陳彬和，趙炳天，孫亞娟，李云興*

1(合成與生物膠體教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122)2(江南大學(xué) 化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

大豆是我國(guó)一種重要的糧食作物，常被發(fā)酵制成豆瓣醬、腐乳、醬油等食品，發(fā)酵能夠通過(guò)提高活性物的濃度來(lái)提升大豆的抗氧化活性。大豆中含有許多抗氧化物質(zhì)，例如酚酸、黃酮以及類黃酮等多酚類化合物[1]，許多研究表明，發(fā)酵提高了大豆多酚的提取濃度，同時(shí)，其還原能力以及清除自由基的能力也得到提高[2-5]。發(fā)酵能夠?qū)⒋蠓肿拥鞍追纸鉃槟┒税被釟埢哂锌寡趸钚缘男》肿佣嚯腫6]，李慧娟等[7]報(bào)道，對(duì)大豆進(jìn)行發(fā)酵提高了小分子多肽的產(chǎn)量，同樣，其清除自由基的能力得到提高。許多疾病的發(fā)生都是由于機(jī)體內(nèi)的氧化和抗氧化水平失衡[8-9]，發(fā)酵的大豆能夠通過(guò)提升抗氧化水平來(lái)預(yù)防心血管疾病和保護(hù)腸道健康。研究表明，通過(guò)給小鼠喂食發(fā)酵的大豆能夠提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase, CAT)等抗氧化酶的活性和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，同時(shí)肥胖小鼠的血脂含量下降[10-11]。另外，發(fā)酵的大豆可以通過(guò)抑制氧化損傷來(lái)保護(hù)小鼠的腸道[12]。

大豆發(fā)酵的抗氧化研究主要是其在食用方面帶來(lái)的價(jià)值，而對(duì)其通過(guò)抗氧化方式來(lái)保護(hù)皮膚的研究較少。角質(zhì)細(xì)胞位于皮膚的最外層，可以阻擋外界刺激對(duì)皮膚的侵害。紫外照射、有毒的化學(xué)物質(zhì)等能通過(guò)活性氧(reactive oxygen species, ROS)來(lái)?yè)p傷角質(zhì)細(xì)胞，因此為角質(zhì)細(xì)胞提供抗氧化保護(hù)有利于維持皮膚健康。該研究利用枯草芽孢桿菌制備了大豆發(fā)酵液(soybean fermentation broth,S-FB)，并探討了其在人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(human immortalized keratinocytes,HaCaT)內(nèi)的抗氧化作用，以明確其對(duì)于保護(hù)皮膚健康的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆，無(wú)錫歐尚超市；枯草芽孢桿菌，江南大學(xué)生物活性物發(fā)酵制備實(shí)驗(yàn)室提供；2,2′-聯(lián)氨雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)[2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS)]，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；HaCaT細(xì)胞，北京北納生物科技有限公司；2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate, DCFH-DA)、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide, MTT),美國(guó)Sigma公司；2,2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(2,2′-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride, ABAP)，百靈威科技公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、ECL化學(xué)發(fā)光試劑、SOD和CAT酶活力檢測(cè)試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所；核因子E2相關(guān)因子2 (nuclear factor erythroid-2-related factor 2, Nrf2)，圣克魯斯生物技術(shù)上海有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Tecan Infinite 200 Pro型多功能酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司；Synergy H4型多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；TU-1901型雙光束紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FE20型pH計(jì)，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；DDS-307型電導(dǎo)率儀，上海雷磁儀器有限公司；DYCZ-24KS型雙板垂直電泳儀、DYCZ-40K型轉(zhuǎn)印電泳儀、DYY-5D型電腦三恒多用電泳儀，北京六一生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 S-FB的制備及處理

將大豆浸泡過(guò)夜，按照質(zhì)量比1∶7的比例與去離子水混合并打碎制成大豆勻漿，取10 g勻漿加入39.5 g水，滅菌20 min，得到大豆培養(yǎng)基。冷卻后接入0.5 mL OD600 nm為0.2的枯草芽孢桿菌懸浮液，并于37 ℃振蕩培養(yǎng)箱中發(fā)酵72 h。將發(fā)酵前和發(fā)酵后的大豆培養(yǎng)基分別用220 nm的微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾，去除菌和大豆殘?jiān)?，最終得到S-FB和未發(fā)酵的大豆提取液(soybean extract,SE)。

1.3.2 ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力法測(cè)試抗氧化活性

制備2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液，然后取7.7 mg ABTS溶解于2 mL過(guò)硫酸鉀溶液中。16 h后，將其稀釋成734 nm處吸光度為0.9的ABTS工作液。分別移取50 μL SE和S-FB于96孔板中，然后加入150 μL ABTS工作液，反應(yīng)10 min后測(cè)其在734 nm處吸光度As。以蒸餾水代替樣品作為對(duì)照組，測(cè)得其吸光度為Ac。ABTS陽(yáng)離子自由基的清除率計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

