錢成，王鴻超，張秋香，趙建新，張灝，陳衛(wèi)，陸文偉,2*

1(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)2(揚州食品生物技術研究所(江南大學)，江蘇 揚州，225004)

炎性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)主要包括克羅恩病(Crohn’s disease, CD)和潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis, UC)[1]，其發(fā)病機制尚不明確，目前認為是由感染、遺傳、免疫等因素引起的[2]。現(xiàn)有的治療方法如氨基水楊酸類藥物、皮質(zhì)醇類藥物、免疫抑制劑、抗生素等雖然取得了一定的效果，但是副作用較大，不適合長期治療[1]。

在腸炎患者中，營養(yǎng)不良發(fā)生率很高，主要表現(xiàn)為體質(zhì)量丟失、兒童發(fā)生營養(yǎng)不良甚至會導致發(fā)育遲緩[3]。且在IBD的治療過程中藥物手術等因素會進一步加重營養(yǎng)障礙，而營養(yǎng)不良的發(fā)生可引起腸黏膜屏障的一系列病理生理變化，容易繼發(fā)各種并發(fā)癥。因此，增強IBD患者的營養(yǎng)支持至關重要[4]。近年來，我國制定了一系列特殊醫(yī)學用途配方食品(food for special medical purpose,FSMP)的法規(guī)標準，但由于其屬于新興領域，在原材料的選擇上研究較少，且已經(jīng)申請獲批的產(chǎn)品大多是針對嬰幼兒的，缺乏對特定疾病狀態(tài)的研究。研究表明，飲食影響著腸道微生物的組成、腸道屏障和宿主免疫，且攝入特定的飲食成分或飲食模式與腸炎之間存在關聯(lián)[5]。共軛亞油酸(conjugated linoleic acid,CLA)是一種新發(fā)現(xiàn)的營養(yǎng)素，具有抗炎和提高免疫等作用，最常見、最有活性的異構體為t9,c11-CLA和t10,c12-CLA。YUAN等[6]研究發(fā)現(xiàn)c9,t11-CLA可以通過調(diào)節(jié)PPAR γ的機制緩解結腸炎。益生菌具有改善腸道微生態(tài)、機體免疫等多種功能，已被廣泛應用于乳制品、嬰幼兒食品以及藥品等領域[7]。BASSAGANYA-RIERA等[8]研究發(fā)現(xiàn)，部分益生菌可以通過在結腸中產(chǎn)生CLA改善結腸炎[8]。盡管已經(jīng)有關于CLA及產(chǎn)CLA的益生菌在結腸炎中發(fā)揮作用的報道，但是，兩者單獨使用還不能解決腸炎患者營養(yǎng)不良的情況。因此，本研究將CLA及產(chǎn)CLA的雙歧桿菌作為功能組分添加到營養(yǎng)配方中驗證對潰瘍性結腸炎恢復的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

PB3002-N電子天平，梅特勒-托利多公司；DG250厭氧工作站，英國DWS；Multiskan GO多功能酶標儀，賽默飛公司；1150H型石蠟包埋機、PM2245手動輪轉切片機，徠卡；Pannormic MIDI數(shù)字切片掃描儀，3DHISTCH公司；SCIENTZ-48高通量組織研磨器，寧波新芝生物科技股份有限公司；QGC-36T氮吹儀，上海泉島公司；GCMS-QP2010Ultra氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本SHIMADZU公司。

葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS)(分子質(zhì)量36 k～50 kDa)、FastDNA Spin Kit for Feces, MP Biomedicals；髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)試劑盒，南京建成生物工程研究所；阿利新藍染色液、MUC2試劑盒，南京森貝伽生物科技有限公司；細胞因子試劑盒，R&D system;乳清蛋白、酪蛋白、馬鈴薯蛋白、中鏈甘油三脂、菊粉，上海創(chuàng)賽有限公司；CLA，南京庫克生物技術有限公司；大豆油、麥芽糊精、復合礦物質(zhì)、復合維生素，南通特洛菲飼料科技有限公司；雙歧桿菌GDMCC60797，廣東省微生物菌種保藏中心；其他化學分析試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。飼料配方見表1，由南通特洛菲飼料科技有限公司提供。

表1 不同飼料的主要營養(yǎng)成分含量 單位：g/kgTable 1 The major nutritional composition of different feed

