劉佳樂，周朝暉，李鐵橋，盧麗玲，方芳*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)2(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)3(廣東珠江橋生物科技股份有限公司，廣東 中山，528415)

醬油發(fā)酵是一個多種微生物共同參與的混菌發(fā)酵過程，在其釀造過程中微生物群落組成、演替和功能代謝對醬油品質(zhì)有著重要的影響。因此，微生物是是醬油發(fā)酵的核心[1-2]，系統(tǒng)解析醬油發(fā)酵主要微生物對醬油風(fēng)味的形成機理和品質(zhì)的影響，有助于利用生物技術(shù)進行發(fā)酵過程優(yōu)化控制，從而保證醬油產(chǎn)品品質(zhì)的穩(wěn)定和提高其食品安全性[3-4]。

參與醬油釀造的微生物種類繁多，主要包括曲霉、酵母菌、乳酸菌以及其他細菌。曲霉主要在制曲階段和發(fā)酵初期發(fā)揮作用，決定原料發(fā)酵成熟的快慢以及成品的色澤。酵母菌對醬油風(fēng)味的形成具有重要作用，主要包括魯氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)、埃切假絲酵母(Candidaetchellsii)、易變球擬酵母(Torulopsisversatilis)等[5]。魯氏接合酵母用于醬油發(fā)酵前期，能將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇，同時還能產(chǎn)生多種酯類、呋喃酮等風(fēng)味物質(zhì)[6]。乳酸菌是參與醬油發(fā)酵的主要細菌，在醬油生產(chǎn)過程中具有拮抗雜菌、提升風(fēng)味和縮短發(fā)酵周期的作用[7-8]。

嗜鹽四聯(lián)球菌(Tetragenococcushalophilus)是一類參與醬油發(fā)酵的耐鹽乳酸菌[9]，其某些菌株具有胞內(nèi)氨肽酶活性，可以用來提高魚醬中谷氨酸的含量[10-11]。將嗜鹽四聯(lián)球菌和酵母菌結(jié)合作為發(fā)酵劑應(yīng)用在發(fā)酵食品生產(chǎn)過程中，可使發(fā)酵食品中風(fēng)味更加豐富[8, 12]。已有研究表明，在醬油發(fā)酵過程中添加酵母菌和嗜鹽四聯(lián)球菌可使醬油中揮發(fā)性物質(zhì)總量增加2.2倍，其中酸、醇、酯、酚、吡嗪類物質(zhì)含量顯著增加[13]。此外，嗜鹽四聯(lián)球菌還對發(fā)酵食品安全有著有利的影響，可以減少醬油和發(fā)酵食品中危害物氨基甲酸乙酯及生物胺含量等[14]。

研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌和酵母菌在醬醪中通過物質(zhì)代謝產(chǎn)生拮抗作用。例如，酵母菌進行乙醇發(fā)酵時會抑制乳酸菌的乳酸發(fā)酵，而乳酸菌的某些代謝物也會對酵母菌產(chǎn)生抑制作用。在醬油混菌發(fā)酵過程中，乳酸菌和酵母菌的添加時期及添加量對醬醪發(fā)酵有顯著影響，這種影響還隨菌種改變而不同[15]。目前雖然對醬油發(fā)酵過程中添加嗜鹽四聯(lián)球菌、酵母菌做了一定的研究，但嗜鹽四聯(lián)球菌和酵母菌在醬油發(fā)酵過程中的相互作用關(guān)系以及對醬油發(fā)酵體系中物質(zhì)代謝的影響尚不明確。因此，本研究以高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過程為研究對象，通過嗜鹽四聯(lián)球菌和魯氏接合酵母菌不同添加方式對體系中微生物生長和醬油發(fā)酵的影響進行評價，以期為醬油現(xiàn)代生產(chǎn)技術(shù)的提升提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

醬油曲精(米曲霉滬釀3.042)購自久味科技；嗜鹽四聯(lián)球菌R44和魯氏接合酵母ZQ02為本實驗室保藏菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基

嗜鹽四聯(lián)球菌培養(yǎng)基〔MRS培養(yǎng)基(g/L)〕：蛋白胨10.0、牛肉粉5.0、酵母粉4.0、葡萄糖20.0、K2HPO42.0、乙酸鈉5.0、檸檬酸三銨2.0、MgSO4·7H2O 0.2、MnSO4·4H2O 0.1、吐溫-80 1.0。使用時添加100 g/L NaCl，調(diào)pH至7.0。

