鄧思敬，杜磊，謝靜莉*，魏東芝

1(華東理工大學 生物反應器工程國家重點實驗室，上海，200237)2(華東理工大學 生物工程學院食品科學與工程系，上海，200237)3(華東理工大學 魯華生物技術研究所，上海，200237)

臭豆腐是傳統(tǒng)發(fā)酵食品，具有獨特的風味及營養(yǎng)價值。臭豆腐通常分為發(fā)酵型和非發(fā)酵型，由于全國各地飲食習慣各不相同，臭豆腐的制作工藝、香氣成分也有較大區(qū)別。傳統(tǒng)的發(fā)酵型臭豆腐鹵液通常使用蔬菜及香辛料，以一定的配比自然發(fā)酵而成[1]。湖南地區(qū)鹵液配方以豆豉、純堿、青礬、香菇等為主，所泡制的豆腐表面呈黑色。而江南一帶以紹興地區(qū)為代表的鹵液配方則以莧菜梗、生姜、花椒等為主，所泡制豆腐表面呈米白色。鹵液發(fā)酵過程中，微生物扮演著十分重要的角色，尤其乳酸菌，其組成、含量對鹵液風味的形成及營養(yǎng)價值的提升起著決定性的作用[2]。然而，傳統(tǒng)臭豆腐鹵液的生產(chǎn)往往在敞口的缸或水泥池中，微生物來源于空氣等自然環(huán)境，存在食品安全隱患的風險[3]。因此，符合食品安全要求，采用明確的菌種，確定的工藝對新鮮原料發(fā)酵的生產(chǎn)方式亟待建立[4]。

本課題以紹興地區(qū)風味特征的臭豆腐鹵液為對象，運用分離自自然發(fā)酵的臭豆腐鹵液中的乳酸菌，通過分析菌種的發(fā)酵能力、抑菌特性、蛋白水解能力，篩選出適用于鹵液生產(chǎn)的乳酸菌菌種，進行多菌株復配發(fā)酵，獲得一種新型、安全的臭豆腐發(fā)酵鹵液。采用固相微萃取結合氣相色譜-質譜聯(lián)用的方法對鹵液中的香氣成分進行分析，為臭豆腐鹵液的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

莧菜梗、生姜、花椒、豆腐坯，上海清美綠色食品集團；MRS培養(yǎng)基，北京AOBOX生物技術；茚三酮，阿拉丁生化科技股份公司；其余試劑均為分析純，國藥試劑有限責任公司。

1.2 儀器與設備

恒溫培養(yǎng)箱(BS-1E)，常州市凱航儀器有限公司；酶標儀(DNM-9602A)，美國BIOTEK儀器有限公司；氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(7890A)，美國Agilent公司；PDMS萃取頭(85 μm)，美國Supelco公司；pH計(UB-7)，Denver Instrument；色譜柱(DB-Wax，60 m × 0.25 mm，0.25 μm)，日本島津實驗器材有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳酸菌的活化及培養(yǎng)

乳酸菌保藏于-80 ℃甘油管中，16S rDNA測序結果經(jīng)GenBank核酸序列比對，確定菌株物種歸屬如表1所示。以體積分數(shù)2%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18 h，室溫下以4 000 r/min離心15 min，最后用生理鹽水懸浮至菌體濃度為107CFU/mL,用于后續(xù)發(fā)酵。

表1 16S rDNA測序結果比對表Table 1 The results of 16S rDNA sequence

1.3.2 鹵液的配制與接種發(fā)酵

配制體積分數(shù)為2%的無菌鹽水，以莧菜梗123 g/L、生姜12.55 g/L、花椒6.3 g/L來配制基礎培養(yǎng)基用于鹵液的發(fā)酵。篩選所得乳酸菌遵循1.3.1方法培養(yǎng)稀釋后同比例接種于發(fā)酵前培養(yǎng)基中，單菌株發(fā)酵或復配乳酸菌發(fā)酵液的初始總菌濃均保持為104CFU/mL，并于發(fā)酵8 h 時加入體積分數(shù)2%的大豆蛋白。

1.3.3 發(fā)酵液中總菌濃及總酸度、pH的測定

(1) 菌濃的測定：每隔2 h取發(fā)酵液100 μL以無菌生理鹽水梯度稀釋后于MRS固體培養(yǎng)基(20 g/L瓊脂)上涂布培養(yǎng)，每組3個平行，37 ℃恒溫倒置培養(yǎng)30 h，讀取并確定菌濃。