1.2 實驗方法

1.2.1 動物實驗設計

動物實驗方案經(jīng)江南大學動物倫理委員會批準(JN.No20180615c1101030[139])。50 只雄性C57BL/6J小鼠(SPF級，8 周齡，18～20 g)隨機分為5 組，包括正常對照組、模型組和實驗組(營養(yǎng)配方組B、營養(yǎng)配方組C、營養(yǎng)配方組P)，每組10 只。實驗全程在SPF級環(huán)境中進行，飼養(yǎng)在江南大學實驗動物中心進行，恒定溫度21～26 ℃，濕度40%～70%，噪聲≤60 dB，動物照度15～20 lx。動物購入后，先經(jīng)過1周時間的適應期，然后除對照組外，將其他組小鼠的飲用水更換為質(zhì)量濃度25 g/L的DSS溶液，DSS處理循環(huán)3 次誘導慢性腸炎[9]。造模成功后將模型組小鼠處死，實驗組改為飲用水和配方飼料喂養(yǎng)。期間，每天記錄體質(zhì)量，2周后處死小鼠，測定結腸長度，參考YAN等[10]的方法收集樣品。

1.2.2 益生菌轉化CLA的測定

將活化好的雙歧桿菌以體積分數(shù)2%的接種量接種到含有質(zhì)量濃度0.64 mg/mL油酸的mMRS液體培養(yǎng)基中，之后參考王俊通[11]的方法進行益生菌轉化CLA的測定。

1.2.3 結腸組織中MPO的測定

參照MPO試劑盒的說明書進行測定。

1.2.4 結腸組織病理切片的制作、蘇木素-伊紅(hematoxylin eosin,HE)染色和組織損傷評分

參照文獻[12]的方法對結腸組織進行HE染色。使用Pannoramic MIDI數(shù)字切片掃描儀掃描制作好的切片。組織損傷評分參考REES[13]的方法對結腸組織切片進行組織損傷評分，具體標準見表2。

表2 組織損傷評分標準Table 2 Standard for evaluation of histological injury

1.2.5 動物組織上清中細胞因子的測定

組織上清液中IL-6、IL-10、IL-17、IL-1β、TNF-α等細胞因子的測定采用R&D system的 ELISA試劑盒，具體步驟參照試劑盒說明書。

1.2.6 結腸黏液層的阿利新藍染色

參考文獻[12]的方法制作切片，參考試劑盒說明書進行阿利新藍染色。使用Pannoramic MIDI數(shù)字切片掃描儀掃描制作好的切片。

1.2.7 結腸組織上清液中MUC2的表達

參照MUC2試劑盒中的說明書。

1.2.8 16Sr RNA基因V3～V4區(qū)擴增子高通量測序和糞便菌群的分析

通過FastDNA Spin Kit for Feces試劑盒從糞便樣品中提取細菌的DNA，利用Illumina MiSeq平臺對V3～V4區(qū)域進行擴增和測序(Illumina, San Diego, CA, USA)[10]。參考FANG等[14]的方法進行差異菌分析。

1.2.9 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0軟件進行分析，計量資料以(平均值±均方誤差表示，不同組別間樣本比較采用單因素方差分析，若存在統(tǒng)計學差異，進一步應用最小顯著性差異法進行兩兩比較。P<0.05被認為具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 雙歧桿菌的CLA轉化率

反芻動物的乳制品和肉制品是日常生活中CLA的主要來源，除此之外，很多細菌已被報道具有生物合成CLA的能力。COAKLEY等[15]報道了一系列雙歧桿菌，特別是短雙歧桿菌(Bifidobacteriumbreve)可極高效地將高達65%的亞油酸(linoleic aciol,LA)底物轉化為CLA。本實驗中，雙歧桿菌GDMCC60797在含有亞油酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后，其發(fā)酵液中的CLA轉化情況見表3。c9,t11-CLA為最主要的異構體，轉化率較高，達到了64.45%。圖1為72 h內(nèi)c9,t11-CLA的變化過程，隨著菌體生長CLA的含量逐漸增加(24、36 h)，培養(yǎng)36 h后發(fā)酵液中的質(zhì)量濃度趨于飽和，最大轉化率為培養(yǎng)72 h左右，c9,t11-CLA的質(zhì)量濃度達到了0.413 mg/mL。