魯氏接合酵母培養(yǎng)基〔YPD培養(yǎng)基(g/L)〕：葡萄糖20.0、酵母膏10.0、蛋白胨20.0。調(diào)pH至5.0。

孟加拉紅固體培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨5.0、葡萄糖10.0、KH2PO41.0、MgSO4·7H2O 0.5、孟加拉紅0.033、氯霉素0.1、瓊脂20.0。

1.1.3 主要試劑和儀器

16種常見氨基酸混合標(biāo)樣、鄰苯二甲醛試劑，美國 Agilent 公司；酵母膏、胰蛋白胨和 MRS 培養(yǎng)基，英國 Oxoid 公司；納他霉素，青島寶博生物科技有限公司；乙腈和甲醇(色譜純)，中國上海默克化工技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

HH-B11·420 BS恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司；氣相-高通量飛行時間質(zhì)譜儀，美國力可公司；高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；酶標(biāo)儀，美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)

嗜鹽四聯(lián)球菌的培養(yǎng)：從平板上挑取菌落到MRS培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)60 h，按體積分數(shù)1%的接種量轉(zhuǎn)接，培養(yǎng)至 OD600達到1.2。

魯氏接合酵母的培養(yǎng)：從平板上挑取菌落到Y(jié)PD培養(yǎng)基中，30 ℃，220 r/min培養(yǎng)30 h，按體積分數(shù)1%的接種量轉(zhuǎn)接，培養(yǎng)至 OD600達到 4.0。

1.2.2 醬油發(fā)酵工藝

制曲工藝：將豆粕用1.2倍的水浸泡2 h，在121 ℃下滅菌 15 min，冷卻至室溫。按原料質(zhì)量(混合后總質(zhì)量)接入質(zhì)量分數(shù)0.15%的米曲霉孢子粉，先把孢子粉與適量炒熟的小麥顆?；旌暇鶆?，然后再和豆粕按體積比4∶6的比例充分拌勻。在生化培養(yǎng)箱中進行30 ℃培養(yǎng)，保持濕度，適時翻曲，制曲48 h，曲料表面長滿黃綠色菌絲即為成曲。

發(fā)酵工藝：將成曲與含200 g/L NaCl的鹽水以體積比1∶1.8的比例混合。將混合后的醬醪分裝入2 L壇子中，30 ℃發(fā)酵75 d。發(fā)酵第1周每天攪拌1次，第2～6周每2 d攪拌1次，后期每周攪拌2次。

菌株的添加方式：當(dāng)醬醪pH 5.2左右時(發(fā)酵15 d)添加107CFU/g的魯氏接合酵母(魯氏接合酵母在酸性條件下生長)[16-7]。嗜鹽四聯(lián)球菌添加時間為15、25、35 d，添加量為106CFU/g。本研究中醬油發(fā)酵過程菌株的添加方式如表1所示。

表1 醬油發(fā)酵過程菌株的添加Table 1 Addition of strains during soy sauce fermentation

1.2.3 嗜鹽四聯(lián)球菌和酵母菌數(shù)量的測定

嗜鹽四聯(lián)球菌和酵母菌數(shù)量測定均采用平板計數(shù)法。稱取 1 g 醬醪倒入盛有滅菌玻璃珠和 99 mL 生理鹽水的錐形瓶中混勻，梯度稀釋后涂布到MRS(含納他霉素，100 g/L NaCl)平板和孟加拉紅瓊脂(丙酸鈉5 g/L，100 g/L NaCl)平板，30 ℃培養(yǎng)3～6 d后計數(shù)。嗜鹽四聯(lián)球菌為兼性厭氧菌，平板培養(yǎng)為4～6 d出現(xiàn)小菌落。因此，MRS平板計數(shù)時可以和醬醪中優(yōu)勢耐鹽細菌(主要是Weissella、Staphylococcus)區(qū)分。本方法所計算的酵母數(shù)量包括添加的魯氏接合酵母，以及醬醪中耐鹽酵母(如球擬酵母，假絲酵母等)。后者與前者相比數(shù)量較少，可忽略不計。

在第15、20、25、30、35、40、45、60和75 天進行取樣。取 100 g 醬醪于離心管中，12 000 r/min 離心 30 min，取上清液并用孔徑為 0.22 μm的濾膜過濾進行理化指標(biāo)測定。醬醪pH的測定采用精密 pH 計測定;總酸含量的測定采用酸度計法[18];氨基酸態(tài)氮含量的測定采用甲醛滴定法[19];還原糖含量的測定采用 3,5-二硝基水楊酸法[19]。