(2) 酸度的測定：發(fā)酵液3 000 r/min，室溫離心10 min取上清液，以0.1 moL/L的NaOH溶液滴定。總酸度以100 mL發(fā)酵液消耗的NaOH體積表示，1 mL 0.1 moL/L NaOH為1°T。

(3) pH的測定：數(shù)字pH計測定。

1.3.4 抑菌作用的測定

活化的菌液用于單菌株鹵液發(fā)酵，并進行抑菌實驗。將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌菌濃為107CFU/mL的活化菌液以20 μL∶30 mL的比例加入融化的LB固體培養(yǎng)基(20 g/L瓊脂)中，凝固后牛津杯中分別注入150 mL 待測發(fā)酵液，以未經(jīng)發(fā)酵的鹵液基底作為對照，37 ℃恒溫過夜培養(yǎng)后測量記錄抑菌圈。

1.3.5 蛋白水解能力的測定

采用茚三酮比色法進行氨基酸含量的測定。

(1) 茚三酮顯色劑的配制：取0.5 g水合茚三酮果糖0.300 g，Na2HPO411.00 g，NaH2PO46.00 g，去離子水溶解并定容至100 mL。

(2) 標準曲線的繪制：甘氨酸以去離子水溶解配制濃度為2～20 mg/L的甘氨酸標準液，取2 mL標準液與3 mL茚三酮顯色劑、2 mL PBS緩沖液(pH 5.5)混勻，沸水浴加熱30 min后迅速冷卻，于570 nm處測定吸光值，所得標準曲線為y=0.039 1x+0.039 3(R2=0.999 1)。

(3) 蛋白水解液中氨基酸含量的測定：在未經(jīng)發(fā)酵的基礎培養(yǎng)基中添加碾碎的豆腐坯(40 g/L)作為氮源，分別經(jīng)乳酸菌水解0、8、24 h后取樣,5 000 r/min室溫離心10 min，上清液用于蛋白水解度的測定，反應體系同1.3.5(2)所述。

水解度以DH表示,按公式(1)計算:

(1)

式中：h,水解后每克蛋白質被裂解的肽鍵量，mmol/g；htot,水解度常數(shù)，mmol/g。

1.3.6 發(fā)酵液香氣成分的萃取與分析

取發(fā)酵所得臭豆腐鹵液產(chǎn)品30 mL、NaCl 5 g、5 μL 0.02 g/L的乙酸苯乙酯于頂空萃取瓶中，磁力攪拌器于50 ℃下80 r/min萃取90 min。PDMS萃取頭(85 μm)在進樣口250 ℃解吸5 min，每組3個平行。

氣相色譜檢測條件：采用DB-WAX色譜柱進行氣相色譜分析，進樣模式為不分流，載氣(He)流量1.0 mL/min，升溫程序：初始溫度40 ℃，保持4 min；以 5 ℃/min升至100 ℃，再以10 ℃/min升至220 ℃，在220 ℃保持8 min。

質譜檢測條件：離子源溫度200 ℃；EI電離源；電子能量為70 eV；檢測器為350 V；掃描范圍m/z為33～450 amu。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

結果用平均值±標準差(SD)表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0進行分析。

2 結果與分析

2.1 單一菌株發(fā)酵液抑菌能力的測定

13株實驗室乳酸菌菌株經(jīng)單一菌種發(fā)酵所得的臭豆腐鹵液,以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為對象進行抑菌試驗。由表2可知，6株菌株發(fā)酵所得鹵液在平板上可以觀察到明顯的抑菌圈，對大腸桿菌或(和)金黃色葡萄球菌具有良好的抑菌特性。戊糖片球菌2-2、植物乳桿菌1-3、1-1對2種致病菌均有抑制特性，通過對比抑菌圈直徑可知1-1菌株抑菌特性最佳；戊糖片球菌2-4、乳酸乳球菌3-1只可單一地抑制大腸桿菌生長，植物乳桿菌3-3只可單一地抑制金黃色葡萄球菌的生長。這證明部分菌株的發(fā)酵液對食品中2種較為常見的致病菌具有抑菌性，將其用作臭豆腐鹵液發(fā)酵菌株可有效解決發(fā)酵過程中有害微生物污染的食品安全隱患。

