趙佳豪，周韜，劉爽，石磊，王春玲*

1(天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津，300457)2(天津市利民調(diào)料有限公司，天津，300308)

隨著我國(guó)食品行業(yè)整體水平的提高，醬油產(chǎn)量增長(zhǎng)迅速，在2016年達(dá)到了1 000 萬(wàn)t，雖然產(chǎn)量大，但相較于日本醬油在國(guó)際市場(chǎng)的價(jià)格，中國(guó)醬油價(jià)格更低[1]。原因是日本醬油整體質(zhì)量水平比中國(guó)高，并在長(zhǎng)期的生產(chǎn)過(guò)程中形成了各個(gè)類(lèi)型的醬油，如濃口醬油、淡口醬油、溜醬油、白醬油等，且各具特色[2]。由于醬油的風(fēng)味主要來(lái)源于微生物和復(fù)合生物酶的協(xié)同作用所產(chǎn)生的可溶性小分子物質(zhì)，因此在醬油生產(chǎn)過(guò)程中從原料到生產(chǎn)工藝，都會(huì)導(dǎo)致醬油風(fēng)味的改變[3]。因此對(duì)比中日兩國(guó)醬油風(fēng)味差異，對(duì)提高中國(guó)醬油在國(guó)際市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力具有重要意義。

醬油的風(fēng)味由滋味和香味組成，滋味包括酸、甜、苦、咸、鮮5個(gè)方面。酸味主要來(lái)源于乳酸、乙酸等有機(jī)酸；甜味主要來(lái)源于原料中淀粉等大分子糖類(lèi)物質(zhì)的水解以及甜味游離氨基酸；苦味主要來(lái)自于蛋白質(zhì)分子水解產(chǎn)生的苦味氨基酸和食鹽中的MgSO4、MgCl2等；咸味主要來(lái)自于添加的食鹽，鮮味主要來(lái)源于鮮味氨基酸和醬油中的鮮味肽，分子質(zhì)量在1 000～5 000 Da的美拉德肽能夠提升風(fēng)味，提升醬油的鮮味、厚重感[4]。馮云子等[5]的研究表明，中日兩國(guó)醬油在非揮發(fā)性成分以及感官特性上具有顯著性差異，各種理化指標(biāo)的差異是導(dǎo)致中式和日式醬油在鮮味、厚味和甜味上差異的物質(zhì)基礎(chǔ)。香味主要由揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)貢獻(xiàn)，從醬油中已經(jīng)分離、鑒定出近300種風(fēng)味化合物。它們主要來(lái)源于曲霉發(fā)酵、酵母菌發(fā)酵、乳酸菌發(fā)酵和美拉德反應(yīng)。同時(shí)，醬油中香氣組成也取決于釀造原料、生產(chǎn)工藝以及參與發(fā)酵的微生物等因素，并且環(huán)境溫度、光照、壓力及環(huán)境污染物也會(huì)影響醬油香氣成分組成[6]。在中國(guó)醬油中起著關(guān)鍵作用且貢獻(xiàn)較大的特征性風(fēng)味成分主要是4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-羥基-2(5)-乙基-5(2)-甲基-3(2H)呋喃、3-甲硫基丙醇等。3-甲基丁烷、3-羥基-4,5-二甲基-2(5H)-呋喃酮、2-甲基丁烷、3-甲硫基丙醛被認(rèn)為是日本醬油中最重要的香氣成分，3-乙基-1,2-環(huán)戊二酮和2’-氨基苯乙酮在日本醬油中也被鑒定出[7]。通過(guò)比較中國(guó)醬油與日本醬油滋味和香味上的差異，有利于提高中國(guó)醬油整體品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原料

分別在日本和中國(guó)超市購(gòu)買(mǎi)4瓶日本醬油和3瓶中國(guó)醬油(7瓶醬油均是高鹽稀態(tài)工藝，且都達(dá)到特級(jí)醬油等級(jí))。

1.2 試劑

草酸、乳酸、琥珀酸、檸檬酸、丙酸、酒石酸、蘋(píng)果酸、富馬酸、甲酸和乙酸(均為AR)，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液(2.5 mol/mL)，Wako公司。

1.3 儀器與設(shè)備

GCMS-QP 2010 Ultra氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；KDN-O8B定氮儀，上海新家儀器有限公司；MULTISKAN GO酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技公司；LC-20A型高效液相色譜儀，日本島津公司；L-8900氨基酸分析儀，日本日立公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 常規(guī)理化指標(biāo)檢測(cè)

氨基酸態(tài)氮測(cè)定使用甲醛滴定法[8]；總酸、鹽度的測(cè)定方法依據(jù)GB/T 5009.39—2003；還原糖的測(cè)定方法根據(jù)GB 5009.7—2016。