1.2.5 游離氨基酸的測定

游離氨基酸測定采用高效液相色譜法[20]。取 1 mL醬油樣品，用質(zhì)量分數(shù)5%的三氯乙酸稀釋20倍后，常溫下避光放置 30 min，用孔徑為 0.22 μm 的水系濾膜過濾取濾液待測定。色譜條件：色譜柱 C18(250 mm×4.6 mm);檢測波長 338 nm;柱溫 40 ℃;流動相 A 相(1 L)：無水乙酸鈉 5 g，四氫呋喃5 mL，三乙胺 200 μL，pH 7.2;流動相 B 相(1 L)：無水乙酸鈉 5 g，超純水200 mL，甲醇 400 mL，乙腈 400 mL，pH 7.2。

1.2.6 揮發(fā)性物質(zhì)的測定

發(fā)酵結(jié)束時每個樣品取3個平行樣，過濾混勻后準確量取5 mL醬油樣品，采用固相微萃取聯(lián)合氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(solid phase microextraction-gas chromatograph-mass spectrometer,SPME-GC-MS)對其中揮發(fā)性物質(zhì)進行測定。樣品處理方法為：添加 83.36 μg/L的 2-辛醇作為內(nèi)標(biāo)。固相微萃取方法、GC-MS分析方法以及數(shù)據(jù)處理參照文獻[16]。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

使用 SPSS 19.0 對數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析，所有試驗均重復(fù)3次。

主站硬件構(gòu)成包括前置采集機、數(shù)據(jù)庫的服務(wù)器、分析工作站、維護工作站等部分。數(shù)據(jù)庫服務(wù)器可以用于存放濾波器文件進行管理。其中前置采集機主要是被用作子站的通信設(shè)備系統(tǒng)，方便更好的獲取信息。主站系統(tǒng)中的分析工作站主要是用于對數(shù)據(jù)信息的分析和查詢，并及時做好統(tǒng)計工作。維護工作站的需要對設(shè)備進行及時維護，確保設(shè)備的安全穩(wěn)定運行。

2 結(jié)果和分析

2.1 發(fā)酵過程中嗜鹽四聯(lián)球菌和酵母菌數(shù)量的動態(tài)變化

在醬油發(fā)酵過程中嗜鹽四聯(lián)球菌的生長與物質(zhì)代謝受環(huán)境因素(pH、營養(yǎng)物質(zhì))和體系中其他微生物(米曲霉、酵母、其他細菌)相互作用的影響。為了確定可以通過添加菌株起到在醬油發(fā)酵過程強化嗜鹽四聯(lián)球菌的作用，考察了添加時間和酵母菌干預(yù)對嗜鹽四聯(lián)球菌生長的影響。由圖1可知，添加嗜鹽四聯(lián)球菌可以起到在醬油發(fā)酵過程中強化該菌的作用。單獨添加嗜鹽四聯(lián)球菌，可使醬醪中該類菌數(shù)量增加1.9～3.0個數(shù)量級。在酵母活躍期內(nèi)(25 d)添加嗜鹽四聯(lián)球菌，增殖較為緩慢，數(shù)量最多增加1.9個數(shù)量級；非酵母活躍期(15、35 d)時添加嗜鹽四聯(lián)球菌，數(shù)量可增加2.2個數(shù)量級(圖1-a)。此外，單獨添加嗜鹽四聯(lián)球菌或魯氏接合酵母，醬醪中該類菌數(shù)量均高于添加混合菌。這說明嗜鹽四聯(lián)球菌和魯氏接合酵母間存在一定的相互影響，可能是因為它們對營養(yǎng)物質(zhì)的相互競爭，或受到對方特定代謝產(chǎn)物的抑制。乳酸菌產(chǎn)生的乙酸、苯乳酸、環(huán)肽等化合物都能對酵母生長產(chǎn)生抑制，而酵母代謝產(chǎn)生的乙醇、脂肪酸等同樣不利于乳酸菌的生長[21-23]。未添加嗜鹽四聯(lián)球菌和酵母菌的醬醪中，也檢測到了嗜鹽四聯(lián)球菌(7×104～9×105) CFU/g和酵母菌(2×103～3×104) CFU/g，這可能是醬醪體系中含有的嗜鹽四聯(lián)球菌、片球菌(Pediococcus)和酵母菌。

a-嗜鹽四聯(lián)球菌; b-酵母菌圖1 醬油發(fā)酵過程中嗜鹽四聯(lián)球菌和酵母菌數(shù)量的動態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes in cell numbers of T.halophilus and yeast during soy sauce fermentation.

