翟清燕，任易婕，鄭世超，霍勝楠*

1(山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南，250101)2(山東省食品藥品安全檢測工程技術研究中心，山東 濟南，250101)

植物蛋白飲料(plant protein beverage)是指以富含蛋白的植物果實、種子或果仁等為原料制成的飲料，近年來以“天然、健康、綠色、營養(yǎng)”的理念成為飲料市場的新興產(chǎn)品[1]。植物蛋白飲料種類繁多，根據(jù)配料表中的主要成分進行分類，包括豆奶(漿)、花生露(乳)和果仁露等，這些植物蛋白飲料含有豐富的營養(yǎng)成分，包含了人體所需的蛋白質、脂肪和微量元素等，具有獨特的風味，因而備受消費者的喜愛。但是一些不法商販由于經(jīng)濟利益的驅使，將低成本的植物原料摻入到產(chǎn)品中以次充好，比如在核桃乳中摻入價格遠遠低于核桃的大豆、花生等成分[2-3]，使其成本大大降低。這種制假、摻假的惡劣行為不僅會損害消費者的經(jīng)濟利益，還會對身體造成不同程度的損害。如果消費者對摻入的成分過敏，在不知情的情況下誤食后可能會產(chǎn)生過敏反應，甚至危及生命[4-5]。因此，植物源性飲料摻假問題需要食品安全監(jiān)管部門重點關注，通過有效預防植物蛋白飲料摻假，才能構建更加健康經(jīng)濟的食品安全環(huán)境。

目前，在檢測植物蛋白飲料摻假問題的方法中，分子生物學方法是較為重要的手段[6]，其中包括酶聯(lián)免疫技術[7]、DNA條形碼技術[8]、聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)和實時熒光定量PCR技術(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)[9]等。2017年7月，國家食品藥品監(jiān)督管理總局頒布了食品補充檢驗方法《植物蛋白飲料中植物源性成分鑒定(BJS 201707)》，為監(jiān)管植物蛋白飲料摻假的情況提供了重要技術保障[10]。

本研究試圖建立3種植物成分的實時熒光PCR檢測方法所需陽性質粒，用于核桃、花生和大豆成分的特異性檢測，并驗證其方法特異性和檢驗靈敏度，研究出一種準確、靈敏、高效的實時熒光PCR反應體系，解決植物蛋白飲料在日常監(jiān)管工作中缺乏標準物質的難題，為植物蛋白飲料摻假檢測提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

TaqManTMUniversal Master Mix Ⅱ, with UNG，App ied Biosystems公司； PrimeSTAR?HS DNA Polymerase，TaKaRa公司；BioReady rTa,Bioer公司；Qiagen DNeasy mericon Food Kit,Qiagen公司；核桃、花生、大豆的引物和探針序列均引自補充檢驗方法《植物蛋白飲料中植物源性成分鑒定(BJS 201707)》[10]，濟南博尚生物技術有限公司(Biosune)合成，見表1。

表1 實時熒光PCR檢測引物、探針Table 1 Specific primers and probes sequences in RT-qPCR

1.2 主要儀器

7500 FAST實時熒光PCR儀,美國 ABI 公司；NanoDrop 2000c生物紫外可見分光光度計,美國 Thermo Fisher公司；高速冷凍離心機,德國Eppendorf公司，生物安全柜,美國NuAire公司。

1.3 基因組DNA的提取

使用試劑盒Qiagen DNeasy mericon Food Kit 提取植物 DNA，使用 紫外可見分光光度計檢測 DNA 的濃度及質量，將 DNA 稀釋到 10～100 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 陽性質粒分子的構建

根據(jù)設計的PCR引物，選取核桃源性成分Jugr2基因、花生源性成分Arab2基因和大豆源性成分Lectin基因特異性序列，對這3種植物的基因組分別進行PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，再用膠回收試劑盒進行純化。將PCR純化產(chǎn)物與pMD19-T載體進行連接，然后將連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細胞中進行轉化，構建相應陽性質粒分子，序列合成由濟南博尚生物技術有限公司完成。

