王浩鵬,程俊俠,郭俊彤,張祺祺,楊娜,王凱杰,邵紅軍*
1(陜西師范大學(xué) 食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西 西安,710119)2(陜西省環(huán)境監(jiān)測中心站,陜西 西安,710043)
茶是世界上最古老、消費最廣泛的飲料,因其細膩的風(fēng)味和對健康有益的作用,越來越受公眾歡迎和科學(xué)界認可[1-3]。全球茶葉總消費量分別從2014年的508萬t、2015年的529萬t到2016年增至553萬t。大量證據(jù)表明,喝茶能降低癌癥、心血管疾病、糖尿病和帕金森病等慢性疾病的發(fā)病率[4-5]。這些有益作用在很大程度上歸功于茶多酚。茶多酚又稱為兒茶素,是由黃烷-3-醇上位于B環(huán)上的二或三羥基被取代或者A環(huán)的間5,7-二羥基被取代而形成,占茶葉干質(zhì)量的30%~42%[6]。茶多酚中最常見的單體成分有:兒茶素(catechin,C),沒食子兒茶素[(-)-gallocatechin, GC]、表沒食子兒茶素[(-)-epigallocatechin, EGC]、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)、表兒茶素(epicatechin, EC)、沒食子兒茶素沒食子酸酯[(-)-gallocatechin gallate, GCG]和表兒茶素沒食子酸酯[(-)-epicatechin gallate, ECG],其中以EGCG為主要成分,按質(zhì)量計可占總茶多酚的近50%。同時茶作為黃酮類成分的主要食物來源,美國成年人在1999~2002年和2007~2010年的黃酮總攝入量分別是164.4、155.9 mg/d[7]。同樣,茶是歐洲人群中總黃酮和黃酮單體類成分的主要來源(人均攝入量為66 mg/d)[8-9]。
傳統(tǒng)上,茶是通過將松散的茶葉或茶包單獨浸泡在水中或與其他物質(zhì)(例如牛奶或糖)一起浸泡而成。即飲(ready-to-drink,RTD)茶除了因其可替代沖泡茶的方便性外,還由于其口味多樣性、維生素含量高和甜味劑可以代替糖等優(yōu)點而廣受青睞[10]。RTD茶包括瓶裝茶和速溶茶,通常是用重構(gòu)噴霧干燥法使茶葉提取物變成粉末的形式生產(chǎn),或者是利用茶水提取物生產(chǎn)。根據(jù)最新數(shù)據(jù),全球RTD茶市場從2011年的260億升L幅增長到2016年的370億L,未來2021年將達到450億L。在中國,純茶飲料和果汁茶飲料2大類RTD茶已經(jīng)生產(chǎn)并被廣泛消費,消費量逐年遞增。
目前關(guān)于茶的大多數(shù)研究都集中在沖泡茶的化學(xué)成分、健康作用和消費上,RTD茶的相關(guān)信息較少。WATANABE等[11]報道,罐裝紅茶中的兒茶素含量低于日本罐裝綠茶。FLORES-MARTINEZ等[12]發(fā)現(xiàn),墨西哥現(xiàn)有RTD茶的化學(xué)特征、抗氧化活性差異很大。因此,本研究的目的是評估我國各種商業(yè)RTD茶的理化性質(zhì)、酚類成分和抗氧化活性,以及中國成年人每天從這些茶飲料中攝入的多酚含量。
研究用22種RTD茶均購自中國西安華潤萬家超市,均在保質(zhì)期內(nèi)且保存在實驗室黑暗和干燥的環(huán)境中。根據(jù)GB/T 21733—2008《茶飲料》,這些RTD茶可分為純茶飲料和果汁茶飲料,相應(yīng)的產(chǎn)品信息匯總見表1。
表1 二十二種茶飲料的標簽成分和零售價Table 1 Label ingredients and retail price of 22 tea beverages