表3 CLA轉化率Table 3 CLA conversion rate

圖1 72 h的CLA轉化率Fig.1 CLA conversion rate in 72 h

2.2 營養(yǎng)配方對結腸炎癥狀的影響

DSS誘導的結腸炎往往伴隨著體質(zhì)量的下降，這與臨床癥狀十分吻合[16]。圖2-a對比了不同營養(yǎng)配方飼養(yǎng)各組小鼠后體質(zhì)量的變化情況，可以發(fā)現(xiàn)各營養(yǎng)配方組出現(xiàn)了不同程度的體質(zhì)量增長，改善了腸炎引起的體質(zhì)量丟失情況，其中營養(yǎng)配方組P小鼠的體質(zhì)量增長最為顯著，增長了(13.34±4.00)%，營養(yǎng)配方組B及組C的小鼠體質(zhì)量分別增長了(7.00±5.35)%和(5.59±3.32)%。王威[4]的研究發(fā)現(xiàn),營養(yǎng)支持治療后腸炎患者的體質(zhì)量較干預前有所上升。此外，YANG等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，CLA及雙歧桿菌均能改善腸炎引起的體質(zhì)量丟失的情況，與本研究的結果一致。而添加了雙歧桿菌的營養(yǎng)配方效果最佳，可能是由于其除了通過產(chǎn)CLA直接作用于結腸外,還能通過其他途徑改善腸炎，這還有待進一步的研究。

DSS誘導的結腸炎會使小鼠結腸縮短，因此結腸長度結腸縮短可作為結腸損傷的宏觀指標[11]，相比于模型組(圖2-c)，經(jīng)膳食干預后，營養(yǎng)配方組B小鼠的結腸長度與模型組沒有顯著差異，而營養(yǎng)配方組C和組P小鼠的結腸長度縮短癥狀均顯著改善(P<0.05)，其中營養(yǎng)配方C飼養(yǎng)后小鼠的結腸長度縮短癥狀改善更為顯著(P<0.01)。說明了營養(yǎng)配方的攝入提高了營養(yǎng)物質(zhì)的吸收并減少其流失，從而達到增強營養(yǎng)狀態(tài)和促進病情緩解的效果。此外，添加雙歧桿菌及CLA的營養(yǎng)配方對腸炎的恢復效果更為顯著，改善了DSS引起的一系列臨床癥狀。

a-治療期間體重變化；b-不同組小鼠的代表性結腸；c-結腸長度.(a)-空白組；(b)-模型組；(c)-營養(yǎng)配方組B；(d)-營養(yǎng)配方組C；e-營養(yǎng)配方組P(下同)圖2 不同營養(yǎng)配方飼養(yǎng)后對腸炎癥狀的影響Fig.2 The effect of different diets on the symptom of the colitis*表示與模型組有顯著差異(P<0.05);**表示有高度顯著差異(P<0.01);***表示有極顯著差異(P<0.001)

2.3 營養(yǎng)配方對結腸炎炎癥的影響

研究表明炎癥由多個部分組成，包括局部(如紅腫)和全身(如發(fā)燒)表現(xiàn),這是一個動態(tài)的過程，中性粒細胞參與炎癥的早期階段[18]。MPO是粒細胞中存在的一種酶，CHASSAING等[19]的研究發(fā)現(xiàn)結腸組織中MPO的活性與中性粒細胞浸潤的嚴重程度呈正相關性，過量生成可造成黏膜組織損傷。由圖3-a可知，DSS處理后模型組小鼠的MPO活性顯著升高，表明存在嚴重的中性粒細胞浸潤，與前期研究結果一致。與模型組相比，不同營養(yǎng)配方飼養(yǎng)后小鼠的MPO活性均顯著降低(P<0.05)，說明這些營養(yǎng)配方均可以在一定程度上改善中性粒細胞的富集浸潤，從而緩解結腸炎的炎癥。其中，經(jīng)營養(yǎng)配方P飼養(yǎng)的小鼠改善效果最為顯著。

為了評價不同膳食干預對結腸炎小鼠結腸組織結構的影響，對各組小鼠結腸的切片進行了HE染色，并進行病理分析，由病理專家評分(圖3-c)。從染色結果(圖3-b)可知，正常小鼠具有規(guī)則的結構，隱窩結構完整，沒有出現(xiàn)炎癥細胞浸潤和杯狀細胞丟失。DSS處理的小鼠結腸組織隱窩結構破壞甚至消失，出現(xiàn)了嚴重的杯狀細胞丟失和炎癥細胞浸潤。BASSAGAYA-RIERA等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)CLA的益生菌及CLA均能減少結腸炎小鼠黏膜損傷和炎癥介質(zhì)浸潤。本實驗中，經(jīng)營養(yǎng)配方干預后的小鼠結腸組織有輕微的炎癥細胞浸潤，但仍能觀察到隱窩結構和杯狀細胞。從與之對應的評分中可以看出，相對于模型組，各營養(yǎng)配方組的HE評分均出現(xiàn)顯著降低(P<0.05)。說明通過喂食營養(yǎng)配方飲食可以減少粒細胞的浸潤,從而改善結腸組織損傷。

a-MPO活性；b-結腸HE染色；c-組織損傷評分圖3 不同營養(yǎng)配方飼養(yǎng)對腸炎癥狀的影響Fig.3 The effect of different diets on inflammation