表2 菌株抑菌圈的測定Table 2 Inhibition zones of strain

2.2 乳酸菌蛋白水解能力的測定

臭豆腐發(fā)酵鹵液中氨基酸含量可用于表征大分子蛋白質被微生物酶系水解程度，水解度越高則豆腐口感越細膩軟糯，鮮味成分越多。由圖1可知，分離得到的13株乳酸菌均具有不同程度的蛋白水解能力，設置發(fā)酵總時長為24 h。在發(fā)酵初期蛋白水解度普遍較低，隨著時間的延長，植物乳桿菌3-3、乳酸乳球菌3-1和戊糖片球菌2-2的蛋白水解度與發(fā)酵時間呈正相關，3-1在24 h時達到12.6%，這是由于乳酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生蛋白酶及肽酶對大豆蛋白有降解作用[5]。而植物乳桿菌2-1、1-4、1-1、1-2、1-3、戊糖片球菌3-4及發(fā)酵乳桿菌2-3的DH值在12 h左右到達頂點；發(fā)酵后期(12～24 h)逐漸下降，可能是由于發(fā)酵底物被大量消耗，而發(fā)酵菌株的代謝產(chǎn)物與其蛋白酶形成復合物，蛋白酶活力被抑制，水解產(chǎn)物可能被細胞再次用于合成自身的蛋白質[9]。

圖1 不同菌株發(fā)酵液中的蛋白水解度Fig.1 Degree of hydrolysis of protein in single strain fermented stinky Tofu brine

2.3 乳酸菌發(fā)酵能力的測定

以菌株為單一變量進行單菌株鹵液發(fā)酵。由圖2可知，植物乳桿菌1-1、1-2、1-3、3-3發(fā)酵能力較好，在發(fā)酵前期(0～12 h)呈指數(shù)增長并在12～18 h左右生長放緩進入穩(wěn)定期。植物乳桿菌1-4、2-1及發(fā)酵乳桿菌2-3發(fā)酵能力差，甚至在發(fā)酵后期(18～24 h)菌濃突降，鹵液發(fā)酵終點菌濃較低。戊糖片球菌4-1、2-2、3-4及乳酸乳球菌3-1發(fā)酵能力較好，在發(fā)酵前期(0～18 h)呈指數(shù)增長,在18 h左右生長放緩進入穩(wěn)定期。彎曲乳桿菌3-2及戊糖片球菌2-4發(fā)酵能力差，鹵液發(fā)酵終點菌濃較低。

圖2 單菌株發(fā)酵期間鹵液菌濃變化圖Fig.2 Variation of bacterial concentration in single strain fermented stinky Tofu brine

2.4 單菌株發(fā)酵臭豆腐發(fā)酵鹵液特征香氣成分的分析

13株實驗室乳酸菌分別進行單一菌種發(fā)酵，所得的臭豆腐發(fā)酵鹵液以SPME萃取其揮發(fā)性香氣成分后借助GC-MS檢測分析。由表3結果可知，經(jīng)乳酸菌單菌株發(fā)酵后可檢測到主要香氣成分16種。值得注意的是，部分醇類、酯類、醛類、酮類、酚類以及臭豆腐臭味氣息的主要來源吲哚及部分硫醚類物質均在菌株發(fā)酵過程中產(chǎn)生。其中植物乳桿菌1-1、植物乳桿菌1-3和乳酸乳球菌3-1發(fā)酵產(chǎn)品中醇、酯類揮發(fā)性物質豐度較高，可為鹵液貢獻濃厚、醇香的氣味，而戊糖片球菌4-1及戊糖片球菌2-2發(fā)酵產(chǎn)品中吲哚及硫醚類物質豐度較高，此類物質為臭豆腐臭味氣息的主要來源，將會對香氣特征形成產(chǎn)生突出貢獻。

表3 單菌株發(fā)酵臭豆腐發(fā)酵鹵液中特征香氣成分及其相對含量Table 3 The relative content of volatile compounds of fermented stinky Tofu brine fermented by single strain