2.2 嗜鹽四聯(lián)球菌對醬醪理化指標(biāo)的影響

對醬油發(fā)酵過程中醬醪的 pH、總酸、還原糖和氨基酸態(tài)氮等理化指標(biāo)分析表明，添加嗜鹽四聯(lián)球菌使醬醪pH略有下降，總酸含量少量增加，而氨基酸態(tài)氮含量顯著增加(圖2)。

發(fā)酵0～45 d醬醪中氨基酸態(tài)氮含量快速增加，添加嗜鹽四聯(lián)球菌的醬醪中氨基酸態(tài)氮含量高于對照；發(fā)酵45～75 d時添加嗜鹽四聯(lián)球菌的醬醪中氨基酸態(tài)氮含量增幅高于對照。在第15天添加魯氏接合酵母，第25天添加嗜鹽四聯(lián)球菌的醬醪發(fā)酵75 d時氨基酸態(tài)氮含量為7.7 g/L，比對照高12.7%。

a-pH的動態(tài)變化; b-總酸的動態(tài)變化; c-還原糖的動態(tài)變化; d-氨基態(tài)氮的動態(tài)變化圖2 醬油發(fā)酵過程中理化指標(biāo)變化Fig.2 Detection of the physicochemical parameters of Moromi mash during soy sauce fermentation

2.3 嗜鹽四聯(lián)球菌對醬油游離氨基酸含量的影響

游離氨基酸對發(fā)酵食品尤其是以蛋白為主要發(fā)酵基質(zhì)的大豆發(fā)酵食品獨特滋味和香氣的形成具有重要貢獻[24]。游離氨基酸含量是衡量醬油品質(zhì)的主要理化指標(biāo)之一。通過分析比較上述發(fā)酵方式獲得的醬油中游離氨基酸發(fā)現(xiàn)，添加嗜鹽四聯(lián)球菌或酵母菌的醬油氨基酸總量要高于對照。單獨添加嗜鹽四聯(lián)球菌、15 d同時添加酵母菌和嗜鹽四聯(lián)球菌、先添加酵母菌并在25 d添加嗜鹽四聯(lián)球菌、先添加酵母菌并在35 d添加嗜鹽四聯(lián)球菌的醬油中總氨基酸含量分別提高了14.6%、21.1%、34.0%、23.9%(表2)。先添加魯氏接合酵母并在25 d添加嗜鹽四聯(lián)球菌的醬油中Asp、Glu和Ala含量增幅最顯著，分別提高了53.0%、26.0%和14.5%，其中Asp和Glu都是醬油鮮味的主要來源[25]。前期研究證實，嗜鹽四聯(lián)球菌R44可以合成寡肽酶和氨肽酶等蛋白酶，這一特性可能對醬油中氨基酸的含量增加起到了作用[26-28]。

表2 醬油中游離氨基酸的含量 單位：mg/mLTable 2 Quantification of amino acids in different soy sauce samples

為進一步分析嗜鹽四聯(lián)球菌對醬油中游離氨基酸的貢獻，比較了強化嗜鹽四聯(lián)球菌對醬油中鮮味氨基酸(Asp、Glu)和甜味氨基酸(Asp、Thr、Ala和Ser)含量的影響。由圖3可知，強化嗜鹽四聯(lián)球菌使醬油中鮮味氨基酸和甜味氨基酸含量顯著增加。同提高游離氨基酸總量的強化菌株方式一樣，鮮味和甜味氨基酸含量增加最多的也是第15天添加魯氏接合酵母并在第25天添加嗜鹽四聯(lián)球菌；采用此種強化菌株的方式，醬油中鮮味氨基酸和甜味氨基酸含量分別增加到16.4 g/L和9.6 g/L，比對照提高了34.0%和27.0%。

a-鮮味氨基酸; b-甜味氨基酸圖3 不同醬油樣品中鮮味和甜味氨基酸含量Fig.3 Taste characteristics of amino acids in different soy sauce samples注：*：P<0.05，**：P<0.01

2.4 嗜鹽四聯(lián)球菌對醬油中揮發(fā)性物質(zhì)的影響

醬油中風(fēng)味物質(zhì)是在微生物作用下，原料中蛋白質(zhì)、淀粉等大分子物質(zhì)被水解生成的各種次級產(chǎn)物和小分子終產(chǎn)物的總和，主要包括醇類、醛酮類、酯類、酸類、酚類，雜環(huán)化合物等。其中醇類、醛類和酯類物質(zhì)的種類最多，是醬油風(fēng)味物質(zhì)的重要組成[29]。通過 SPME-GC-MS分析方法研究了添加嗜鹽四聯(lián)球菌和酵母菌對醬油風(fēng)味的影響。在6種發(fā)酵方式的醬油樣品中共檢測出118種揮發(fā)性物質(zhì)，這些化合物包括17種醇、20種醛、15種酸、26種酯、14種酮類、4種烷烴、7種酚和15種雜環(huán)化合物(附件1)。各類醬油樣品中揮發(fā)性物質(zhì)種類總數(shù)差異不大，但組成存在明顯差異。6種醬油樣品中共同檢測到的揮發(fā)性物質(zhì)只有24種。

