左春生 李迎曉 徐光科

摘要：為了解鴨疫里默氏桿菌的流行情況，對信陽地區(qū)疑似鴨疫里默氏桿菌感染病料進行病原分離和鑒定。結(jié)果顯示，共鑒定到14株鴨疫里默氏桿菌，其中血清1型、2型和10型菌株依次為3、4、2株，未定血清型菌株5株;動物致病性試驗結(jié)果顯示，分離菌對雛鴨均具有致病性。對11種抗菌藥物敏感性檢測結(jié)果表明，分離菌株對阿米卡星、鏈霉素和頭孢曲松較為敏感，對氟苯尼考、阿莫西林、磺胺異唑、多黏菌素B和多西環(huán)素耐藥性較高;生物被膜檢測結(jié)果表明，14株菌株中有8株為強生物被膜形成株，2株為弱生物被膜形成株。

關(guān)鍵詞：鴨疫里默氏桿菌;分離鑒定;血清型;藥敏試驗;生物被膜

中圖分類號： S855.1 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）15-0221-05

鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）可感染鴨、鵝、火雞等多種禽類，是目前規(guī)模化水禽養(yǎng)殖多發(fā)的細菌性疾病，常造成嚴重的經(jīng)濟損失。鴨疫里默氏桿菌主要侵害2～7周齡的雛鴨和仔鵝，特征性病變?yōu)槔w維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、關(guān)節(jié)炎、輸卵管炎和腦膜炎等[1]。

我國郭玉璞等在1982年首次報道北京地區(qū)商品鴨發(fā)生鴨傳染性漿膜炎后[2]，其他主要水禽養(yǎng)殖區(qū)域陸續(xù)報道發(fā)現(xiàn)該病。鴨疫里默氏桿菌血清型眾多，至少有21個血清型，且各型之間幾乎無交叉保護性，已成為危害養(yǎng)鴨生產(chǎn)的主要疾病[3]。信陽市是河南省主要的水禽集散地，部分養(yǎng)殖戶使用血清1型和血清2型RA滅活疫苗免疫后，預(yù)防效果不佳。因此，本研究通過對實驗室送檢的疑似鴨疫里默氏桿菌感染病料進行細菌分離和血清型鑒定，旨在為河南省信陽市水禽鴨疫里默氏桿菌病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品

樣品為養(yǎng)殖戶送檢的發(fā)病雛鴨。

1.2 主要試劑與試驗動物

胰蛋白胨大豆（TSA）瓊脂培養(yǎng)基、胰酪胨大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基，購自杭州天和微生物試劑有限公司;即用型SanPfu PCR試劑盒、細菌基因組DNA快速抽提試劑盒，購自生工生物工程（上海）股份有限公司;胎牛血清，購自杭州四季青生物工程材料有限公司;鴨疫里氏桿菌1型、2型菌株和RA標準血清由上海獸醫(yī)研究所胡青海博士惠贈;1日齡健康非免疫櫻桃谷鴨，購自河南華英農(nóng)業(yè)發(fā)展股份有限公司，隔離飼養(yǎng)至15日齡后用于細菌致病性試驗測定。

1.3 細菌學(xué)檢查

無菌采集病死雛鴨肝臟、腦等病料，劃線接種于TSA平板，置于燭缸中37 ℃培養(yǎng)36～48 h，挑取可疑菌落轉(zhuǎn)接種TSA培養(yǎng)基（含5%胎牛血清）純培養(yǎng)后，革蘭氏染色和瑞氏染色后檢查細菌形態(tài)。挑取TSA培養(yǎng)基純化后的單菌落轉(zhuǎn)接種TSB培養(yǎng)基（含5%胎牛血清）增菌培養(yǎng)后待用。

1.4 生化試驗

參照文獻[4]方法，取TSA培養(yǎng)基上純化的單菌落接種細菌生化反應(yīng)管，37 ℃培養(yǎng)規(guī)定時間后觀察并記錄結(jié)果。

1.5 PCR鑒定

1.5.1 細菌基因組的提取 挑取單菌落接種5 mL TSB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min振搖培養(yǎng)過夜。取 500～1 000 μL進行細菌基因組提取，操作步驟按照細菌基因組DNA快速抽提試劑盒說明書進行。

1.5.2 16S rRNA基因和dan B基因PCR檢測 根據(jù)文獻[5]方法，設(shè)計檢測RA 16S rRNA基因和dan B基因的2對引物，擴增片段長度分別為364、627 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物詳情見表1。

PCR反應(yīng)體系50 μL：2×Taq Master Mix 25 μL，上下游引物（10 μmol/L）各2 μL，模板2 μL，超純水19 μL。擴增條件：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，54 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán);72 ℃延伸 5 min。

PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖電泳進行檢測后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast分析比對。

1.6 血清型鑒定

參照程安春等的方法[6]，將各RA分離株菌液和RA1、RA2、RA10型標準血清進行平板凝集試驗，觀察記錄結(jié)果。

1.7 動物致病性試驗

參照任小梅等的方法[4]，將鑒定后的14株RA分離株分別腿部肌肉注射進15日齡的櫻桃谷鴨或麻鴨，注射劑量為0.5 mL/羽（約1×108 CFU），每組3羽，同時設(shè)立對照組，腹腔注射0.5 mL滅菌生理鹽水。攻毒后每天觀察并記錄各組發(fā)病、死亡情況。

1.8 藥敏試驗

以大腸埃希菌（ATCC 25922）作為質(zhì)控菌株，參照CLSI推薦的藥敏試驗紙片擴散法測定14株供試菌株對11種抗菌藥物的耐藥表型。結(jié)果依據(jù)CLSI標準判定各分離菌株的敏感性，以敏感、中介、耐藥3種形式記錄[7]。

1.9 鴨疫里默氏桿菌的生物被膜檢測

參照文獻的方法[8]將14株鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌DH5a的新鮮菌液（D600 nm=1.0）采用TSB進行1 ∶ 100稀釋后，加入96孔板，200 μL/孔，每株細菌設(shè)3個重復(fù)，然后置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h后采用結(jié)晶紫染色法檢測其生物被膜形成情況。最后采用酶標儀檢測各孔D595 nm值。生物被膜形成能力的判定標準為D595 nm≤0.31為無生物被膜形成菌株;0.31

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌分離與染色

從58份病料中分離出14株RA，分離株在TSA培養(yǎng)基上，于燭缸中37 ℃培養(yǎng)24～36 h后，可形成圓形、略微突起、表面光滑的奶油狀小菌落（對著光線觀察菌落呈現(xiàn)淡藍色）。革蘭氏染色鏡檢可見散在或少數(shù)成對出現(xiàn)的革蘭陰性短桿（球桿）菌;瑞氏染色呈兩極濃染，符合RA的形態(tài)特征。

2.2 生化試驗結(jié)果

14株RA乳糖發(fā)酵試驗、半乳糖發(fā)酵試驗、甲基紅試驗、VP試驗、硫化氫產(chǎn)生試驗、硝酸鹽還原試驗和枸櫞酸鹽試驗均為陰性，不產(chǎn)生硫化氫，氧化酶試驗、觸酶試驗均為陽性，基本符合RA的生化特性。

2.3 16S rRNA基因和dan B基因PCR檢測結(jié)果

14株RA均能PCR擴增出約364、627 bp大小的條帶，與預(yù)期相符（圖1、圖2）。將陽性條帶切膠回收后測序，結(jié)果表明，擴增條帶的序列與目的基因序列高度一致。

2.4 血清型鑒定結(jié)果

將分離到的14株細菌分別與標準陽性血清進行平板凝集試驗。由表2可知，血清1型菌株3株、血清2型菌株4株、血清10型菌株2株， 其他菌株為未定血清型。

2.5 動物致病性試驗結(jié)果

試驗組櫻桃谷雛鴨接菌后18～24 h出現(xiàn)精神委頓、呆立，逐漸排出白色、黃白色、黃綠色稀糞，2～3 d后開始出現(xiàn)死亡，并在死亡前表現(xiàn)出陣發(fā)性搖頭、勾頭扭頸等臨床癥狀。剖檢死鴨有輕或重的纖維素性心包炎、氣囊炎、肝周炎和腦膜炎。對死亡鴨進行細菌分離和PCR鑒定，結(jié)果能夠重新分離鑒定出接種菌。

2.6 14株鴨疫里默氏桿菌對11種抗菌藥物的耐藥表型

由表3可知，14株鴨疫里默氏桿菌對11種抗菌藥物表現(xiàn)出不同程度的耐藥，其中對氟苯尼考、阿莫西林、磺胺異唑、多黏菌素B、多西環(huán)素耐藥率較高，分別為100%（14/14）、100%（14/14）、85.72%（12/14）、85.72%（12/14）和78.58%（11/14）;對阿米卡星、鏈霉素和頭孢曲松敏感性較高，分別為92.86%（13/14）、64.28%（9/14）和57.14%（8/14）;多數(shù)菌株呈現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象（表2）。

