曹紅艷，喻海忠，袁建芬，郭春燕，唐艷芬

（南通市中醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科，2.呼吸內(nèi)科 江蘇 南通 226001）

輔助性T 淋巴細(xì)胞1（T helper lymphocyte 1, Th1）/Th2 免疫失衡是哮喘發(fā)生的重要免疫學(xué)機(jī)制之一[1]。Th1 和Th2 細(xì)胞亞群主要來自于T 淋巴細(xì)胞，分別以干擾素γ（interferonγ, IFN-γ）和白細(xì)胞介素4（interleukin 4, IL-4）為其特征性細(xì)胞分子[2]。李甫前等[3]證實(shí)，Th1、Th2 細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子失衡與哮喘患者的病情進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)。外源性變應(yīng)原侵入機(jī)體，導(dǎo)致Th 細(xì)胞分化偏移和Th2 優(yōu)勢(shì)應(yīng)答，大量分泌IL-4、IL-12 等細(xì)胞因子，促進(jìn)免疫球蛋白E（immunoglobulin E, IgE）合成及嗜酸性粒細(xì)胞募集等，進(jìn)而釋放大量活性物質(zhì)，最終引起氣道重塑和變異性反應(yīng)[4]。由于哮喘遷延難愈，長期使用西藥不良反應(yīng)嚴(yán)重，而中醫(yī)在治療哮喘方面尤其是對(duì)于慢性持續(xù)期患者具有明顯的優(yōu)勢(shì)。哮喘寧顆粒是調(diào)肝理肺的經(jīng)典方[5]，但是其作用機(jī)制尚不明確。本研究基于Th1/Th2免疫失衡理論觀察哮喘寧顆粒對(duì)慢性持續(xù)期患者的臨床療效，為臨床用藥提供一定的理論證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月—2019年2月在南通市中醫(yī)院確診的慢性持續(xù)期哮喘患者130 例。其中，男性69 例，女性61 例；年齡18 ～75 歲，平均（52.27±13.64）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)： ①符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)哮喘學(xué)組制定的《支氣管哮喘防治指南》（2016年版）[6]關(guān)于支氣管哮喘慢性持續(xù)期的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②根據(jù)《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[7]、《中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》[8]中醫(yī)辨證分型標(biāo)準(zhǔn)，所有患者屬哮病肺脾氣虛證。排除標(biāo)準(zhǔn)： ①急性發(fā)作期或臨床緩解期；②4 周內(nèi)發(fā)生呼吸道感染或其他急慢性感染；③合并其他呼吸道疾病、血液系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤及嚴(yán)重肝腎功能不全。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者簽訂知情同意書。

1.2 分組

將130 例患者按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組和觀察組，每組65 例。對(duì)照組男性38 例，女性27 例；平均年齡（54.26±14.10）歲；平均病程（60.48±38.49）個(gè)月。觀察組男性31 例，女性34 例；平均年齡（52.18±13.65）歲；平均病程（67.35±41.28）個(gè)月。兩組患者給予解痙、平喘、祛痰及抗呼吸道感染等常規(guī)西醫(yī)治療，同時(shí)霧化吸入沙美特羅替卡松（美國Glaxo Smith Kline 公司，國藥準(zhǔn)字H20150325），2 次/d。觀察組在西醫(yī)治療基礎(chǔ)上，口服哮喘寧顆粒（貴州瑞成藥業(yè)，國藥準(zhǔn)字Z20043506），25 g/次，早晚各1 次溫水服用。連續(xù)治療12 周。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

FACSCanto 流式細(xì)胞儀（美國BD 公司），ELISA檢測(cè)試劑盒（上海江萊生物科技有限公司），Trizol 試劑（美國Sigma 公司），RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生生物工程有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 觀察指標(biāo)采集患者空腹外肘靜脈血2 份，每份3 ml，離心后取上清保存。分別采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th1/CD4+、Th2/CD4+、Th1/Th2 比值。另外一份血液，采用ELISA 抗體雙夾心法檢測(cè)IL-4、IL-1α、IL-17及IFN-γ。

1.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）采集患者治療前后靜脈血5 ml，加入Ficoll 淋巴細(xì)胞分層液分離單個(gè)核細(xì)胞，加入佛波脂刺激4 h，獲得巨噬細(xì)胞（M0）。按照Trizol 法提取巨噬細(xì)胞總RNA。根據(jù)RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作。將逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA 保存至-20℃冰箱。取1μg cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction, qRT-PCR）。反應(yīng)條件： 95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，共計(jì)40 個(gè)循環(huán)。T 盒子轉(zhuǎn)錄因子（T-bet）正向引物： 5'-GCACACATTGAAGAGGACAGAC-3'；反向引物： 5'-TATTGAAGGGGGTTCTGGTG-3'，長度142 bp。GATA 結(jié)合蛋白3（GATA-3）正向引物： 5'-AAGAGGAGGAAGCCATAGCAC-3'；反向引物： 5'-CCATTGGCAGCACTAGTTTC-3'，長度118 bp。維A 酸相關(guān)孤獨(dú)受體亞家族γt（RORγt）正向引物： 5'-GACACGAGAGCAGATTACAGAC-3'； 反向引物： 5'-AAGTATTGGTCGTGGTCTGGTCG-3'， 長度120 bp。叉頭框轉(zhuǎn)錄因子P3（FoxP3）正向引物： 5'-GAAGCGACGGGCGGCTTCCCAGC-3'；反向引物： 5'-GCATCCGATTGCGCCACGTCTTT-3'，長度176 bp。將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以β-actin 作為內(nèi)參，采用掃描軟件進(jìn)行半定量分析。