福林酚試劑、VC、2,6-二氯靛酚、FeSO4、酒石酸鉀鈉四水合物,中國上海源葉生物技術(shù)有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、2,2’-聯(lián)氨-雙-(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽[2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid), ABTS]、 6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid, Trolox)、2,4,6-三(2-吡啶基)-s-三嗪[2,4,6-Tri(2-pyridyl)-s-triazine, TPTZ] 、K2S2O8、沒食子酸(gallic acid, GA)、沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、咖啡因(caffeine, CAF)、表兒茶素、沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯,美國Sigma-Aldrich Chemical 公司。除特殊說明外,所有化學(xué)藥品和溶劑均為分析純。
Multisken Go型全波長酶標儀,美國Thermo Electron公司;PAL-1 abbe折射儀,日本東京ATAGO公司;FE20 Plus pH計,中國上海梅特勒·托利多公司;手提或多功能色差儀,中國深圳3nh公司;U-9300型紫外可見分光光度計,日本HITICHI公司;U-3000型高效液相色譜儀,美國Thermo Fisher公司;Inertsil ODS-3反相HPLC色譜柱(內(nèi)徑4.6 mm×250 mm,5 μm),日本島津公司。
1.4.1 可溶性固形物、VC、pH和色值的測定
可溶性固形物使用PAL-1 abbe折射儀測定;VC采用2,6-二氯靛酚滴定法測定;pH使用FE20 Plus pH計測定。
色值(L*、a*和b*):色差計進行測量。使用a*和b*坐標值按公式(1)計算C*(色度),按公式(2)計算H*(色相角):
(1)
(2)
1.4.2 總糖含量(total sugar content,TSC)的測量
采用蒽酮比色法測定所研究茶飲料的總糖含量[13]。將100 μL稀釋的茶飲料與900 μL蒸餾水和5 mL蒽酮溶液(每100 mL體積分數(shù)66% H2SO4加入0.05 g蒽酮和1 g硫脲)混合。將混合物溶液在沸水浴中放置10 min,然后在流水中冷卻并在室溫下放置5 min。使用紫外可見分光光度計在620 nm波長處測量其吸光度。結(jié)果表示為每升茶飲料中的葡萄糖當量(glucose equivalent,GE)(在0~1 mg/mL線性范圍內(nèi),R2=0.996 5)。
1.4.3 總酚含量(total phenol content,TPC)的測定
用Folin-Ciocalteu方法(M1)和酒石酸鐵法(M2)分別測定茶飲料的總酚含量。茶飲料的TPC通過Folin-Ciocalteu方法測定[14]。沒食子酸用于制作標準曲線(y=1.141 8x+0.076 1,R2=0.997),結(jié)果表示為每升茶飲料中的沒食子酸當量(gallic acid equivalent,GAE)。
酒石酸鐵法測定茶飲料TPC采用GB/T 21733—2008《茶飲料》的標準方法[15]。將茶葉樣品(1~4 mL)與5 mL染色溶液(0.1 g FeSO4和0.5 g酒石酸鉀鈉四水合物溶于100 mL蒸餾水)、4 mL蒸餾水和15 mL緩沖液(0.067 mol/L K3PO4,pH 7.5)相混合。在540 nm波長處測定吸光度,并通過公式(3)計算總茶多酚含量:
ρ(TPC)/(mg·L-1)=(E1-E2)×3.9133×K×1 000
(3)
式中:E1,540 nm波長處測試溶液的吸光度;E2,540 nm波長處測定對照溶液的吸光度;3.913 3為540 nm處的吸光度為1.0時多酚的質(zhì)量濃度,mg/mL;K,稀釋系數(shù)。
1.4.4 多酚成分分析
