王雨晴，畢園，張瑞雪，方磊，周明，陳亮，谷瑞增

(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京市蛋白功能肽工程技術研究中心, 北京，100015)

豌豆是我國重要的農(nóng)作物之一，具有高淀粉、高蛋白、低脂肪等特點，其蛋白質(zhì)含量為23%～25%，氨基酸組成比較平衡，具有谷類食物中較為缺乏的賴氨酸，與FAO/WHO推薦模式較為接近，是一種優(yōu)良的植物蛋白資源[1-2]。目前我國主要利用豌豆中的淀粉制作粉絲，而對其副產(chǎn)物豌豆蛋白尚未充分開發(fā)和利用[3-4]，因此，對這部分優(yōu)質(zhì)植物蛋白資源作為副產(chǎn)物進行加工利用，提高產(chǎn)品附加值將是未來研究的重點和熱點。

目前，研究人員通過酶解豌豆蛋白制備的豌豆低聚肽具有抗氧化、降血壓、免疫調(diào)節(jié)等功能活性。秦修遠等[5]考察了以堿性蛋白酶和中性蛋白酶酶解得到的豌豆低聚肽自由基清除能力和還原能力，結果表明豌豆低聚肽具有較好的抗氧化活性。張秋萍等[3]利用中性蛋白酶和胰蛋白酶分步酶解豌豆蛋白得到了具有抗氧化活性的豌豆低聚肽，并經(jīng)凝膠色譜和反相色譜分離純化得到一條與谷胱甘肽(glutathione,GSH)抗氧化活性相似的八肽成分。刁靜靜等[4]將豌豆蛋白用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶、堿性蛋白酶水解得到豌豆蛋白水解物并測定其抗氧化活性，結果表明抗氧化活性隨水解時間的延長而提高。NIEHUES 等[6]使用胰蛋白酶水解豌豆蛋白，結果表明相對分子質(zhì)量 <10 kDa 的豌豆抗菌肽可通過降低幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori) 對胃上皮細胞的黏附性來降低嬰幼兒對幽門螺旋桿菌的感染率。朱玲[7]分別選用堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶對豌豆蛋白進行酶解，得到血管緊張素轉化酶抑制活性最強的肽段多由 2～4 個氨基酸組成。NDIAYE 等[8]使用嗜熱菌蛋白酶對豌豆蛋白進行水解，超濾后得到相對分子質(zhì)量約為 3 kDa 的豌豆多肽具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)的作用。雖然豌豆低聚肽具有一定功能活性，但豌豆低聚肽是由不同結構肽段組成的混合物，其發(fā)揮功能活性作用的結構尚不明確。

低聚肽的制備多采用耐熱菌產(chǎn)生的蛋白酶對原料進行酶解，比如堿性蛋白酶，中性蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶等，這些蛋白酶多具有很強的內(nèi)切酶活性，但其外切酶活性相對較弱[9]。CHEN等[10]對玉米蛋白來源的25種低聚肽進行了抗外切酶消化研究，結果表明N端為焦谷氨酸結構特點的二肽和三肽可以抵抗外切酶消化。焦谷氨酸的內(nèi)酰胺環(huán)結構使這些肽對消化蛋白酶更具抵抗力，從而可以增強其天然形式的肽吸收。焦谷氨酰胺(pyroglutamamide,pGlu)肽是由肽的N末端位置的谷氨酰胺或谷氨酸殘基通過脫酰胺或脫水內(nèi)環(huán)化形成的。谷氨酰胺和谷氨酸在高溫高壓下易發(fā)生環(huán)化作用，從而形成焦谷氨酸[11-12]。豌豆蛋白中存在較高含量的谷氨酸和谷氨酰胺，在酶解過程中，暴露在N端的谷氨酸和谷氨酰胺殘基可能形成焦谷氨酸殘基。

本文研究豌豆低聚肽中具有焦谷氨酸殘基的肽段結構以及含有焦谷氨酸殘基肽的抗消化能力，旨在為低聚肽的構效關系研究提供一些思路，為豌豆低聚肽的產(chǎn)品開發(fā)和市場應用提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