1.5 臨床療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[7]關(guān)于喘息性支氣管炎的療效評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)： 療效指數(shù)=（治療前積分-治療后積分）/治療前積分×100%。①治愈： 療效指數(shù)≥95%；②顯效： 療效指數(shù)70%～＜95%；③有效： 療效指數(shù)30%～＜70%；④無效： 療效指數(shù)＜30%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床資料比較

兩組年齡、病程比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。兩組性別構(gòu)成比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。見表1。

2.2 兩組臨床療效比較

治療12 周后，對(duì)照組與觀察組總有效率比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。兩組治愈率比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），觀察組高于對(duì)照組。見表2。

表1 兩組臨床資料比較 （n =65）

表2 兩組臨床療效比較 [n =65，例（%）]

2.3 兩 組Th1/CD4+、Th2/CD4+、Th1/Th2比值及炎癥細(xì)胞因子變化

兩組治療前后Th1/CD4+、Th2/CD4+、Th1/Th2 比值的差值，以及炎癥細(xì)胞因子的差值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），觀察組Th2/CD4+和血清IL-4、IL-17 降低的差值，以及Th1/CD4+、Th1/Th2 比值、血清IL-12、IFN-γ 升高的差值均高于對(duì)照組。見表3。

2.4 兩組轉(zhuǎn)錄因子的變化

兩組治療前后T-bet、FoxP3、GATA-3、RORγt的差值比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），觀察組T-bet、FoxP3 升高的差值，以及GATA-3、RORγt 降低的差值高于對(duì)照組。見表4。

表3 兩組治療前后Th1/CD4+、Th2/CD4+、Th1/Th2 比值的差值比較 （n =65，±s）

表3 兩組治療前后Th1/CD4+、Th2/CD4+、Th1/Th2 比值的差值比較 （n =65，±s）

Th1/Th2 平衡 細(xì)胞因子/（ng/L）Th1/CD4+/% Th2/CD4+/% Th1/Th2 IL-4 IL-12 IL-17 IFN-γ對(duì)照組 3.96±2.47 -2.81±1.52 0.19±0.22 -17.34±16.71 77.37±35.69 -1.13±1.40 306.62±117.23觀察組 8.14±2.65 -5.64±2.20 0.47±0.19 -32.76±25.79 207.07±55.83 -2.74±2.09 583.13±275.48 t 值 9.303 8.533 7.766 4.046 15.784 5.160 7.446 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000組別

表4 兩組治療前后轉(zhuǎn)錄因子的差值比較 （n =65，±s）

表4 兩組治療前后轉(zhuǎn)錄因子的差值比較 （n =65，±s）

組別 T-bet GATA-3 RORγt FoxP3對(duì)照組 0.22±0.13 -0.09±0.15 -0.04±0.01 0.46±0.21觀察組 0.34±0.20 -0.26±0.17 -0.17±0.05 0.79±0.22 t 值 4.056 6.045 20.549 8.748 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討論

我國有多年的哮喘中醫(yī)治療歷史，早在《素問》中就提出“乳子中風(fēng)熱，喘鳴肩息者，脈實(shí)大也”。從中醫(yī)角度分析，腑氣郁滯、肺氣上逆是哮喘發(fā)生的病機(jī)，因此氣機(jī)調(diào)理是多數(shù)中醫(yī)學(xué)專家的治療思想[9]。漢代張仲景提出“病痰飲者，當(dāng)以溫藥和之”。唐孫思邈在《備急千金藥方》中也提到“咳逆上氣者，可內(nèi)服五味細(xì)辛湯；而冷哮者，可加以阿膠調(diào)理，注重補(bǔ)肺、扶正、祛痰”。之后，明代張景岳首次提出應(yīng)依據(jù)發(fā)作期和緩解期，急治標(biāo)，緩治本，應(yīng)虛實(shí)辨證治療[10]。近現(xiàn)代，隨著中醫(yī)學(xué)理論的發(fā)展成熟，中醫(yī)學(xué)專家對(duì)該病的病理機(jī)制也逐漸有了新的認(rèn)識(shí)。晁恩祥等[11]提出，風(fēng)盛痰阻、氣機(jī)上行是急性發(fā)作期患者的主要病理機(jī)制，而日久痰阻，損及臟腑，哮鳴喘息輕重間作則為慢性緩解期的表現(xiàn)，需依據(jù)病及特點(diǎn)，辨證論治。武維屏等[12]認(rèn)為本病病位在肝和肺，肝主疏泄，且肝肺相關(guān)，肝氣通順則肺氣自平，提倡在慢性緩解期宜調(diào)肝理肺，從而根據(jù)多年的臨床思想，提出“哮喘寧顆?！苯?jīng)驗(yàn)方。