2.5 多菌株復配發(fā)酵

綜合上述分離所得菌株的蛋白水解能力、抑菌能力、發(fā)酵能力及單菌株發(fā)酵臭豆腐發(fā)酵鹵液香氣成分的實驗結果，評級結果如表4所示，篩選出戊糖片球菌2-2、植物乳桿菌1-1、植物乳桿菌1-3、植物乳桿菌3-3、乳酸乳球菌3-1、戊糖片球菌4-1、植物乳桿菌1-2、戊糖片球菌3-4進行混合發(fā)酵，分別在0、6、12、18、24 h測定其生長曲線、發(fā)酵液酸度、pH值及顏色變化。由圖3可知，上述8株菌經(jīng)混合發(fā)酵后發(fā)酵能力有所提升，且發(fā)酵終點菌濃明顯高于單株乳酸菌發(fā)酵菌濃，發(fā)酵約18 h菌濃達到1013～1014CFU/mL。分析酸度變化后發(fā)現(xiàn)，乳酸菌在發(fā)酵前期產(chǎn)酸能力較強，pH逐漸下降；發(fā)酵后期產(chǎn)酸能力下降，pH上升，發(fā)酵終點pH為6.75，每10 mL滴定酸度恢復至8.3°T。酸度過高會引起豆制品變質，并帶來令人不愉快的酸澀感，因此豆腐的浸泡應避開酸度較高的6～12 h，選擇在24～30 h時投放，由此可減少生產(chǎn)過程中食物變質等不安全因素，便于進行質量控制。與此同時觀察到發(fā)酵過程中鹵液顏色，由初始透明度高的青綠色轉變?yōu)橥该鞫鹊偷淖厣?/p>

表4 篩選條件綜合評價Table 4 Comprehensive evaluation of screening conditions

a-復配發(fā)酵液菌濃-時間變化; b-復配發(fā)酵液pH/酸度-時間變化圖3 乳酸菌復配發(fā)酵期間鹵液菌濃及pH/酸度Fig.3 Variation of bacterial concentration and pH/TA in compound strains fermented stinky Tofu brine

2.6 臭豆腐發(fā)酵鹵液揮發(fā)性香氣成分的分析

采用SPME對發(fā)酵前原料液、經(jīng)8株乳酸菌發(fā)酵所得及未添加外源菌種自然發(fā)酵所得的臭豆腐發(fā)酵鹵液中的揮發(fā)性成分進行萃取，其GC-MS分析的總離子流圖如圖4～圖6所示，共鑒定出揮發(fā)性香氣成分61種，如表5所示。

表5 臭豆腐發(fā)酵鹵液揮發(fā)性香氣成分及其相對含量Table 5 The relative content of volatile compounds of fermented stinky Tofu brine

圖4 未發(fā)酵鹵液揮發(fā)性香氣成分的GC-MS圖譜Fig.4 GC-MS chromatogram of stinky Tofu brine before fermented by compound strains

圖5 發(fā)酵后臭豆腐鹵液揮發(fā)性香氣成分的GC-MS圖譜Fig.5 GC-MS chromatogram of stinky Tofu brine after fermented by compound strains

圖6 自然發(fā)酵所得臭豆腐鹵液揮發(fā)性香氣成分的GC-MS圖譜Fig.6 GC-MS chromatogram of stinky Tofu brine after natural fermentation

由實驗結果可知，鑒定出的揮發(fā)性香氣成分包含烯烴類19種、醇類12種、酯類8種、酸類5種、醛類3種、酮類4種、其他(包括胺類、硫醚類、吲哚、酚類等)10種。賀靜等分析臭豆腐鹵液發(fā)酵過程中的揮發(fā)性香氣成分相對含量較高的有醇類、酮類、酯類、醛類等[6]，與本實驗一致。

2.6.1 醇、酯類

醇類物質在發(fā)酵過程中豐度普遍上升，與未添加外源菌種的自然發(fā)酵產(chǎn)品相比，其豐度及種類均有所增加，且較之單菌株發(fā)酵產(chǎn)品總體豐度顯著提高。差別較為顯著的有正丁醇及芳樟醇，它們可以賦予鹵液醇厚香氣，構成其重要的香氣特征[8]。劉玉平等[9]及鄭小芬等[7]均報道了臭豆腐的香氣中有高豐度的正丁醇。

本混合菌株發(fā)酵鹵液中酯類物質除乙酸丁酯外均由發(fā)酵產(chǎn)生，其中對香氣生成貢獻明顯的有乙酸丁酯、乙酸己酯和戊酸乙酯，較之單菌株發(fā)酵產(chǎn)品種類顯著增多。自然發(fā)酵產(chǎn)品中酯類物質僅有2種且豐度較低。酯類物質多為果木香和甜香香氣，乳酸菌可利用有機酸和醇通過非酶催化的酯化反應生成[10]。萬力婷等[11]也曾報道在發(fā)酵莧菜梗過程中檢測到豐度較低的酯類物質，由于酯類化合物芳香閾值極低，低豐度情況下仍是鹵液特征香氣的重要組成[12]。

