6、變量7、變量2等，也就是油酸、亞油酸和棕櫚酸等可能分類貢獻(xiàn)較大。為了具體的看出每一種脂肪酸成分的貢獻(xiàn)，在放大實(shí)驗(yàn)次數(shù)為200的情況下，進(jìn)行2組變量的VIP預(yù)測(cè)值分析，得到VIP圖(圖9)，導(dǎo)出的VIP數(shù)值表，預(yù)測(cè)值的結(jié)果如表3所示。

圖7 基于OPLS-DA的茶葉籽油和油茶籽油的得分圖Fig.7 The OPLS-DA of score scatter plot in the Camellia seed oils and oil-tea Camellia seed oils

圖8 基于OPLS-DA變量的S-plot圖Fig.8 The OPLS-DA of S-plot of 14 fatty acids in the Camellia seed oils and oil-tea Camellia seed oils

圖9 茶葉籽油和油茶籽油的14種脂肪酸VIP預(yù)測(cè)值圖Fig.9 The VIP predicted values plot of 14 fatty acids in the Camellia seed oils and oil-tea Camellia seed oils

通常情況下，當(dāng)VIP值>1時(shí)，說明這些化合物可能是導(dǎo)致不同組差異的關(guān)鍵化合物。通過圖9和表3的VIP值發(fā)現(xiàn)油酸、亞油酸、棕櫚酸、十七烷酸、硬脂酸、花生一烯酸和二十四碳一烯酸的VIP預(yù)測(cè)值均大于1，說明這幾種脂肪酸可能是2組茶油中差異較大的化合物，對(duì)它們的區(qū)分起到了關(guān)鍵的作用，同時(shí)這一結(jié)果也和統(tǒng)計(jì)學(xué)T檢驗(yàn)所得到的結(jié)果相吻合。

表3 茶葉籽油和油茶籽油脂肪酸組成統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果Table 3 Statistical analysis results of fatty acid Composition in Camellia seed oils and oil-tea Camellia seed oils

3 結(jié)論

本研究利用氣相色譜法對(duì)茶葉籽油和油茶籽油的脂肪酸組成進(jìn)行了定量分析，并進(jìn)一步利用模式識(shí)別分析方法對(duì)這2種茶籽油進(jìn)行判別分析，以挖掘差異性脂肪酸成分。結(jié)果表明,在14種茶油中檢出14種脂肪酸，共有脂肪酸成分12種，主要為油酸、亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞麻酸等。經(jīng)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，2種茶籽油在脂肪酸組成上基本一致，但在含量上存在差異，主要表現(xiàn)在油酸和亞油酸有較大的差異，這主要與它們來源于不同種的茶樹有關(guān)。利用PCA、CA和OPLS-DA技術(shù)，2種茶籽油能實(shí)現(xiàn)較好的區(qū)分，并通過進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)油酸、亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸等7種脂肪酸可能是導(dǎo)致2種茶油實(shí)現(xiàn)區(qū)分的關(guān)鍵特征物。下一步實(shí)驗(yàn)將增加樣品的采集量和分析指標(biāo)，對(duì)2種不同類型的茶籽油的差異進(jìn)行大樣本的數(shù)據(jù)研究，同時(shí)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，對(duì)其他關(guān)鍵差異信息進(jìn)行挖掘，以期為我國茶葉籽油的開發(fā)利用提供一定的理論參考。