對醬油樣品的揮發(fā)性物質(zhì)含量分析發(fā)現(xiàn)，添加嗜鹽四聯(lián)球菌可使醬油樣品揮發(fā)性物質(zhì)含量增加1.5～2.4倍(表3)。單獨添加嗜鹽四聯(lián)球菌或酵母菌、以及在不同時間添加兩者的醬油中風(fēng)味物質(zhì)形成均優(yōu)于同一時間添加嗜鹽四聯(lián)球菌和酵母菌或不添加菌株的對照；在添加魯氏接合酵母后10 d或20 d添加嗜鹽四聯(lián)球菌可使醬油中風(fēng)味物質(zhì)總量顯著增加。進一步分析發(fā)現(xiàn)，第25天添加嗜鹽四聯(lián)球菌醬油中酸類、酚類和雜合類物質(zhì)含量較高；第35天添加嗜鹽四聯(lián)球菌醬油中醇類和酯類物質(zhì)含量較高。醬油樣品中揮發(fā)性物質(zhì)出現(xiàn)較大差異和嗜鹽四聯(lián)球菌、魯氏接合酵母的添加有著直接關(guān)系。

表3 醬油中主要揮發(fā)性物質(zhì)的比較 單位：μg/LTable 3 Comparison of the content of volatiles in soy sauce

為進一步比較嗜鹽四聯(lián)球菌添加方式對醬油風(fēng)味的影響，將醬油中主要風(fēng)味物質(zhì)[30-34]進行了聚類分析。由圖4可知，在醬油發(fā)酵過程中強化嗜鹽四聯(lián)球菌或其與魯氏接合酵母可使醬油中主要風(fēng)味物質(zhì)(醇、酸、酯、酚、吡嗪等)含量顯著增加，尤其是共同添加2種菌時，風(fēng)味物質(zhì)含量增加最多。

醇類主要是在酵母作用下生成的，嗜鹽四聯(lián)球菌也能產(chǎn)生乙醇和高級醇，并且嗜鹽四聯(lián)球菌在接入酵母菌20 d后添加會促進醇類的合成。單獨添加嗜鹽四聯(lián)球菌，醬油中醇類總量比對照提高了1.9倍，其中乙醇、異戊醇、異丁醇、苯乙醇、3-甲硫基丙醇等物質(zhì)的含量顯著增加；在非酵母活躍期(35 d)添加嗜鹽四聯(lián)球菌，使醇類總量提高2.8倍(圖4-a)。酸類物質(zhì)主要由嗜鹽四聯(lián)球菌發(fā)酵產(chǎn)生，高濃度的有機酸類對于形成濃郁的酯香起著積極作用。單獨添加嗜鹽四聯(lián)球菌可以使醬油中乙酸、異戊酸含量增加；在酵母活躍期(25 d)添加嗜鹽四聯(lián)球菌，二甲基丙二酸和戊酸分別比對照高36.9和15.8倍(圖4-b)。只添加嗜鹽四聯(lián)球菌可使醬油中乙酸乙酯、乳酸乙酯、乳酸異戊酯等酯類含量顯著增加，酯類總量比對照高3.7倍，這和添加嗜鹽四聯(lián)球菌發(fā)酵產(chǎn)生的大量乙酸、乳酸有關(guān)；在酵母活躍期(25 d)添加嗜鹽四聯(lián)球菌不利于酯類生成；在非酵母活躍期，尤其是發(fā)酵35 d添加嗜鹽四聯(lián)球菌有利于乙酸乙酯、苯乳酸酯、棕櫚酸乙酯的合成，酯類總量比對照高8.9倍(圖4-c)。酚類是構(gòu)成醬油特征香氣的重要成分，接種嗜鹽四聯(lián)球菌的醬油中酚類物質(zhì)的含量相對較高，愈創(chuàng)木酚、4-乙基-愈創(chuàng)木酚和對乙基愈創(chuàng)木酚含量分別是對照的2.1、1.6和2.4倍(圖4-d)。醛類物質(zhì)的合成和嗜鹽四聯(lián)球菌有關(guān)，含有醛類物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)氨酶，添加嗜鹽四聯(lián)球菌使醬油中主要醛類化合物(3-甲基丁醛、己醛、壬醛、糠醛、苯甲醛、苯乙醛等)含量顯著增加(圖4-e)。同時添加嗜鹽四聯(lián)球菌也有利于2-戊酮、2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪等物質(zhì)含量的提高(圖4-f)。有6種風(fēng)味物質(zhì)(3-甲硫基丙醇、異戊酸、乳酸異戊酯、DL-白氨酸乙酯、苯甲酸乙酯、4-乙基愈創(chuàng)木酚)在單獨添加嗜鹽四聯(lián)球菌的醬油中可以檢測到，而在對照組中沒有檢出。此外，醬油中的重要香氣成分呋喃酮是酵母的一種代謝產(chǎn)物，嗜鹽四聯(lián)球菌的添加會顯著促進呋喃酮的合成。第15天接入魯氏接合酵母并在第35天接入嗜鹽四聯(lián)球菌的醬油中其含量是對照的7.4倍，是只添加魯氏接合酵母的1.4倍。