相對分子質(zhì)量標準品：乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(相對分子質(zhì)量189)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(相對分子質(zhì)量451)、桿菌酶(相對分子質(zhì)量1 450)、細胞色素C (相對分子質(zhì)量12 500，美國Sigma公司)。

低聚肽標準品：焦谷氨酰賴氨酸二肽(pyoglutamyl-lysine,pEK)、焦谷氨酰谷氨酸二肽(pyoglutamyl-glutamate,pEE)、焦谷氨酰精氨酸二肽(pyoglutamy-arginine,pER)(純度≥99%)，蘇州強耀生物科技有限公司；乙腈(色譜純)，德國Merck公司；甲酸(色譜純)，迪馬科技；超純水(18.2 MΩ·cm)由Milli-Q純水系統(tǒng)制備。

食品級堿性蛋白酶Alcalase 2.4 L、復合蛋白酶Protamex 1.6，諾維信公司；羧肽酶A、亮氨酸氨基肽酶，Sigma公司。

1.2 儀器與設備

Nexera X2超高效液相色譜儀、LCMS-8060三重四極桿質(zhì)譜儀聯(lián)用系統(tǒng)，日本島津公司。XS205DU分析天平，美國Mettler Toledo公司；QL-901渦旋混合儀，其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 豌豆低聚肽的制備

將400 g豌豆蛋白加入5 L去離子水中，攪拌均勻。料液在50 ℃、pH 8.0條件下經(jīng)堿性蛋白酶酶解3 h(酶與底物質(zhì)量比1∶100)后，繼續(xù)在50 ℃條件下利用復合蛋白酶酶解2 h(酶與底物質(zhì)量比為比1∶50)。料液于100 ℃水浴10 min滅酶，然后離心(3 000 r/min，15 min)取上清液。利用1 000 Da的超濾膜將上清液超濾，得到相對分子質(zhì)量低于1 000 Da的豌豆低聚肽溶液，溶液經(jīng)濃縮、噴霧干燥后得到豌豆低聚肽粉末。

1.3.2 蛋白質(zhì)及肽含量測定

總蛋白含量采用GB 5009.5—2010規(guī)定的方法測定[13]，蛋白質(zhì)換算系數(shù)為6.25；參考GB/T 22729—2008測定酸溶蛋白和低聚肽含量[14]。

1.3.3 相對分子質(zhì)量分布

參照GB/T 22729—2008中6.3的方法，采用高效凝膠過濾色譜法進行測定[14]。

1.3.4 氨基酸組成

參考GB 5009.124—2016第一法 氨基酸自動儀 進行分析[15]。色氨酸采用堿水解法，用6 mol/L NaOH溶液水解，其余均以6 mol/L HCl溶液水解測定。

1.3.5 外肽酶消化

參考CHEN等用羧肽酶A、亮氨酸氨基肽酶2種外切酶消化[10]。將200 mg豌豆肽溶于100 mL的50 mmol/L pH 8.0的Tris-HCl緩沖液中。將1 mL該溶液與6單位的羧肽酶A和2單位的亮氨酸氨基肽酶混合，并在37 ℃水浴中溫育8 h。通過超濾去除外切酶終止反應。

1.3.6 低聚肽結構的測定

低聚肽結構的測定利用超快速液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜方法測定。

樣品處理：用純水將樣品稀釋100倍，離心處理后(10 000 r/min離心10 min)取上清液，用孔徑為0.22 μm尼龍過濾膜過濾后，制得待測樣品。

液相色譜條件：色譜柱Inertsil ODS-3(2.1 mm×250 mm,5 μm)；流動相A為體積分數(shù)0.1% 甲酸水溶液，B為體積分數(shù)0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脫程序0～15 min，B 0%～50%；15～20 min，B 50%～100%；20～25 min，B 100%；25.1～35 min，B 0%；流速0.2 mL/min；進樣體積10 μL；柱溫40 ℃。質(zhì)譜條件：離子化模式ESI, 正離子模式；離子噴霧電壓+4.5 kV；霧化氣流速N23.0 L/min；加熱氣流速N210 L/min；干燥氣流速N210 L/min；DL溫度250 ℃；加熱模塊溫度400 ℃；離子源溫度300 ℃；掃描模式 多反應監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)；駐留時間100 ms；延遲時間3 ms；MRM參數(shù)見表1。