1.5 實時熒光PCR檢測

熒光PCR反應體系： PCR反應預混液12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，探針(10 μmol/L)1 μL，DNA模板(10～100 ng/μL)2 μL，用滅菌去離子水補足至總體積25 μL。熒光PCR反應程序為：50 ℃ 2 min；95 ℃ 15 min；40個循環(huán)(95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min)。

試驗結果用軟件ABI 7500 FAST Software v2.0.1進行分析，根據(jù)《植物蛋白飲料中植物源性成分鑒定(BJS 201707)》[10]中結果判定與表述部分，當擴增循環(huán)數(shù)(cycle threshold,Ct)≤35.0時，判定被檢樣品為陽性。

2 結果與分析

2.1 陽性質粒分子構建

為構建核桃、花生和大豆的特異性檢測標準分子，分別將核桃源性成分Jugr2基因、花生源性成分Arab2基因和大豆源性成分Lectin基因進行PCR擴增，再通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，上樣量為8 μL，每個樣品設置2個平行。由圖1可知，核桃Jugr2基因、花生Arab2、大豆Lectin基因長度分別為91、72和118 bp，將擴增片段克隆到pMD19-T載體上，從而得到3個標準質粒分子。

1, 2: 核桃Jugr2基因PCR擴增產(chǎn)物; M: DL500; 3, 4: 花生Arab2基因PCR擴增產(chǎn)物; 5, 6: 大豆Lectin基因PCR擴增產(chǎn)物圖1 核桃、花生和大豆PCR擴增瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of walnut, peanut and soybean amplified by PCR

2.2 陽性質粒分子的特異性

按照1.5的熒光PCR反應體系，熒光PCR反應模板分別為核桃、花生和大豆陽性質粒分子，同時做質量控制，以其對應的基因組DNA作為陽性對照，不含核桃、花生和大豆的DNA作為陰性對照，滅菌去離子水作為空白對照，進行陽性質粒分子特異性驗證。

由圖2的擴增曲線可知，植物基因組DNA、構建的陽性質粒分子均為陽性，核桃Jugr2基因及其陽性質粒分子的Ct值分別為21、13個循環(huán)；花生Arab2基因及其陽性質粒分子的Ct值分別為23、14個循環(huán)；大豆Lectin基因及其陽性質粒分子的Ct值分別為20、13個循環(huán)。陰性對照無增幅說明基因組間無交叉污染，空白對照無增幅說明反應體系無污染，因此構建的3種質粒分子均具有良好的特異性，可以作為陽性對照使用。

2.3 陽性質粒分子的靈敏度

將核桃、花生和大豆質粒分別進行10倍梯度稀釋，自質量濃度100 ng/μL稀釋至10-6ng/μL，使用稀釋后的質粒作為模板進行熒光PCR擴增，每個稀釋度設置3個平行，用于靈敏度的驗證，結果見圖3。

標準中規(guī)定當Ct值≤35時，判定結果為陽性，由圖2可知，3種陽性質粒分子的檢出限均可達到10-5ng/μL，具有較高的檢測靈敏度。還可發(fā)現(xiàn)，稀釋度越高平臺期越低，可能是由于質量濃度太低導致反應體系中形成大量引物二聚體，使引物很快消耗完，從而形成擴增曲線的平臺期很低。

a-核桃;b-花生;c-大豆圖2 陽性質粒分子特異性檢測圖Fig.2 Results of specificity of positive plasmid

2.4 標準曲線的繪制

將質粒DNA標準物質從質量濃度100 ng/μL稀釋至10-2ng/μL，使用稀釋后的質粒作為模板進行熒光PCR擴增，每個稀釋度設置3個平行，以質量濃度為橫軸，Ct值為縱軸，建立標準曲線(圖4)[11]。