2.7 分離株的生物被膜檢測

生物被膜檢測結(jié)果顯示，8株（PQJ4、PQY2、PQH5、LSG1、GSX6、HY8、HB1和HCH7）具有強生物被膜形成能力;GSP5和HY1為弱生物被膜形成能力，具體結(jié)果見表2。

3 結(jié)論與討論

信陽市水資源豐富，除采用標準化養(yǎng)殖體系的櫻桃谷肉鴨養(yǎng)殖龍頭——河南華英農(nóng)業(yè)發(fā)展股份有限公司外，還有眾多小型養(yǎng)殖戶和散養(yǎng)戶。這些小型養(yǎng)殖戶和散養(yǎng)戶的鴨（鵝）苗來源比較雜，除本地的孵化場外，其他大多來源于江蘇、安徽、四川和廣東（獅頭鵝）等地，使得信陽地區(qū)鴨疫里默氏桿菌血清型分布較為多樣，再加上呼腸孤病毒感染的普遍存在[9-10]，使得鴨疫里默氏桿菌病的防控形勢更加嚴峻。

鴨疫里默氏桿菌血清型眾多，并且存在明顯的區(qū)域性特征。任曉梅等從廣東、山東、江蘇等地區(qū)疑似鴨疫里默氏桿菌病病料中分離鑒定出46株鴨疫里默氏桿菌，其中血清1型、2型、10型和15型菌株依次為9株、25株、1株和1株，未定血清型菌株10株[4]。云水麗等從江蘇省某免疫鴨場的病死鴨中分離到了血清11型的鴨疫里默氏桿菌[11]。袁小遠等2015—2016年間從山東及河北等地的商品鴨場病料中共分離出18株鴨疫里默氏桿菌，均為血清1型RA[12]。本研究分離的14株鴨疫里默氏桿菌中血清1型菌株3株，血清2型菌株4株，血清10型2株，其他菌株為未定血清型，這與焦鳳超等的早期研究結(jié)果部分吻合[13]，這也解釋了為什么當前信陽地區(qū)很多養(yǎng)殖戶雖然實施了鴨疫里默氏桿菌病疫苗（主要是血清1型和2型）的免疫接種，但該病仍頻繁發(fā)生的原因。

由于鴨疫里默氏桿菌病疫苗免疫預(yù)防效果不佳，所以很多養(yǎng)殖戶往往采用抗菌藥物進行防治，而鴨疫里默氏桿菌又經(jīng)常和大腸桿菌發(fā)生混合感染，這給該菌的分離鑒定帶來一定的難度。本研究參考丁云竹等建立的PCR方法輔助開展鴨疫里默氏桿菌的分離鑒定，提高了工作效率[5]。另外Hu等建立的針對大腸桿菌phoA、沙門菌invA、鴨疫里默氏桿菌dna B基因的三重PCR方法，其檢測下限為1×103 CFU/mL[14]。Wei等建立的大腸桿菌、沙門菌、鴨疫里默氏桿菌、巴氏桿菌、多重PCR檢測方法，其檢測下限為10 pg基因組DNA[15]。以上這些方法有助于對臨床病料中的鴨疫里默氏桿菌進行鑒別檢測。

報道表明，RA對多種抗生素表現(xiàn)出耐藥現(xiàn)象[16]。荊雅瑋等對分離自安徽省的8株RA菌株藥物敏感性檢測結(jié)果表明，RA對阿莫西林、頭孢他啶和頭孢吡啶敏感，對洛美沙星和阿奇霉素、阿米卡星耐藥[17]。Zhong等對國內(nèi)分離的224株RA進行耐藥性檢測的結(jié)果表明，50%的分離株對β-內(nèi)酰胺類抗生素、利福平等多種抗生素耐藥，其中有4株對29種抗生素耐藥[18]。本次分離的14株RA對氟苯尼考、阿莫西林、磺胺異唑、多黏菌素B和多西環(huán)素表現(xiàn)出較高的耐藥率以及多重耐藥現(xiàn)象，但對阿米卡星敏感性較好，為92.86%（13/14），與上述結(jié)果有較大出入，這可能與各地用藥習(xí)慣有關(guān)。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，信陽地區(qū)使用抗菌藥物防治鴨疫里默氏桿菌病和大腸桿菌病時，主要采用拌料或飲水給藥，且常使用氟苯尼考、強力霉素、阿莫西林、多黏菌素B和磺胺類等藥物，很少用阿米卡星和頭孢類藥物，這與14株RA的耐藥性檢測結(jié)果基本相符。