表1 化合物的MRM優(yōu)化參數(shù)Table 1 The multiple reaction monitoring conditions of the analytes

2 結果與分析

2.1 豌豆低聚肽的蛋白質(zhì)、低聚肽含量及相對分子質(zhì)量分布

分析表明，豌豆低聚肽蛋白含量高，干基蛋白含量為86.27%，且多以低聚肽的形式存在，干基肽含量為81.82%。豌豆低聚肽的相對分子質(zhì)量分布色譜如圖1所示，峰1、峰2、峰3、峰4分別為相對分子質(zhì)量12 500、1 450、451和189 Da的標準品色譜峰，黃色譜圖代表豌豆低聚肽樣品，相對分子質(zhì)量分布結果見表2。

圖1 豌豆低聚肽相對分子質(zhì)量分布色譜圖Fig.1 Chromatograph of relative molecular weight distribution

表2 豌豆低聚肽相對分子質(zhì)量分布Table 2 Relative molecular weight distribution of pea oligopeptides

豌豆低聚肽是以豌豆蛋白為原料經(jīng)預處理、酶解、分離等工藝制得，為低聚肽的混合物，結果顯示，低聚肽相對分子質(zhì)量主要集中在140～1000 Da，占總比例的83.61%。相對分子質(zhì)量<1 000 Da的蛋白水解物，由于含有小分子肽，更容易被人體直接吸收，發(fā)揮生理功能[16-17]。因此豌豆低聚肽中高比例小分子蛋白水解物可能被人體直接吸收和利用。

2.2 豌豆低聚肽的氨基酸組成

由表3可知，組成豌豆低聚肽的氨基酸總量為82.73%，必需氨基酸含量為27.61%，占豌豆低聚肽氨基酸總量的33.37%。所有氨基酸中谷氨酸(谷氨酰胺)含量最高為16.61%，含量最高的必需氨基酸是賴氨酸為6.77%，含硫氨基酸含量較低，這一結果與孫冬陽等[18]的報道一致。谷氨酸(谷氨酰胺)在豌豆低聚肽中含量最高，與圖2中豌豆球蛋白序列中谷氨酸(E)和谷氨酰胺(Q)所占比例一致。谷氨酸和谷氨酰胺是焦谷氨酸前體，所以豌豆蛋白在酶解過程中可能會產(chǎn)生焦谷氨酸肽。

表3 豌豆低聚肽的氨基酸組成及含量Table 3 Amino acid profile of pea oligopeptides

圖2 Uniprot 數(shù)據(jù)庫中豌豆球蛋白的序列Fig.2 Sequence of pea vicilin from Uniprot database注：谷氨酸(E)和谷氨酰胺(Q)分別以綠色和紅色字體表示；產(chǎn)生pEK、pEE和pER的前體EK、EE、ER和QK、QE、QR分別以不同顏色突出顯示

2.3 豌豆低聚肽的序列結構及抗消化能力

經(jīng)質(zhì)譜鑒定得到，豌豆低聚肽中存在pEK、pEE和pER三條N端為焦谷氨酸殘基的二肽結構，二級質(zhì)譜圖和定量色譜圖如圖3和圖4所示，其中84為pGlu殘基的特征產(chǎn)物離子。另外，經(jīng)質(zhì)譜掃描，豌豆低聚肽中不存在EK、EE、ER和QK、QE、QR結構，結果未顯示。

圖3 豌豆低聚肽中3條肽段的二級質(zhì)譜圖Fig.3 Secondary mass spectra of three peptide sequences in pea oligopeptides

圖4 豌豆低聚肽中3條肽段的定量色譜圖Fig.4 Quantitative chromatogram of three peptide sequences in pea oligopeptides