哮喘寧顆粒由柴胡、黃芩、清半夏、白芍、枳殼等組成，本方重在疏肝理氣，清瀉肺熱，使氣機(jī)升降平衡，從而避免風(fēng)、熱、痰、淤、氣等產(chǎn)生[13]。既往臨床上中醫(yī)和西醫(yī)關(guān)于哮喘的臨床分期有所不同，中醫(yī)分為發(fā)作期和緩解期，而西醫(yī)分為急性發(fā)作期、慢性持續(xù)期和臨床緩解期，但是隨著中西醫(yī)結(jié)合在臨床上的應(yīng)用越來越普遍，中醫(yī)臨床上也逐漸采用西醫(yī)分期標(biāo)準(zhǔn)。不可否認(rèn)的是，糖皮質(zhì)激素、鎮(zhèn)咳、平喘等西藥在急性發(fā)作期的臨床癥狀改善方面具有十分突出的優(yōu)勢(shì)，但是中藥在慢性持續(xù)期的治療優(yōu)勢(shì)也逐漸凸顯，因此中西醫(yī)結(jié)合治療是目前臨床上哮喘慢性持續(xù)期患者的首選方案[14]。目前臨床上，經(jīng)驗(yàn)方雖然在辨證論治方面具有一定的特色，但是也存在沒有明確的療效標(biāo)準(zhǔn)、機(jī)制不確切等不足，從而在臨床應(yīng)用上處于被動(dòng)地位。

本實(shí)驗(yàn)由于病例數(shù)偏少或者西藥本身在改善臨床癥狀方面具有突出的優(yōu)勢(shì)，未發(fā)現(xiàn)兩組總有效率有差異，但是觀察組哮喘治愈率高于對(duì)照組。從發(fā)病機(jī)制分析，哮喘屬于慢性氣道炎癥反應(yīng)，而且氣道非特異性炎癥反應(yīng)持續(xù)存在是哮喘遷延難愈的主要原因。一旦涉及到炎癥反應(yīng)就會(huì)有免疫細(xì)胞參與，尤其是T 淋巴細(xì)胞在其中扮演著關(guān)鍵角色。高陽等[15]證實(shí)，支氣管哮喘患者外周血Th1、Th2 與Th17 細(xì)胞表達(dá)水平失衡，導(dǎo)致IFN-γ、IL-4 及IL-17 等細(xì)胞因子分泌異常，推斷可能是哮喘發(fā)病的重要病理學(xué)機(jī)制之一。正常狀態(tài)下Th1/Th2 處于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，機(jī)體炎癥反應(yīng)會(huì)激活Th0 細(xì)胞分化生成Th2/CD4+細(xì)胞，Th1 型細(xì)胞分化作用相對(duì)減弱，通過誘導(dǎo)產(chǎn)生IgE，介導(dǎo)體液免疫，加重哮喘的進(jìn)展。本研究中，治療12周后，兩組患者Th2/CD4+及血清IL-4、IL-17 較治療前降低，同時(shí)Th1/CD4+、Th1/Th2 比值和血清IL-12、IFN-γ 較治療前升高，而且觀察組Th2/CD4+及血清IL-4、IL-17 低于對(duì)照組，同時(shí)Th1/CD4+、Th1/Th2 比值和血清IL-12、IFN-γ 高于對(duì)照組。IL-4是Th2 型細(xì)胞的典型分子，而IL-12 和IFN-γ 是Th1 細(xì)胞的特征性細(xì)胞因子。通過觀察Th1、Th2 細(xì)胞平衡和相應(yīng)的細(xì)胞因子水平變化，說明哮喘寧顆?？赏ㄟ^調(diào)節(jié)機(jī)體Th1/Th2 型細(xì)胞平衡起到改善哮喘癥狀的作用。另外，T-bet、GATA-3、RORγt、FoxP3 是T 細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控或阻斷Th0 細(xì)胞向Th1 或Th2 分化，進(jìn)而影響Th1/Th2 平衡[16]。在本研究中，觀察組T-bet、FoxP3 高于對(duì)照組，同時(shí)RORγt 低于對(duì)照組，這與細(xì)胞因子的變化趨勢(shì)基本一致，從而進(jìn)一步證實(shí)哮喘寧顆粒對(duì)Th1/Th2 平衡的作用。

綜上所述，本研究揭示哮喘寧顆粒通過誘導(dǎo)Th0細(xì)胞向Th1 型細(xì)胞分化，抑制Th2 型細(xì)胞分化能力，提高Th1/Th2 比值，進(jìn)而提高慢性持續(xù)期哮喘患者的治愈率，為臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。