a-醇類; b-酸類; c-酯類; d-酚類; e-醛類; f-其他圖4 醬油中主要風(fēng)味物質(zhì)聚類分析Fig.4 Clustering analyses of major volatiles in soy sauce samples

3 結(jié)論

本研究通過在醬油發(fā)酵過程中添加嗜鹽四聯(lián)球菌，實現(xiàn)了嗜鹽四聯(lián)球菌的成功強化。醬油發(fā)酵過程中嗜鹽四聯(lián)球菌的生長和物質(zhì)代謝與魯氏接合酵母有一定的關(guān)聯(lián)性。強化嗜鹽四聯(lián)球菌可以提高醬油中氨基態(tài)氮、游離氨基酸和風(fēng)味物質(zhì)的含量。發(fā)酵15 d添加酵母菌并在25 d添加嗜鹽四聯(lián)球菌可使氨基酸總量增加34.0%，其中鮮味氨基酸和甜味氨基酸分別增加了34.0%和27.0%。單獨添加嗜鹽四聯(lián)球菌使揮發(fā)性物質(zhì)總量提高了154.5%，包括異戊醇、苯乙醇、苯乙醛、糠醛、乳酸乙酯、對乙基愈創(chuàng)木酚等19種風(fēng)味物質(zhì)含量顯著增加。嗜鹽四聯(lián)球菌與魯氏接合酵母共同添加更有利于風(fēng)味物質(zhì)形成，醇類、酸類、酯類和酚類含量最高可以分別增加282.7%、1612.0%、895.4%和123.6%。在先添加魯氏接合酵母時，嗜鹽四聯(lián)球菌添加時間在對各類風(fēng)味物質(zhì)含量增加的影響上不完全具有一致性：在25 d添加嗜鹽四聯(lián)球菌有利于酸類、酚類和雜合類物質(zhì)含量的提高；在35 d添加嗜鹽四聯(lián)球菌有利于醇類和酯類物質(zhì)含量的提高。本研究結(jié)果闡明了高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過程中嗜鹽四聯(lián)球菌在影響氨基酸和風(fēng)味物質(zhì)含量方面的功能，可為醬油發(fā)酵過程中強化功能菌株提供參考，對于開發(fā)提高醬油品質(zhì)的生物技術(shù)具有重要意義。

附表1 醬油樣品中揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量
Appendix Table 1 Relative content of Volatiles in soy sauce samples