利用羧肽酶A、亮氨酸氨基肽酶驗證鑒定出3條肽段序列結構的抗消化性，消化前后3條肽段的含量見表4。

表4 豌豆低聚肽中消化前后3條肽段的含量 單位：mg/100 gTable 4 Contents of three peptide sequences in pea oligopeptides before and after digestion

豌豆低聚肽中pEK、pEE和pER含量分別為201.85，75.30和110.84 mg/100 g， 經(jīng)Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫驗證，豌豆蛋白中存在pEK、pEE和pEK的前體EK、EE、ER和QK、QE、QR，如圖2突出顯示，在酶解過程中，N端的谷氨酸或谷氨酰胺通過脫酰胺或脫水內(nèi)環(huán)化轉化為焦谷氨酰胺，這與CHEN等[10]報道的一致。經(jīng)過氨基肽酶和羧肽酶消化后，pEK、pEE和pER含量均有所提高，可能因為在消化過程中豌豆低聚肽部分肽段轉化為這3種結構。這3條肽段均為在豌豆低聚肽中首次發(fā)現(xiàn)。

研究報道焦谷氨酸肽具有生物活性，例如抗抑郁、肝保護、抗炎活性和免疫調(diào)節(jié)等[19-22]。YAMAMOTO等[19]研究表明，焦谷氨酰亮氨酸二肽(pyrogutamyl-leucine,pEL)和焦谷氨酰谷氨酰胺亮氨酸(pyroglutamyl-glutamine-leucine,pEQL)在小鼠的尾部懸浮液和強迫游泳試驗中表現(xiàn)出抗抑郁活性。與未經(jīng)修飾的肽Gln-Gln-Leu相比，較低劑量的pGlu-Gln-Leu顯示出抗抑郁作用，從而證明內(nèi)酰胺環(huán)在生物活性中的重要性。SATO等[20]研究表明，口服(pEL二肽)可以減輕D-半乳糖胺誘發(fā)的小鼠急性肝炎。HIRAI等[21]研究表明，pEL通過阻斷RAW 264.7巨噬細胞中的核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)和有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)途徑來抑制脂多糖誘導的炎癥反應。這些功能作用可能與含有抵抗胃腸消化能力的焦谷氨酸殘基有關。SATO等[20]從口服小麥低聚肽的大鼠血液中檢測到pEL[20]。從攝入小麥低聚肽的大鼠靜脈血中也發(fā)現(xiàn)了肽形式的焦谷氨酸[23]。焦谷氨酸內(nèi)酰胺環(huán)的形成代替了極性酰胺基，增加pGlu肽的疏水性，使焦谷氨酸肽更有可能被生物利用。

豌豆肽中所含有的3條焦谷氨酸肽具有抗外切酶消化能力，在發(fā)揮生物活性中具有明顯優(yōu)勢。

3 結論

豌豆低聚肽的干基蛋白和干基肽含量分別為86.27%和81.82%，含量較高。分子量分布結果顯示，低聚肽主要集中在140～1 000 Da，占總比例的83.61%。組成豌豆低聚肽的必需氨基酸含量為27.61%，占豌豆低聚肽氨基酸總量的33.37%。所有氨基酸中谷氨酸含量最高為16.61%，是形成焦谷氨酸的前體氨基酸。

豌豆低聚肽中發(fā)現(xiàn)3條具有抗外切酶消化功能的肽段，pEK、pEE和pER，含量分別為201.85，75.30和110.84 mg/100 g，經(jīng)過氨基肽酶和羧肽酶消化后，含量均有所提高，可能是因為豌豆低聚肽在消化過程中部分肽段轉化為這3種結構，這3條肽段均為在豌豆低聚肽中首次發(fā)現(xiàn)。焦谷氨酸肽的功能作用可能與含有的焦谷氨酸殘基抵抗胃腸消化能力有關。

豌豆作為良好的蛋白質(zhì)來源，尚未得到很好的開發(fā)和利用。研究通過對豌豆低聚肽的營養(yǎng)成分及抗外切酶消化肽段的研究，為豌豆蛋白的開發(fā)提供了理論依據(jù)。