以核桃、花生和大豆陽性質粒分子建立的標準曲線的擴增效率分別為93.299%、123.623%、132.975%，且相關線性系數(shù)R2均在0.99以上，實驗結果表明3種陽性質粒分子均具有良好的線性關系，可以作為陽性標準物質用于樣品的定量分析。

a-核桃;b-花生;c-大豆圖4 陽性質粒分子標準曲線Fig.4 Standard curve of positive plasmid

2.5 三種品牌PCR預混液對熒光PCR反應結果的影響

將3個陽性質粒分子從質量濃度100 ng/μL稀釋至10-6ng/μL，用10倍稀釋產(chǎn)物作為模板，選取Appied Biosystems、TaKaRa和Bioer三種品牌的PCR預混液對實時熒光PCR反應結果進行比較分析[12]，見圖5～圖7。

根據(jù)檢測結果可知，所有目的基因都可以在40個循環(huán)內得到典型的S型動力學曲線，曲線指數(shù)期增長明顯，擴增曲線平行性、重復性和PCR反應效率較好，相鄰濃度擴增曲線之間Ct值都十分接近，保證了定量結果的準確性[13]。

由圖5～圖7可知，利用Appied Biosystems、TaKaRa和Bioer三種品牌的PCR預混液分別進行實時熒光PCR反應，核桃陽性質粒的反應靈敏度分別為10-5、10-4和10-3ng/μL，花生陽性質粒的反應靈敏度分別為10-5、10-4和10-2ng/μL，大豆陽性質粒的反應靈敏度分別為10-5、10-4和10-3ng/μL。3種預混液的靈敏度略有不同，分析其原因可能是由于Appied Biosystems酶中含有尿嘧啶N糖基化酶(uracilN-glycosylase，UNG)[14]，能夠將脫氧尿嘧啶替換為胸腺嘧啶，以區(qū)分擴增產(chǎn)物和模板。在變性步驟前增加50 ℃保溫，使前面的擴增產(chǎn)物對尿嘧啶DNA糖基化酶(uracil-DNA glycocasylase,UDG)敏感，所以可處理以破壞殘余產(chǎn)物，起到防止殘留污染，防止非模板DNA的擴增，從而降低了假陽性率，保證其較高的靈敏度。

a-Appied Biosystem; b-TaKaRa; c-Bioer(下同)圖5 三種品牌PCR預混液實時熒光PCR反應效果比較(核桃)Fig.5 Comparation of the effective of real-time fluorescence PCR reaction of three commercial PCR premixed liquid (walnut)

圖6 三種品牌PCR預混液實時熒光PCR反應效果比較(花生)Fig.6 Comparation of the effective of real-time fluorescence PCR reaction of three commercial PCR premixed liquid (peanut)

圖7 3種品牌PCR預混液實時熒光PCR反應效果比較(大豆)Fig.7 Comparation of the effective of real-time fluorescence PCR reaction of three commercial PCR premixed liquid (soybean)

3 結論與討論

在應用熒光PCR技術進行植物源性成分檢測時，都需要陽性物質作為對照，確保實驗結果的有效性[15]。標準物質可以作為陽性對照，還可以繪制標準曲線用于樣品的定量分析，但考慮到目前我國用的標準物質大多購于國外，不僅價格昂貴，且品種少、貨期長，不能滿足日常檢驗的需求。為解決這一難題，本研究構建3種陽性質粒分子以代替基體標準物質，使其可不受原材料限制從而對植物源性成分進行檢測[16]。由于Jugr2基因、Arab2基因和Lectin基因分別是核桃、花生和大豆成分的內源基因，具有良好的穩(wěn)定性，因此選取這3種基因進行質粒的構建，同時驗證了其方法特異性和檢驗靈敏度。另外比較了不同品牌PCR預混液對反應效率的影響，研究發(fā)現(xiàn)3種品牌的PCR預混液均具有較高的靈敏度。本研究為熒光PCR反應液的選擇提供了技術依據(jù)，且陽性對照不再依賴于核桃、花生和大豆材料的供應，解決了食品監(jiān)管工作中缺乏陽性對照的難題，對于植物源性成分的鑒定具有重要意義和廣闊的應用前景。