全氮測(cè)定：稱0.2 g的CuSO4，3.0 g K2SO4和10 mL的濃H2SO4并加入10 mL 稀釋10倍的樣品液于消化管中，調(diào)節(jié)儀器溫度至260 ℃保持75 min,再將溫度調(diào)節(jié)至420 ℃保持135 min,直到反應(yīng)體系冷卻澄清，使用自動(dòng)凱氏定氮儀蒸餾5 min，餾出液用0.10 mol/L的HCl標(biāo)準(zhǔn)液滴定，直至顏色由藍(lán)變粉紅視為滴定結(jié)束，同時(shí)做空白的對(duì)照。

1.4.2 游離氨基酸的測(cè)定

食品中氨基酸的測(cè)定參考GB 5009.124—2016。

1.4.3 有機(jī)酸的測(cè)定

采用高效液相色譜分析醬油中的有機(jī)酸組成。色譜柱:C18;流動(dòng)相:質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% H3PO4溶液,流速0.6 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm;進(jìn)樣體積10 μL;柱溫 30 ℃;外標(biāo)峰面積定量。

1.4.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

醬油中風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定采用固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用(solid phase microextraction-gas chromatograph-mass spectrometry,SPME-GC-MS)的方法[9]。

1.5 分析方法

利用SPSS 18.1和SIMCA軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，利用Origin軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 醬油理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

氨基酸態(tài)氮是評(píng)價(jià)醬油質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。由表1可以看出，中國(guó)醬油氨基酸態(tài)氮含量顯著高于日本醬油(P<0.05)。在日式發(fā)酵工藝中，淀粉質(zhì)的原料比例要高于中式發(fā)酵，而淀粉酶能將淀粉質(zhì)原料分解成單糖、雙糖和五碳糖，因而增加了日本醬油中還原糖的含量[10-12]。鹽度、pH、總酸、全氮和還原糖在兩國(guó)醬油中沒(méi)有顯著差異。

表1 醬油常規(guī)理化指標(biāo)Table 1 General physical and chemical indexes of soy sauce

2.2 醬油中有機(jī)酸測(cè)定

有機(jī)酸也是評(píng)價(jià)醬油質(zhì)量的指標(biāo)之一，其種類(lèi)和含量直接影響醬油的品質(zhì)。有機(jī)酸能夠調(diào)節(jié)醬油pH和抑制有害微生物生長(zhǎng)，并且能對(duì)醬油口感起到緩沖作用。由表2可知，7瓶醬油中除草酸、富馬酸、丙酸外，其他7種有機(jī)酸均有檢出。乳酸和乙酸是主要的2種酸類(lèi)物質(zhì)，其含量之和能占到有機(jī)酸總量的35%以上[13]。乳酸能夠使醬油口感滑潤(rùn)綿長(zhǎng)，乙酸可以調(diào)和醬油中食鹽的咸味，讓其變得更爽口，并且乳酸與乙酸的比值越大，醬油的口感就越柔和[14-15]。表2可以看出，蘋(píng)果酸和檸檬酸含量較高，兩者同時(shí)存在時(shí)，可以使醬油口感更豐滿協(xié)調(diào)，并且二者對(duì)醬油香味方面也有正面影響[16]。

表2 醬油中的有機(jī)酸測(cè)定結(jié)果 單位：g/100 mLTable 2 The content of organic acids in soy sauce

2.3 醬油中游離氨基酸測(cè)定

游離氨基酸對(duì)醬油的滋味起著決定性作用，其主要是由蛋白酶和肽酶水解原料產(chǎn)生的[17]。由圖3可知，7瓶醬油中共檢測(cè)出16種游離氨基酸，其中包含人體必需氨基酸6種。根據(jù)世界衛(wèi)生組織規(guī)定，食物中人體必需氨基酸總量與總氨基酸的比值越接近40%越具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，中國(guó)醬油的比值為34.33%，日本醬油為33.55%。

中國(guó)與日本醬油中谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、精氨酸的含量存在顯著性差異(P<0.05)。谷氨酸是提供醬油鮮味的主要氨基酸，也是醬油樣品中含量最多的氨基酸之一，在天然釀造醬油中的占比約為18%～25%，其在兩國(guó)醬油中占比分別為25.34%和22.96%，因此可推斷醬油樣品中均未添加谷氨酸鈉增鮮劑[18]，與配料表相一致。甘氨酸和賴氨酸是呈甜味的氨基酸，能夠在一定程度上掩蓋不被接受的苦味。精氨酸、組氨酸異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和纈氨酸屬于苦味氨基酸，在兩國(guó)醬油中苦味氨基酸總量占到總氨基酸的29.93%和35.28%，雖然含量相對(duì)較高，但高鹽稀態(tài)醬油還是以鮮味和咸味為主，原因是醬油中的鹽、還原糖以及有機(jī)酸遮蓋了苦味的呈現(xiàn)，并且有些苦味氨基酸滋味閾值較高(如異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸)[5]，而且通過(guò)味覺(jué)重建實(shí)驗(yàn)，蛋氨酸和纈氨酸也被證明對(duì)醬油的鮮味具有一定貢獻(xiàn)[19]，因此苦味的呈現(xiàn)不明顯。