1.3.3 總酚含量的檢測(cè)

采用普魯士藍(lán)法檢測(cè)SE和S-FB中的總酚含量[13]。取1 mL樣品，并依次加入0.2 mL的0.008 mol/L鐵氰化鉀溶液、0.100 mol/L FeCl3溶液和0.100 mol/L 鹽酸溶液，均勻混合后于室溫下反應(yīng)15 min。最后用水稀釋至10 mL,于730 nm的波長(zhǎng)下檢測(cè)溶液的吸光度。以沒(méi)食子酸酯為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)試，得到二項(xiàng)方程Y=-3.485 5X2+1.897 3X+0.008 0，R2=0.999 3。樣品中的總酚含量通過(guò)該方程計(jì)算得到。

1.3.4 總肽含量的檢測(cè)

采用雙縮脲法分別對(duì)S-FB和SE中的總肽含量進(jìn)行檢測(cè)。先分別配制雙縮脲試劑A (0.10 g/mL的NaOH溶液)和雙縮脲試劑B (0.01 g/mL的CuSO4溶液)。將樣品與100 g/L三氯乙酸以1∶1的質(zhì)量比混合，30 min后過(guò)濾。取1 mL濾液，并依次加入2 mL雙縮脲試劑A和2 mL雙縮脲試劑B。接著于室溫下反應(yīng)15 min，在540 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)試，并得到線性方程Y=0.356 7X+0.007 6，R2=0.997。樣品中的總肽含量通過(guò)該方程計(jì)算得到。

1.3.5 細(xì)胞內(nèi)ROS水平的檢測(cè)

利用熒光探針DCFH-DA來(lái)檢測(cè)HaCaT細(xì)胞內(nèi)的ROS。按照2×104/孔的密度接種細(xì)胞。細(xì)胞與樣品培養(yǎng)結(jié)束后，加入20 μmol/L熒光探針DCFH-DA溶液，在培養(yǎng)箱中孵育30 min，加入0.6 mmol/L的ABAP溶液，于熒光酶標(biāo)儀中進(jìn)行0～60 min的動(dòng)力學(xué)檢測(cè)，發(fā)射波長(zhǎng)485 nm，激發(fā)波長(zhǎng)535 nm。

1.3.6 S-FB對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

HaCaT細(xì)胞分別與體積分?jǐn)?shù)為0%、5%、10%和20%的S-FB培養(yǎng)12 h，然后按照1.3.5小節(jié)的方法檢測(cè)ROS。

HaCaT細(xì)胞與400 μmol/L H2O2培養(yǎng)2 h，然后去除培養(yǎng)液，并在細(xì)胞中分別加入體積分?jǐn)?shù)為5%、10%和20%的S-FB，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。設(shè)置2組細(xì)胞分別與400 μmol/L的H2O2和體積分?jǐn)?shù)為5%的S-FB培養(yǎng)2 h，未處理細(xì)胞作為對(duì)照組。最后按照1.3.5小節(jié)的方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。

1.3.7 免疫印跡法測(cè)定Nrf2的表達(dá)

將HaCaT細(xì)胞與體積分?jǐn)?shù)5% S-FB分別進(jìn)行0、12、24、36和48 h的培養(yǎng)，每隔12 h給細(xì)胞換新鮮的培養(yǎng)液。然后除去培養(yǎng)基并用裂解液提取細(xì)胞內(nèi)蛋白。收集裂解液并于10 000 r/min下離心8 min，保留上清液。將提取的蛋白加熱變性，然后在Tris-甘氨酸電泳緩沖液中進(jìn)行十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳使蛋白分離。在同樣的緩沖液中對(duì)蛋白進(jìn)行90 min的轉(zhuǎn)印電泳，使蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，轉(zhuǎn)印完畢的膜在50 g/L脫脂奶粉中封閉1 h，并用TBST緩沖液洗滌，然后與一抗(Nrf2或β-actin)于4 ℃過(guò)夜孵育，再次洗滌，繼續(xù)與二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG)室溫孵育1 h。用ECL化學(xué)發(fā)光試劑使蛋白條帶顯色，用Image Lab軟件對(duì)條帶的灰度值進(jìn)行定量。

1.3.8 S-FB對(duì)細(xì)胞內(nèi)SOD和CAT酶活力的影響

SOD和CAT酶活力：按照SOD和CAT酶活力檢測(cè)試劑盒對(duì)1.3.7小節(jié)提取的蛋白進(jìn)行檢測(cè)。

紫外線B (ultraviolet radiation B, UVB)損傷測(cè)試：體積分?jǐn)?shù)為5%的S-FB分別處理HaCaT細(xì)胞0、36和48 h，然后用365 μW/cm2的UVB照射細(xì)胞5 min，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，然后每孔加入100 μL 0.5 g/mL的MTT溶液，4 h后用二甲基亞砜溶解生成的甲臜，最后用酶標(biāo)儀在490 nm下檢測(cè)吸光度。