基于KIM等[16]研究,利用超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography,UPLC)對每種茶飲料的多酚成分進行分析和測定。色譜分離是在反相HPLC色譜柱上進行的,使用的是由A相(0.1%甲酸水溶液)和B相(體積分數(shù)100%甲醇)組成的流動相。梯度洗脫程序如表1所示。
表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program
樣品均通過0.45 μm膜濾器過濾,進樣量10 μL,柱溫30 ℃,流速1 mL/min,UV檢測波長280 nm。GA,GC、EGC、C、EGCG、CAF、EC、GCG和ECG均分別通過參考標準校準曲線進行定量計算。
1.4.5 抗氧化活性的測定
1.4.5.1 DPPH自由基清除活性測定
參照王新然等[17]的方法并略加修改,對每種茶飲料的DPPH自由基清除活性進行測定。準確吸取500 μL濃度為0.2 mmoL/L的DPPH工作液與100 μL待測樣品溶液混合搖勻,室溫黑暗中反應(yīng)30 min,在517 nm波長處測量吸光度A1。樣品對照組用無水乙醇代替DPPH工作液測定其吸光度A2;空白組用無水乙醇代替樣品液測定吸光度A0,按公式(4)計算DPPH自由基清除率:
(4)
以不同濃度(0.11~0.57 mmol/L)的Trolox清除自由基的能力作標準曲線,以清除率為縱坐標,Trolox濃度為橫坐標。根據(jù)回歸方程計算待測樣品的Trolox當量抗氧化能力,結(jié)果表示為Trolox當量每升飲料,即mmol TE/L。
1.4.5.2 ABTS自由基清除活性測定
ABTS自由基清除法參考孫菡崢等[18]的方法略作改動。取7 mmol/L ABTS溶液和2.45 mmol/L K2S2O8溶液各5 mL,使其均勻混合,避光放置24 h。用無水乙醇稀釋母液使在734 nm波長下的吸光度為(0.70±0.20)即可使用。然后準確吸取750 μL ABTS工作液與100 μL待測樣品溶液均勻混合,室溫下避光反應(yīng)6 min后,于734 nm波長處測其吸光度A3,同時用無水乙醇代替樣品液作為對照測定其吸光度A4,按公式(5)計算ABTS自由基清除率。按1.4.5.1方法表示為標準曲線范圍(0.40~2.40 mmol/L Trolox)內(nèi)的mmol TE/L。
(5)
1.4.5.3 還原鐵抗氧化能力(ferric ion reducing antioxidant power,FRAP)測定
根據(jù)1.4.5.2方法[18]稍加修改,對茶飲料的還原鐵抗氧化能力(ferric ion reducing antioxidant power,FRAP)進行了測定。將pH 3.6的乙酸緩沖液、20 mmol/L FeCl3·6H2O和10 mmol/L TPTZ溶液按體積比10∶1∶1均勻混合。取900 μL FRAP工作液與100 μL樣品液混合,搖勻,37 ℃下放置30 min后,待測樣品的吸光度在593 nm波長下測量。已知濃度為0.08~0.40 mmol/L的Trolox溶液用于制作標準曲線,同上,結(jié)果以mmol TE/L表示。
根據(jù)2010—2012年中國居民的營養(yǎng)和健康監(jiān)測數(shù)據(jù)估算了中國成年人飲用RTD的多酚每日攝入量[19],本文中RTD的TPC值采用了M1進行測定。
所有實驗結(jié)果均表示為3次平行實驗測定值的平均值±標準偏差。所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析均使用Origin 2018進行。5%或更低的數(shù)值被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。使用SPSS 23在TPC和其他測量參數(shù)之間進行了Pearson相關(guān)分析。
2.1.1 可溶性固形物