生物膜是一個微生物群落，由細胞外聚合物基質(zhì)包圍的微生物組成。研究報道鴨疫里默氏桿菌形成生物被膜能力可能和該菌在養(yǎng)殖環(huán)境中的持續(xù)存在和細菌耐藥性存在一定的關(guān)系[8，19]。荊雅瑋等分離的8株菌株中有7株為強生物被膜形成株，且表明強生物被膜形成株AH-1對17種抗菌藥物耐藥[17]。本研究分離的14株RA中有8株為強生物被膜形成株，并且8株均表現(xiàn)出了多種耐藥現(xiàn)象，具體的機制有待于進一步研究確定。

綜上所述，本研究從58份臨床送檢病料中分離到14株疑似鴨疫里默氏桿菌，通過細菌生物學(xué)特性和16S rRNA基因、dan B基因PCR鑒定，確定分離菌株為鴨疫里默氏桿菌，并對其部分生物特性如血清型、耐藥表型和生物被膜形成能力進行了鑒定，為河南省信陽市的水禽鴨疫里默氏桿菌病的綜合防控提供參考。

參考文獻：

[1]蘇敬良，黃 瑜，胡薛英. 鴨病學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2016：243-245.

[2]郭玉璞，陳德威，范國雄，等. 北京鴨小鴨傳染性漿膜炎的調(diào)查研究[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報，1982，13（2）：35-41.

[3]吳彩艷，程淑琴，張建峰，等. 我國鴨疫里氏桿菌病流行概述[J]. 動物醫(yī)學(xué)進展，2017，38（6）：86-90.

[4]任曉梅，王小蘭，韓文龍，等. 鴨疫里默氏桿菌的分離鑒定與生物學(xué)特性研究[J]. 中國動物傳染病學(xué)報，2018，26（4）：47-51.

[5]丁云竹，孫冰清，姜 盼，等. 鴨疫里默氏桿菌16S rRNA和dna B基因的雙重PCR檢測方法的建立[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2017，39（1）：50-53.

[6]程安春，汪銘書，陳孝躍，等. 我國鴨疫里默氏桿菌血清型調(diào)查及新血清型的發(fā)現(xiàn)和病原特性[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報，2003，23（4）：320-323.

[7]Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing：twenty fourth informational supplement[S]. CLSI documents M100-S24，CLSI，2014.

[8]Hu Q H，Han X G，Zhou X J，et al. Characterization of biofilm formation by riemerella anatipestifer[J]. Vet Microbiol，2010，144（3/4）：429-436.

[9]黃 瑜，蘇敬良，施少華，等. 我國鴨呼腸孤病毒感染相關(guān)的疫病[J]. 中國獸醫(yī)雜志，2009，45（7）：57-58，92.

[10]高緒慧，吳海洋，孫吉謙，等. 山東地區(qū)新型鴨呼腸孤病毒的分離與鑒定[J]. 中國家禽，2018，40（20）：61-63.

[11]云水麗，楊 勇，王小波，等. 11型鴨疫里默氏桿菌分離鑒定及致病性研究[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2009，31（8）：605-609.

[12]袁小遠，王友令，王曉麗，等. 2015—2016年山東、河北地區(qū)鴨疫里默氏桿菌流行病學(xué)調(diào)查[J]. 中國家禽，2017，39（4）：70-72.

[13]焦鳳超，李迎曉，陳宏智，等. 河南省信陽市鴨疫里默氏桿菌的分離鑒定和血清型分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：166-167.

[14]Hu Q H，Tu J，Han X G，et al. Development of multiplex PCR assay for rapid detection of Riemerella anatipestifer，Escherichia coli，and Salmonella enterica simultaneously from ducks[J]. Journal of Microbiological Methods，2011，87（1）：64-69.

[15]Wei B，Cha S Y，Kang M，et al. Development and application of a multiplex PCR assay for rapid detection of 4 major bacterial pathogens in ducks[J]. Poultry Science，2013，92（5）：1164-1170.

[16]劉馬峰，田 琇，程安春. 鴨疫里默氏桿菌毒力及耐藥機制研究進展[J]. 微生物學(xué)報，2019（7）：1222-1231.

[17]荊雅瑋，陳芳芳，左佳坤，等. 8株鴨疫里默氏桿菌安徽分離株的生物學(xué)特性分析[J]. 中國動物傳染病學(xué)報，2018，26（2）：34-39.

[18]Zhong C Y，Cheng A C，Wang M S，et al. Antibiotic susceptibility of riemerella anatipestifer field isolates[J]. Avian Diseases，2009，53（4）：601-607.

[19]Burmolle M，Webb J S，Rao D，et al. Enhanced biofilm formation and increased resistance to antimicrobial agents and bacterial invasion are caused by synergistic interactions in multispecies biofilms[J]. Applied and Environmental Microbiology，2006，72（6）：3916-3923.