1.3.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)均由平行測(cè)試得到，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。顯著性差異通過(guò)GraphPad prism7的ANOVA-Tukey計(jì)算得到。P<0.05表示結(jié)果具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 S-FB的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力

大豆中含有豐富的蛋白質(zhì)和多酚類化合物，在發(fā)酵過(guò)程中，微生物產(chǎn)生的酶能提高大豆多肽的產(chǎn)量，并且促進(jìn)大豆中多酚化合物釋放。如表1所示，S-FB和SE中的總酚質(zhì)量濃度分別為0.89和0.31 g/L，總肽質(zhì)量濃度分別為2.30和0.70 g/L。S-FB的總酚和總肽含量比SE分別提高了187%和229%。多酚和大豆多肽通常具有抗氧化活性。ABTS陽(yáng)離子是一種能夠相對(duì)穩(wěn)定存在于水溶液中的自由基，其可以通過(guò)電子轉(zhuǎn)移被清除。由于不易受外界因素干擾，ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力能夠較為準(zhǔn)確地體現(xiàn)樣品的抗氧化活性。如圖1顯示，體積分?jǐn)?shù)為1%、2%、5%和10% S-FB對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除效果為(30.31±0.49)%、(49.48±0.53)%、(78.24±0.55)%和(93.88±0.13)%，都高于對(duì)應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的SE清除效果〔(6.00±1.39)%、(11.13±0.57)%、(20.40±0.35)%和(33.49±1.07)%〕，其中1% S-FB對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除效果接近10% SE。因此，發(fā)酵可以提高S-FB中的多酚和多肽含量，使其具有優(yōu)異的抗氧化活性。

表1 S-FB和SE中的總酚和總肽含量(n=3) 單位：g/LTable 1 Contents of total polyphenols and total peptides in S-FB and SE (n=3)

圖1 S-FB和SE的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力(n=3)Fig.1 ABTS cation radicalscavenging activity of S-FB and SE (n=3)

2.2 S-FB對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

研究了S-FB對(duì)HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS的影響來(lái)表明其抗氧化作用。為了排除滲透壓和pH值對(duì)測(cè)定結(jié)果的干擾，檢測(cè)了S-FB的電導(dǎo)率和pH值。細(xì)胞培養(yǎng)基，即杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified Eagle medium,DMEM),其電導(dǎo)率超出儀器量程，由表2可知，0%、5%、10%和20% S-FB (雙重蒸餾水配制)的電導(dǎo)率分別為2.59、142.20、317.00和693.00 μS/cm，相比DMEM，S-FB體積分?jǐn)?shù)變化導(dǎo)致的電導(dǎo)率差異可忽略。另外，0%、5%、10%和20% S-FB的pH值在7.2～7.5范圍內(nèi)(DMEM配制)，S-FB對(duì)pH的影響較小。因此可以忽略滲透壓和pH對(duì)S-FB的影響。

表2 S-FB的電導(dǎo)率和pH值(n=3)Table 2 Conductivity and pH value of S-FB (n=3)

圖2-a為HaCaT細(xì)胞與S-FB培養(yǎng)12 h后的ROS水平。由圖可知，5%、10%和20% S-FB分別處理12 h后，細(xì)胞內(nèi)的ROS水平提高，且ROS隨著S-FB體積分?jǐn)?shù)的增加而增加?？寡趸瘎┠軌蛘T導(dǎo)ROS的生成，另有報(bào)道表明抗氧化劑能夠清除細(xì)胞在氧化應(yīng)激中生成的ROS[14-16]。QIN等[17]提出抗氧化劑對(duì)ROS的清除作用在ROS高水平的細(xì)胞中更優(yōu)異。因此，本實(shí)驗(yàn)中S-FB提高HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS可能是由于該細(xì)胞本身的ROS水平較低所致。于是用H2O2來(lái)誘導(dǎo)ROS，并探討S-FB對(duì)該細(xì)胞內(nèi)ROS的影響。如圖2-b所示，H2O2在細(xì)胞內(nèi)提高了ROS水平，該效果接近5% S-FB對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS的影響，H2O2+5% S-FB、H2O2+10% S-FB和H2O2+20% S-FB (先用H2O2刺激細(xì)胞，再用S-FB培養(yǎng)細(xì)胞)導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)ROS水平均低于H2O2。結(jié)果表明，S-FB能夠清除H2O2誘導(dǎo)的ROS。另外，5%、10%和20% S-FB對(duì)ROS的誘導(dǎo)作用依次增強(qiáng)，而H2O2+S-FB (5%、10%和20%)導(dǎo)致的ROS水平都低于5% S-FB，表明H2O2提高細(xì)胞的ROS水平后，S-FB誘導(dǎo)ROS的作用減弱。因此，S-FB對(duì)ROS的影響與HaCaT細(xì)胞的ROS水平(S-FB處理前)有關(guān)，其清除ROS的效果在ROS水平高的細(xì)胞中更加顯著，同時(shí)誘導(dǎo)ROS的作用減弱。因此，S-FB能夠通過(guò)降低細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)來(lái)保護(hù)細(xì)胞。