2.4 營養(yǎng)配方對結腸炎炎癥因子表達的影響

為了分析不同配方飼養(yǎng)后小鼠結腸組織炎癥水平的影響，通過ELISA法測定了各組小鼠組織上清液中細胞因子的質(zhì)量分數(shù)。在DSS誘導的結腸炎模型中，小鼠的促炎因子TNF-α、IL-17、IL-6、IL-1β水平均出現(xiàn)顯著上調(diào)，這與臨床腸炎患者的細胞因子表現(xiàn)一致[20]。各營養(yǎng)配方組小鼠中的促炎因子TNF-α、IL-17、IL-6、IL-1β的表達相對模型組出現(xiàn)顯著下調(diào)(P<0.05)。其中，添加雙歧桿菌的小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥因子的表達下調(diào)更為顯著(圖4)。而添加CLA的小鼠所有炎癥因子表達均下調(diào)的最為顯著。盡管確切的發(fā)病機制尚不清楚，但NF-κB信號通路是涉及炎癥的通路中被討論較多的，巨噬細胞產(chǎn)生的關鍵促炎細胞因子TNF-α可激活NF-κB通路，而NF-κB可促進TNF-α及其他促炎細胞因子如IL-1β和IL-6的分泌[16]。研究表明CLA可以通過靶向PPAR γ細胞的機制來抑制NF-κB，從而抑制炎癥因子的表達[21]，這可能是添加了含CLA或雙歧桿菌的配方飲食在抑制促炎因子表達上效果最佳的原因。此外，IL-17可以介導IL-6和IL-8的表達，而IL-6可引起炎癥反應，IL-8可引起中性粒細胞在血液和組織中的積聚[18]。而前文已經(jīng)測定了營養(yǎng)配方飲食干預后，與粒細胞正相關的MPO活性在結腸組織中降低，因此，推測通過降低了IL-17的表達，從而降低了MPO的活性。

圖4 不同營養(yǎng)配方飼養(yǎng)后對結腸組織炎癥因子的影響Fig.4 The effect of different diets on the inflammation cytokines levels in colonic tissue

2.5 營養(yǎng)配方對結腸炎黏膜層的影響

腸道覆蓋著一層黏液，作為物理屏障保護著腸道，黏液層主要成分是黏蛋白MUC2。阿利新藍染色可以將黏蛋白染成藍色[17]，故可通過阿利新藍染色來檢測結腸黏液層的完整度。染色結果如圖5-a所示，正常組小鼠結腸含有大量杯狀細胞，排列整齊，形狀正常，杯狀細胞內(nèi)含有黏液；模型組的結腸黏膜層表面的黏液層及杯狀細胞嚴重受損，基本觀察不到，這可能導致致病菌與腸上皮接觸，促使結腸炎癥加劇和結腸組織的破壞；而各營養(yǎng)配方組仍能觀察到黏液層覆蓋著小鼠腸道上皮，并含有較多的杯狀細胞，為結腸組織提供了良好的保護。

MUC2作為杯狀細胞的標志，通過ELISA分析了杯狀細胞中MUC2的表達情況，結果如圖5-b所示，模型組MUC2的表達水平下降，與阿利新藍染色的結果相一致，說明經(jīng)DSS處理后小鼠的腸道黏膜層受損嚴重，相較于模型組，各營養(yǎng)配方組表達有所上升，有助于腸道黏膜層的修復。CHEN等[22]測定了不同濃度的CLA干預對腸炎的影響,發(fā)現(xiàn)至少10 mg/d的CLA攝入能顯著改善腸炎引起的杯狀細胞丟失，而本實驗在營養(yǎng)配方中添加了體積分數(shù)1%的CLA，小鼠每天的攝食量約為3 g，因此每天攝入的CLA約有30 mg。從而改善了DSS引起的杯狀細胞丟失。而杯狀細胞的存在可防止腸道細菌毒素和其他外源性物質(zhì)侵入腸道組織，進而防止腸黏膜損傷。