TSS(total sohible solid,TSS)是指果汁、葡萄酒或其他飲料中糖、酸、維生素和微量礦物質(zhì)等可溶性成分的總量,是食品質(zhì)量評估的重要綜合指標。如表2所示,果汁茶飲料(1A~17D)的TSS含量范圍為(5.03±0.06)~(11.00±0.10),而純茶飲料(18A~22B)的TSS含量較低,最高僅為(6.07±0.06)。TSS含量的差異可能與果汁茶飲料中的糖、果糖糖漿和果汁等成分有關(guān)。
2.1.2 VC
兒茶素等生物活性成分在存儲過程中化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定,飲料中添加VC是防止氧化和降解的一種常見方法[20]。RTD樣品中VC含量結(jié)果也列于表2中。果汁茶飲料的VC含量范圍為(115.87±10.53)~(5 035.16±21.07) mg/L,其中6個樣品(1A、2A、5A、7B、8B和9B)的VC含量較高。同樣,WATANABE等[11]在研究中提到,日本瓶裝綠茶的VC濃度是425~1 852 μg/mL。與此相反,本研究分析的5種純茶飲料的VC含量相對較少。
2.1.3 pH
如表2所示,雖然純茶飲料的pH值(5.54~6.05)比果汁茶飲料(2.71~3.78)高,但兩者都是酸性飲料。研究表明[21]美國379種商業(yè)飲料中,93%的pH<4.0。同樣,巴西11種商業(yè)茶飲料的pH在2.89~3.41[22],而來自墨西哥的此類茶飲料則呈弱酸性,其pH值約為4[12]。LIN等[23]分析了冷、熱沖泡茶或蒸煮茶,其pH在5.47~5.88之間,這與目前關(guān)于純茶飲料pH的研究是一致的。
通常,將H3PO4、蘋果酸和檸檬酸等食品添加劑添加到飲料中,不僅豐富了酸味和其他濃郁的風(fēng)味,而且起到了防腐和控制pH的作用。同時,將這些酸添加到飲料中可降低飲料加工和儲存期間植物活性成分的降解率。例如,茶多酚在低pH環(huán)境下更穩(wěn)定,但在pH≥6時會發(fā)生差向異構(gòu)化或降解[24-25]。除這些作用外,調(diào)節(jié)pH還可以有效地控制茶沉淀物的形成,從而改善茶飲料在加工和貯藏過程中的外觀和風(fēng)味質(zhì)量[26-27]。
2.1.4 色值
飲料顏色是確定消費者食欲最直接的感官特性之一。表2顯示了22種RTD茶的色度特征,包括L*、a*、b*、C*和H*五個顏色指數(shù)參數(shù)。其中,白度指數(shù)(L*)在(17.64±0.53)~(23.97±0.04),與這些茶浸液的所測值一致[22]。樣品的a*和b*也為負值,分別表示飲料顏色呈現(xiàn)偏綠色和偏藍色。在本研究中,顏色強度(C*)和色調(diào)(H*)進一步證實了這種顏色趨勢,其值分別為(1.00±0.39)~(2.55±0.07)和(227.00±2.43)~(255.43±11.34)。然而,據(jù)報道,此類用于沖泡茶和速飲茶的參數(shù)b*值呈現(xiàn)正值[28]。如標簽信息中所述(表1),在這些茶飲料加工中使用不同原料茶和濃縮果汁可能會造成這種差異。
如表2所示,果汁茶飲料的TSC含量為(18.37±0.37)~(39.33±0.60) g GE/L,而純茶飲料的TSC含量為(7.10±1.26)~(17.55±0.45) g GE/L,表明果汁茶飲料中糖的含量比純茶中高。不同RTD茶的TSC差異可能取決于RTD茶的工業(yè)加工過程,尤其是重構(gòu)的產(chǎn)品成分。如表1所示,將天然糖,如蔗糖、葡萄糖或果糖單獨或組合添加到這些研究的樣品中。但是,GB/T 21733—2008《茶飲料》對茶飲料中糖的含量沒有設(shè)限。眾所周知,攝入過量的糖會引發(fā)健康問題,例如肥胖、糖尿病或心臟病等慢性疾病[29]。因此,需要對RTD茶中總糖的潛在健康風(fēng)險和添加上限做進一步研究。
表2 二十二種茶飲料的理化指標Table 2 The physicochemical indices of 22 tea beverages.