a-未添加H2O2; b-添加H2O2圖2 S-FB對(duì)HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響(n=6)Fig.2 The effect of S-FB on the intracellular ROS level in HaCaT cells (n=6)

2.3 S-FB對(duì)細(xì)胞內(nèi)Nrf2水平的影響

Nrf2即核因子E2相關(guān)因子2，是抗氧化通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其通過(guò)調(diào)控抗氧化基因的表達(dá)來(lái)控制抗氧化酶的合成，從而對(duì)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)進(jìn)行調(diào)節(jié)[18-19]，Nrf2的表達(dá)量關(guān)系著細(xì)胞的抗氧化能力。由圖3可知，5% S-FB分別處理12、24、36和48 h后，細(xì)胞內(nèi)的Nrf2蛋白的相對(duì)含量分別為1.85、2.04、2.64和2.65。

圖3 S-FB對(duì)HaCaT細(xì)胞內(nèi)Nrf2的影響Fig.3 The effect of S-FB on the intracellular Nrf2 in HaCaT cells

結(jié)果表明，S-FB上調(diào)了HaCaT細(xì)胞中的Nrf2水平，因此，S-FB能夠通過(guò)激活細(xì)胞的Nrf2相關(guān)抗氧化通路來(lái)發(fā)揮抗氧化作用并保護(hù)HaCaT細(xì)胞。

2.4 S-FB對(duì)細(xì)胞的SOD和CAT酶活力以及抗氧化能力的影響

抗氧化酶的增加能夠提高細(xì)胞的抗氧化能力[20-21]。

圖4-a和4-b分別是細(xì)胞與5% S-FB培養(yǎng)后的SOD和CAT酶活力。常規(guī)HaCaT細(xì)胞的SOD和CAT酶活力分別為8.16和13.19 U/mg。S-FB分別處理12、24、36和48 h后，SOD酶活力分別為7.82、5.91、10.81和10.78 U/mg，CAT酶活力分別為13.19、11.35、16.34和16.05 U/mg。細(xì)胞與5% S-FB分別培養(yǎng)36和48 h后，其SOD酶活力相比常規(guī)HaCaT細(xì)胞分別提高了32.5%和32.1%，CAT酶活力分別提高了19.6%和17.5%。細(xì)胞的抗氧化酶活力提高后，進(jìn)一步檢驗(yàn)了其抗氧化能力。UVB能夠誘導(dǎo)ROS生成，并造成細(xì)胞氧化損傷。如圖4-c所示，5% S-FB分別處理36和48 h的細(xì)胞在UVB損傷中的存活率都是常規(guī)HaCaT細(xì)胞的1.3倍。因此，S-FB能夠增強(qiáng)HaCaT細(xì)胞的SOD和CAT酶活力，并提升了其抗氧化能力。

圖4 S-FB對(duì)HaCaT細(xì)胞的SOD和CAT酶活力以及抗氧化能力的影響(n=3)Fig.4 The effect of S-FB on SOD and CAT activities and the antioxidant capacity in HaCaT cells (n=3)注：*代表差異顯著(P<0.05)

3 結(jié)論

以上結(jié)果表明，發(fā)酵提高了S-FB中的總酚和總肽含量，并且增強(qiáng)了其對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除能力。通過(guò)研究S-FB在HaCaT細(xì)胞中的抗氧化作用得到其能夠降低細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，還可以激活Nrf2抗氧化通路并提高細(xì)胞的抗氧化能力。因此，S-FB具有良好的抗氧化效果，同時(shí)能以抗氧化的方式來(lái)保護(hù)HaCaT細(xì)胞。

HaCaT細(xì)胞本身的ROS水平較低，當(dāng)氧化刺激提高其ROS水平時(shí)，S-FB能夠清除增加的ROS，但S-FB在正常HaCaT細(xì)胞內(nèi)會(huì)誘導(dǎo)ROS生成。菌株影響著發(fā)酵液的活性成分，下一步工作希望通過(guò)篩選菌株來(lái)制備抗氧化性能優(yōu)異但ROS誘導(dǎo)作用減弱的發(fā)酵液。