物質(zhì)保留時間/minCAS含量/(μg·L-1)對照TZZ+TZ+T(25)Z+T(35)醇類Ethanol4.42764-17-15100.36335.92776.41489.49104.981157.942-Butanol6.29578-92-2ND0.29NDNDNDNDIsobutanol8.05378-83-110.4132.6534.0133.6811.8346.362-Pentanol8.6516032-29-70.741.332.012.281.533.051-Butanol9.23771-36-30.230.999.045.931.5125.813-Methyl-1-butanol10.795123-51-3319.49791.99428.16466.55653.54546.203-Isopentenylalcohol11.685763-32-61.802.850.390.612.030.932-Heptanol13.362543-49-7NDNDND2.98NDND2-Undecanol13.3511653-30-15.26NDNDNDNDNDHexylalcohol14.079111-27-30.27ND0.600.52NDND2-Chloroethanol14.512107-07-30.621.240.610.461.030.563-Heptanol,5-methyl-14.85218720-65-5NDNDND0.20NDND3-Pentanol15.141584-02-1ND0.110.250.20ND0.523-Methylthiopropanol19.833505-10-2ND5.983.3511.03ND13.94Benzylalcohol21.624100-51-6ND1.24NDNDND0.63Benzeneethanol22.07860-12-898.42218.87148.19198.00471.62264.323-Hydroxy-2-methyl-4-pyrone22.508118-71-80.812.251.381.163.47NDSubtotal538.411395.711404.41213.091251.542060.26醛類(20)3-Methylbutyraldehyde3.99590-86-37.6912.238.6213.9721.8315.53Hexana7.4366-25-17.2519.32ND2.0111.8212.752-methyl-2-butenal7.698497-03-0ND0.45ND0.564.70NDHeptaldehyde9.968111-71-71.421.280.52ND0.79NDoctanal12.529124-13-05.814.382.514.184.506.341-Nonanal14.788124-19-68.9416.117.368.137.2614.94Furfural16.0298-01-12.154.983.143.863.235.55Benzaldehyde17.003100-52-710.5617.1115.8920.33ND22.86(Z)-6-Nonenal17.1832277-19-20.74NDNDNDNDNDUndecanal18.168112-44-70.10ND0.15NDNDNDPhenylacetaldehyde18.677122-78-15.3618.7410.0015.3922.0218.902-Methylbenzaldehyde18.79529-20-41.703.62ND3.35ND4.55gamma-Nonanolactone23.168104-61-0NDNDND1.162.32NDtrans,trans-2,4-Nonadienal19.4645910-87-2NDNDNDND0.280.35trans-2-Undecenal20.07353448-07-09.612.00NDNDND2.122,4-nonadienal20.21821662-15-70.210.55NDNDNDND2,4-Decadienal20.7692363-88-40.320.97NDND0.900.80Undecan-4-olide23.169104-67-6ND0.91NDNDNDND5-Hydroxymethylfurfural27.71367-47-0NDNDNDND1.29NDSubtotal66.08105.2553.4375.3682.63106.71酸類(15)Aceticacid15.77364-19-73.8518.8721.9421.3212.9232.21Valericacid18.984109-52-441.34NDNDND694.35NDPropionicacid17.16779-09-4NDND0.12ND2.22NDDimethylmalonicacid17.608595-46-03.71NDND7.64140.713.16Isovalericacid18.983503-74-2ND132.14NDNDNDND3,3-Dimethylacrylicacid20.533541-47-9NDNDNDND0.42NDHexanoicacid21.083142-62-1NDNDNDND0.310.84Phosphonicacid22.82433795-18-5NDND0.38NDNDND4-Hydroxybenzenesulfonicacid22.82898-67-90.28NDND0.49NDNDOctanoicacid23.324124-07-20.100.280.340.21ND0.58

續(xù)表1

物質(zhì)保留時間/minCAS含量/(μg·L-1)對照TZZ+TZ+T(25)Z+T(35)Nonanoicacid24.356112-05-00.481.140.27ND0.650.59Decanoicacid25.334334-48-5NDND0.27NDNDNDPalmiticacid26.12357-10-3NDND0.82NDNDND2-Propenoicacid26.464614-60-8NDND0.73NDNDNDBenzoicacid26.90665-85-0NDND0.44ND0.33NDSubtotal49.76152.4425.3129.66851.9137.38酯類(24)Ethylacetate3.574141-78-61.0414.551.731.150.6975.5Methyl2-methylbutyrate5.819868-57-5ND0.29ND1.030.02NDIsobutylacetate5.898110-19-0NDND0.67NDND0.81Butylacetate5.903123-86-4NDNDND0.57NDEthyl2-methylpropanoate4.92797-62-10.10NDND0.37NDNDEthyl2-methylbutyrate6.8187452-79-10.96NDNDNDNDNDEthylcaproate11.23123-66-0NDND0.01ND1.87NDEthylisovalerate7.17108-64-51.17NDND0.63NDNDIsoamylacetate8.428123-92-20.930.933.202.800.483.98Isoamyl2-methylbutyrate12.27327625-35-0NDNDNDND0.17NDEthyllactate13.81497-64-30.899.144.184.01ND6.01octyl2-methylprop-2-enoate14.1882157-01-9NDND0.48NDNDNDIsopentyllactate17.71319329-89-6ND5.79NDNDNDNDEthyl2-hydroxyisocaproate16.91910348-47-7ND5.89NDNDNDNDalpha-methyl-gamma-butyrolactone17.9981679-47-60.18NDND1.985.47NDGamma-Valerolactone18.279108-29-20.621.16ND0.261.50NDMethylbenzoate18.44793-58-31.01ND0.25NDND1.59gamma-Butyrolactone18.5396-48-01.192.59NDNDNDNDEthylbenzoate19.04493-89-0ND1.867.53NDNDNDDiethylsuccinate19.099123-25-1NDND0.81NDND1.754-Hexanolide19.504695-06-70.340.670.340.351.070.45Ethylphenylacetate20.486101-97-30.291.011.492.04ND1.52gamma-Octanoiclactone23.17104-50-70.53NDNDNDNDNDEthylpalmitate25.199628-97-7NDND0.290.92ND0.46Diisobutylphthalate28.12784-69-5NDND0.51NDNDNDMethyllinolelaidate27.9172566-97-4NDNDND0.24NDNDSubtotal9.2543.8371.4646.3511.2792.07酮類(13)2-Butanone3.73678-93-3NDNDNDND4.33ND2-Pentanone5.126107-87-9ND1.211.860.373.601.803,4-Hexanedione4437-51-8NDNDND0.12ND0.133-Hydroxy-2-butanone12.464513-86-0ND0.611.48NDND2.734-Octen-3-one12.8314129-48-7NDND0.42NDND0.861-Octen-3-one12.8344312-99-61.57NDND0.85NDND4-methyloxolan-2-one18.3431679-49-80.410.85NDND1.39ND2,2,6-Trimethylcyclohexane-1,4-dione20.41520547-99-30.120.270.13ND0.40NDNDGeranylacetone21.2463796-70-1NDND0.14ND0.17NDMethylcyclopentenolone20.9780-71-7NDNDND0.09NDND3-Methylbut-2-enolide21.7016124-79-4NDNDNDND0.62NDMethylfuraneol23.74227538-09-64.73ND25.1915.8935.2335.62-Dodecanone24.0066175-49-10.32NDNDNDNDNDSubtotal7.152.9429.2217.3245.7441.12烷烴類(4)Octamethylcyclotetrasiloxane5.67556-67-2ND0.750.60.580.210.1Undecane7.6621120-21-4NDND1.40NDNDNDDecamethylcyclopentasiloxane9.473541-02-6ND0.290.330.330.430.51