表3列出了這些茶飲料的TPC,M1測定每種茶飲料的TPC為(253.28±1.49)~(583.35±9.80) mg GAE/L,而M2所測定的TPC為(124.07±1.60)~(449.91±10.27) mg/L。盡管2種方法顯示出顯著的正相關(guān)關(guān)系(R2=0.744),但這些樣品的TPC排序在2種方法中有所不同。例如,M1中含量最多的3個依次是8B>22B>20B,而M2中的卻是22B>8B>20A。原因可能部分歸因于使用的方法不同和分析樣品中存在不同的干擾化合物。此外,由M1確定茶飲料中的TPC值與其沖泡的茶飲料具有可比性,這表明商業(yè)RTD茶也富含酚類化合物。
表3 二十二種茶飲料的多酚含量 單位:mg/LTable 3 Phenolic profile of 22 tea beverages
為了進一步評估這些茶飲料在中國市場的質(zhì)量,本實驗相應(yīng)地計算了每種RTD的TSC與TPC之比。如圖1所示,果汁茶飲料與純茶飲料相比,糖酚比更高。該結(jié)果表明,后者的攝入可在飲食中貢獻更多的多酚和更少的糖。
a-總糖相對總酚含量;b-糖酚比圖1 茶飲料中總糖和總酚含量的關(guān)系Fig.1 Relationship between total sugar content and total phenol content in tea beverages
通過HPLC分析的酚類化合物列于表3中。本次研究所有的RTD基本擁有相同種類的酚類化合物,其含量根據(jù)茶飲料品種而變化。在17種茶飲料中共鑒定出8種兒茶素和CAF,但5種茶飲料中有1~2種兒茶素未被檢出。在8種兒茶素中,最主要的化合物是EGC、GC、GCG、EC和ECG。同樣,據(jù)報道,用斯里蘭卡茶葉制成的500 mL RTD 中總共含有87.4 μmol總黃烷-3-醇,其中EGC、EGCG、EC、ECG和GC含量最高[10]。但是,本次實驗中測得的EGCG含量為(1.45±0.03)~(22.59±0.26)mg/L,相對低于之前報道,后者在茶中通常占兒茶素總量的50%~80%。WATANABE等[11]還發(fā)現(xiàn),來自日本的罐裝綠茶樣品中含有較高含量的EGCG,而不是EGC和GC。眾所周知,與紅茶相比,綠茶富含兒茶素,尤其是EGCG。因為兒茶素在紅茶發(fā)酵過程中在多酚氧化酶的作用下轉(zhuǎn)化為茶黃素和茶紅素。另外,萃取分離和高壓滅菌等幾種關(guān)鍵的食品加工技術(shù)也會導(dǎo)致風(fēng)味、顏色、口味和多酚的損失[15,30]。除這些因素外,每種兒茶素的化學(xué)穩(wěn)定性還受到儲存條件的影響,包括溫度、相對濕度以及不同的食物系統(tǒng)和生產(chǎn)[20]。LI等[31]觀察到,差向異構(gòu)化和氧化是2種主要反應(yīng),導(dǎo)致液態(tài)和固態(tài)中EGCG降解。
此外,CAF在這些茶飲料中占主導(dǎo)地位,含量為(41.90±0.08)~(126.45±0.25) mg/L,略低于日本市場上出售的商業(yè)罐裝綠茶和紅茶[11]。實際上,在不同的茶葉加工過程中,CAF比兒茶素更穩(wěn)定,適量食用(400 mg/d)可以發(fā)揮生理作用,如提高精神警覺性、注意力、運動表現(xiàn)和降低疲勞[32-33]
本研究中,分別通過DPPH、ABTS自由基清除能力和FRAP分析評估了22種茶飲料的抗氧化能力。如表4所示,這些茶飲料對DPPH和ABTS自由基清除能力的分別為(0.40±0.06)~(5.41±0.07) mmol TE/L和(0.53±0.08)~(8.23±0.04) mmol TE/L。其中1A、7B、8B、20B、21B和22B顯示出比其他飲料更高的抗氧化活性。該結(jié)果與FRAP值在(0.88±0.09)~(8.82±0.67) mmol TE/L的總還原能力一致。值得注意的是,在不同種品牌間和同種品牌內(nèi),抗氧化活性均存在很大差異,而抗氧化活性最強的茶飲料來自本研究中的B品牌。造成這種差異是各種因素影響的結(jié)果。例如選擇的原始茶葉、制備方式(可溶提取物或適當浸泡)、添加的其他成分以及滅菌工藝等。由表4和表5可知,茶飲料的總多酚含量和抗氧化活性呈極顯著關(guān)系(R2>0.8),即總多酚含量越高,抗氧化活性越強。