表3 醬油中的游離氨基酸測(cè)定結(jié)果 單位：g/100 gTable 3 The content of free amino acids in soy sauce

2.4 醬油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)結(jié)果分析

由圖1可知，日本醬油中醛、酸、酯、呋喃吡嗪和烴的種類(lèi)多于中國(guó)醬油,其中,烴類(lèi)物質(zhì)明顯多于中國(guó)醬油。烴是由原料中的不飽和脂肪酸在脂肪酶、脂肪氧化酶等作用下生成的，烴類(lèi)物質(zhì)雖然對(duì)醬油的風(fēng)味影響很小，但其進(jìn)一步分解成的小分子物質(zhì)是醬油復(fù)雜風(fēng)味的來(lái)源[20]。

圖1 中日醬油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類(lèi)Fig.1 Types of volatile flavor compounds in Chinese and Japanese soy sauce

由圖2可知，中國(guó)醬油(樣品1、2、3)分布在第二、三象限，而日本醬油(樣品4、5、6、7)分布在第一、四象限，表明中國(guó)醬油和日本醬油的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)存在明顯差異。

圖2 中日醬油風(fēng)味物質(zhì)PCA圖Fig.2 PCA diagrams of flavor compounds in Chinese and Japanese soy sayce

由圖3可知，苯乙醇、乙醇、鄰二甲苯、1,3-二乙基-苯是兩國(guó)醬油樣品的主要差異揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。在高鹽稀態(tài)醬油中，乙醇主要是酵母菌代謝產(chǎn)生[21]，苯乙醇則是由苯丙氨酸降解產(chǎn)生[22]，鄰二甲苯和1,3-二乙基-苯等芳香烴是由原料中的不飽和脂肪酸在脂肪酶、脂肪氧化酶等作用下生成。進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行200次假設(shè)驗(yàn)證，得到VIP(Var IDPrimary)預(yù)測(cè)值>1的差異揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共17個(gè)(表4)。中國(guó)醬油與日本醬油的差異揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)是由原料、發(fā)酵菌種及工藝的差異造成的。

圖3 中日醬油風(fēng)味物質(zhì)OPLS-DA圖Fig.3 OPLS-DA diagrams of flavor compounds in Chinaese and Japanses soy sance

表4 差異揮發(fā)性風(fēng)味成分氣味分類(lèi)Table 5 Odor classification of different volatile flavor components

由表4可知，差異揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共17個(gè)，包括3種酯類(lèi)、6種醇類(lèi)、1種醛類(lèi)和7種烴類(lèi)。香氣活性值(odor activity value, OAV)是評(píng)價(jià)香氣化合物重要性的指標(biāo)之一，OAV值>1則對(duì)樣品香氣組成有貢獻(xiàn)，OAV值越大，該香氣化合物貢獻(xiàn)越大。很多文獻(xiàn)也使用香味抽提物系數(shù)分析法(AEDA)方法來(lái)檢測(cè)香氣稀釋因子(flavor dilution factor，F(xiàn)D)，從而鑒定醬油中關(guān)鍵致香化合物，F(xiàn)D值越大對(duì)香氣貢獻(xiàn)越大。在差異揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中乙酸乙酯、2-苯乙醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、乙醇、2-甲基-1-丁醛在許多文獻(xiàn)中被證實(shí)具有很高的OAV和FD值，可為醬油提供花香、果香、酒香和麥芽香等氣味，因此這些物質(zhì)是造成兩國(guó)醬油香味差異的關(guān)鍵成分。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)中日兩國(guó)具有代表性的7瓶醬油樣品的檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn),中國(guó)醬油和日本醬油均都達(dá)到特級(jí)醬油標(biāo)準(zhǔn)，且中國(guó)醬油中氨基酸態(tài)氮明顯高于日本醬油；兩國(guó)醬油中的有機(jī)酸種類(lèi)含量不盡相同，其中草酸、富馬酸、丙酸在中日醬油中均未檢出，酒石酸在2瓶中國(guó)醬油里也未檢出；游離氨基酸中的谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、精氨酸在中國(guó)與日本醬油中的含量存在顯著性差異，以上奠定了滋味差異的物質(zhì)基礎(chǔ)；差異揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共17種，其中乙酸乙酯、2-苯乙醇、3-甲基-1-丁醇、乙醇、2-甲基-1-丁醛和2-甲基-1-丁醇是造成兩國(guó)醬油香味差異的關(guān)鍵成分。