2.6 營養(yǎng)配方對小鼠腸道菌群的影響

越來越多的證據(jù)表明腸道微生物的失調(diào)與炎癥性腸病的發(fā)病機制有關[23]。因此，基于16S rRNA擴增的測序方法，進一步研究了不同膳食干預對腸道微生物組成的影響(圖6-a)。研究表明，腸炎患者腸道菌群中的厚壁菌門豐度會顯著降低，而擬桿菌門豐度會顯著升高[22]。HU等[24]通過分析厚壁菌門與擬桿菌門的豐度比值(Firmicutes:Bacteroidetes,F/B)來分析腸道菌群的變化，可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)DSS處理后的小鼠F/B值顯著下降。與本實驗的研究結果一致，而營養(yǎng)配方組B與營養(yǎng)配方組C沒有改善這一現(xiàn)象，營養(yǎng)配方組P則顯著增加了F/B值，表明添加了益生菌的營養(yǎng)配方組在菌群組成上能夠發(fā)揮重要作用(圖6-b)。

通過Linear discriminant analysis Effect Size(LEfSe)確定了各組腸道菌群的生物標志物[14]，圖6-c顯示了各組之間的優(yōu)勢菌，從屬水平上來看，空白組的優(yōu)勢菌屬為毛螺菌屬(LachnospiraceaeNK4A136 group)、CandidatusSaccharimonas屬、假單胞菌屬(Pseudomonas)；模型組的優(yōu)勢菌屬為梭菌屬(Clostridiumsensustricto1)；營養(yǎng)配方組B的優(yōu)勢菌屬為紅蝽桿菌屬(CoriobacteriaceaeUCG_002)；營養(yǎng)配方組C的優(yōu)勢菌屬為Parasutterella屬；營養(yǎng)配方組P的優(yōu)勢菌屬為雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)。

a-阿利新藍蘭染色；b-MUC2表達圖5 不同營養(yǎng)配方飼養(yǎng)后對黏膜層的影響Fig.5 The effect of different diets on the mucous layer

由圖6-d可知，與模型組相比，膳食干預后毛螺菌屬、CandidatusSaccharimonas屬、假單胞菌屬豐度沒有顯著變化；梭菌屬豐度均顯著降低(P<0.05)，而LI等[25]的研究發(fā)現(xiàn)與健康小鼠相比，梭菌屬豐度在腸易激綜合癥小鼠中顯著增加，經(jīng)治療后顯著下降。說明各營養(yǎng)配方組均能通過降低梭菌屬的相對豐度來調(diào)節(jié)腸道菌群從而改善腸炎。營養(yǎng)配方組C中Parasutterella屬、紅蝽桿菌屬顯著升高(P<0.05)；研究表明Parasutterella屬、紅蝽桿菌屬與代謝相關，可能是營養(yǎng)配方中添加的CLA為其提供了良好的生存環(huán)境[26-27]。此外，各營養(yǎng)配方組中雙歧桿菌屬的豐度均顯著增加(P<0.05)，其中，營養(yǎng)配方組P小鼠最為顯著。而雙歧桿菌已證實能夠?qū)δc炎患者的恢復發(fā)揮有效作用[28]。

a-門水平菌群組成；b-厚壁菌門/擬桿菌門(F/B)；c-屬水平各組優(yōu)勢菌群；d-優(yōu)勢菌屬的豐度差異圖6 不同營養(yǎng)配方飼養(yǎng)后對腸道菌群的影響Fig.6 The effect of different diets on the gut microbial

結果表明,膳食干預通過降低腸炎小鼠梭菌屬的豐度，增加雙歧桿菌屬的豐度來改善腸炎。此外，營養(yǎng)配方組P還能通過增加厚壁菌門豐度，降低擬桿菌門豐度來調(diào)節(jié)腸炎小鼠菌群的組成以改善腸炎。

3 結論

經(jīng)膳食干預后，各營養(yǎng)配方組均能對DSS誘導的慢性腸炎小鼠產(chǎn)生有效作用，其中，添加CLA后在改善結腸縮短、抑制促炎因子的表達上效果更佳；添加益生菌后在體質(zhì)量恢復、改善炎癥、調(diào)節(jié)腸道菌群上效果更為顯著，為臨床上特殊醫(yī)學用途配方食品原料的選擇特供了依據(jù)。