續(xù)表2

物質(zhì)保留時間/minCAS含量/(μg·L-1)對照TZZ+TZ+T(25)Z+T(35)Oxirane,2-methyl-2-phenyl-20.8422085-88-31.222.973.663.853.204.57Subtotal1.224.015.994.763.845.18酚類(7)Guaiacol21.31790-05-11.723.522.062.515.103.17Phenol22.831108-95-2ND0.75NDND1.09ND4-Ethyl-2-methoxyphenol23.1242785-89-92.554.143.006.066.003.072-Ethylphenol24.49690-00-6NDNDND0.67ND0.394-Ethylphenol24.499123-07-9ND0.440.41ND0.84ND4-Hydroxy-3-methoxystyrene24.7247786-61-04.3510.561.556.303.452.652,4-Di-tert-butylphenol25.67496-76-40.250.421.550.800.320.40Subtotal8.8719.838.5716.3416.89.68雜合類(15)2-Pentylfuran11.1033777-69-30.390.48NDND0.480.802-Methylpyrazine12.029109-08-00.501.070.58NDNDND2,6-Dimethylpyrazine13.509108-50-90.651.500.790.683.741.67Ethylpyrazine14.6913925-00-3NDNDNDND0.490.562-Ethyl-6-methylpyrazine14.69413925-03-60.280.490.831.102.582.022,3,5-Trimethylpyrazine15.04814667-55-10.500.840.850.802.49ND3-Ethyl-2-methyl-1,3-hexadien15.22661142-36-7NDNDNDND0.29ND3-(Methylthio)propionaldehyde-dimer-(B)15.8773268-49-3ND10.15NDND13.17NDPyrazine,2-ethyl-3,5-dimethyl-16.07213925-07-0NDNDNDND0.981.11Tetramethylpyrazine16.2881124-11-4NDND0.290.100.640.632-ethyl-3,5,6-trimethylpyrazine16.90717398-16-2NDNDNDNDND0.66Ethyl2-furylketone17.7783194-15-8NDND0.51NDNDND5,5-dimethyl-4-propan-2-ylidene-1H-pyrazole18.093106251-09-61.07ND1.271.372.652.062,3-Dihydrobenzofuran26.47496-16-2ND0.71ND0.370.22NDSubtotal3.3915.245.124.4231.689.51總計684.131741.251603.51407.32295.412361.91

注：ND表示未檢出；T表示在15 d添加T.halophilusR44；Z表示在15 d添加Z.rouxiiZQ02；Z+T表示在15 d添加Z.rouxiiZQ02和T.halophilusR44；Z+T(25)表示在15 d添加Z.rouxiiZQ02并在25 d添加T.halophilusR44；Z+T(35)表示在15 d添加Z.rouxiiZQ02并在35 d添加T.halophilusR44