2.6.2 酸類

混合菌株發(fā)酵鹵液中酸類物質大部分在發(fā)酵過程中豐度降低甚至消失，總豐度極低，而在自然發(fā)酵產(chǎn)品中其相對豐度較高。酸類物質往往會呈現(xiàn)令人不愉快的酸敗氣味，對感官產(chǎn)生不良影響，篩選出的8株乳酸菌進行規(guī)范化發(fā)酵對此現(xiàn)象有良好的抑制作用，有助于優(yōu)化產(chǎn)品風味。

2.6.3 醛、酮類

醛類物質在發(fā)酵前原料液中未檢測到，其均為混合菌株發(fā)酵過程中產(chǎn)生。而自然發(fā)酵產(chǎn)品中醛類物質僅有檸檬醛一種且豐度極低，且較之單菌株發(fā)酵產(chǎn)品其豐度顯著提升。有研究表明，莧菜梗只有在發(fā)酵過程中才會檢測到醛類物質[12]，與本實驗結果類似?；旌暇臧l(fā)酵鹵液中鑒定所得酮類物質共3種，較自然發(fā)酵和單菌株發(fā)酵鹵液其豐度、種類均有明顯提升，3-辛酮具果實香氣，對鹵液香氣特征有重要影響。

2.6.4 其他

混合發(fā)酵液中可被鑒別的其他類別的物質大部分在發(fā)酵過程中產(chǎn)生。其中丙胺具有氨氣味，硫醚類物質由乳酸菌降解含硫氨基酸得到，含硫化合物對于食物香氣特征有著本質貢獻。吲哚經(jīng)微生物降解氨基酸產(chǎn)生，在發(fā)酵鹵液中豐度很高，有強烈的糞臭味氣息，其芳香閾值很低, 為鹵液重要的特征香氣成分。混合發(fā)酵鹵液中吲哚相對豐度(27.91%)較單菌株發(fā)酵鹵液有明顯增加，鹵液香氣特征更為鮮明。賀靜等報道鹵液發(fā)酵原料中未檢測到吲哚，而發(fā)酵過程中吲哚始終存在[13]，為臭豆腐發(fā)酵鹵液特有成分；劉玉平等[14]、孫潔雯等[15]及鄭小芬等[7]也檢測到較高豐度吲哚的存在。

綜上所述，臭豆腐鹵液香氣特征的形成與乳酸菌發(fā)酵過程密切相關，發(fā)酵原料在微生物的代謝過程中生成香氣成分或將其轉化。經(jīng)分析可初步判斷，本實驗中臭豆腐發(fā)酵鹵液的主體香氣成分為2-蒈烯、γ-松油烯、正丁醇、桉樹醇、芳樟醇、乙酸丁酯、乙酸己酯、戊酸乙酯、檸檬醛、橙花醛、3-辛酮、2-十三烷酮。臭豆腐發(fā)酵鹵液的典型香氣成分為二甲基二流醚、二甲基三硫醚、二甲基四硫醚和吲哚。

3 結論

本課題以實驗室前期從自然發(fā)酵的臭豆腐鹵液中分離得到13株乳酸菌為研究對象，通過評價其發(fā)酵能力、抑菌活性、蛋白水解能力以及對發(fā)酵臭豆腐鹵液香氣形成的貢獻作用，優(yōu)選其中8株復配并進行臭豆腐鹵液的發(fā)酵。該發(fā)酵菌種配方具有菌種來源明確、發(fā)酵周期短、蛋白水解能力強、具有抑菌活性等顯著優(yōu)點，既可以有效預防傳統(tǒng)發(fā)酵食品生產(chǎn)過程中存在的食品安全隱患，同時可以獲得營養(yǎng)豐富，品質穩(wěn)定的發(fā)酵產(chǎn)品。采用GC-MS分析發(fā)酵鹵液中的揮發(fā)性香氣成分，共鑒定得到61種。通過歸類分析可知本實驗中臭豆腐發(fā)酵鹵液的典型香氣成分為二甲基二硫醚、二甲基三硫醚、二甲基四硫醚和吲哚。對比文獻可知,乳酸菌發(fā)酵的臭豆腐發(fā)酵鹵液產(chǎn)品香氣特征與傳統(tǒng)發(fā)酵臭豆腐鹵液相仿，可以替代傳統(tǒng)發(fā)酵方式，為傳統(tǒng)食品的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

續(xù)表5