表4 二十二種茶飲料的總酚含量和體外抗氧化活性Table 4 Total phenolic content and in vitro antioxidant activities of 22 tea beverages
茶多酚是一類有益人體健康的植物成分,也是構(gòu)成茶飲料感官特性的基礎(chǔ)。因此,進一步進行相關(guān)分析以評估零售價格、理化特性、抗氧化作用和多酚類成分組成之間的關(guān)系。如表5所示,茶多酚與本研究中的其他參數(shù)顯示出不同相關(guān)性。6種化合物(C、EGCG、CAF、EC、GCG和ECG)與通過2種方法測定的總多酚含量和抗氧化活性呈正相關(guān),從而證實了先前研究中評估不同品種茶的抗氧化能力[34]。但是除EGCG、CAF和GCG與pH顯著相關(guān)外,這些化合物與茶色的理化特性(顏色、可溶性固形物和pH)之間均存在弱或負相關(guān)性。
此外,零售價格是影響RTD消費者吸引力的關(guān)鍵參數(shù)。Pearson相關(guān)性分析表明,零售價格與總酚含量C、CAF和EC分別呈顯著正相關(guān)(表5)。相反,零售價格與其他參數(shù)間的相關(guān)性弱且不顯著。從結(jié)果推斷,除了健康作用,RTD的其他屬性如化學(xué)成分和理化特性可能會對其零售價格產(chǎn)生重大影響。如上所述和表1所示,在中國與果汁茶飲料相比,純茶飲料具有更高的TPC和抗氧化能力,但零售價格卻較低。一種可能原因是不同口味的果汁茶飲料為消費者提供了更多的感官選擇。同樣,GRANATO等[35]認為,南美紅酒的零售價與感官質(zhì)量間存在顯著正相關(guān)。
表5 酚類的理化性質(zhì)與單體的相關(guān)性分析(R2)Table 5 Correlations analysis of the physicochemical properties and monomer of phenolic
通常,由于兩大類RTD茶飲料中都存在茶多酚類化合物,因此RTD茶對健康的影響與沖泡茶類似。先前研究發(fā)現(xiàn),在美國和韓國的飲食中,食用沖泡茶對膳食中的多酚類成分有很大貢獻[7,36]。在中國,過去的幾十年里RTD茶已廣受歡迎,然而,其對中國居民每日多酚攝入量的貢獻仍亟待研究。根據(jù)2010~2012年中國居民營養(yǎng)和健康監(jiān)測的最新數(shù)據(jù),茶飲料是2010~2012年中國成年人攝入的主要飲料,年人均消費量高達26.2 L。據(jù)此,我國成年人茶飲料攝入的多酚量達到33.07 mg/d(表6)。根據(jù)LI等[31]的研究,中國成年人每天從水果、蔬菜和堅果中攝入的總黃酮含量為165.6 mg/d,而在同一研究中未評估茶多酚的攝入量。此外,RTD對老年人、男性和城市成年人等的茶多酚總量貢獻較高,這可能歸因于消費者的喜好。
表6 估計茶飲料中茶多酚的每日攝入量Table 6 Estimation of the daily intake of tea polyphenolics in tea beverages
通常,果汁茶飲料更受歡迎但更昂貴,與純茶飲料相比,茶多酚含量較低。但本研究中所有速飲茶飲料都可以作為重要的茶多酚抗氧化劑來源?;?2010—2012年中國居民營養(yǎng)和健康監(jiān)測數(shù)據(jù)推算,RTD茶飲料對中國成年人(>18歲)的多酚攝入量日均貢獻估計為33.07 mg/人。值得注意的是,本研究中大多數(shù)RTD茶,尤其是果汁茶飲料,都有較高含量的糖或甜味劑,這被認為是主要的公共衛(wèi)生問題,也是誘發(fā)慢性病的主要風(fēng)險因子,而純茶飲料中糖酚比低,能夠為人體提供大量的多酚和少量的糖,對人體健康起到一定的作用。因此,從長遠來看,需要進一步動物和臨床實驗更仔細地研究兩大類茶飲料對健康的影響。