徐嬋娣 譚明明 王軍偉

天臺(tái)縣人民醫(yī)院 浙江 天臺(tái) 317200

酒精性肝病（ALD）是由長(zhǎng)期大量飲酒引起的肝病，其發(fā)病率高、后果嚴(yán)重[1],已成為我國(guó)的第二大肝病[2]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)[3]，烏藥具有保護(hù)酒精性肝損傷、抑制炎癥因子產(chǎn)生、降低門脈內(nèi)毒素水平等作用，但具體的作用機(jī)制尚不十分明確，可能與調(diào)節(jié)腸道細(xì)菌微生態(tài)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)擬通過觀察烏藥對(duì)酒精性肝損傷大鼠腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響，初步探討其對(duì)急性酒精性肝損傷大鼠腸道微生態(tài)的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 方法：取健康雄性SD大鼠60只，隨機(jī)分為6組，分別為正常對(duì)照組（Normal組）、模型對(duì)照組（Model組）、陽性對(duì)照組（PPC組）、烏藥高劑量干預(yù)組（LGH組）、烏藥中劑量干預(yù)組（LGM組）、烏藥低劑量干預(yù)組（LGL組），每組10只。除Normal組灌服等體積的蒸餾水外，其余各組大鼠均給予酒精體積濃度為50%的白酒灌胃，灌胃容積為1ml/100g，每日1次，連續(xù)20天。自造模第l天起，Normal組和Model組給予等體積的蒸餾水灌胃，其余各給藥組分別灌服相應(yīng)的藥物，灌胃容積為1ml/100g，每日1次，連續(xù)20天。PPC組的給藥劑量為思密達(dá)0.6g/kg，LGH組、LGM組、LGL組的給藥劑量分別為3g/kg、2g/kg、1g/kg。

1.2 標(biāo)本處理：收集大鼠新鮮糞便（每組各取5份大便，每份2g），采用Bead-beating法從大鼠糞便中提取腸道菌群總DNA，予PCR擴(kuò)增并純化后在Illumina Miseq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序及16S元基因組的生物信息學(xué)分析。末次給藥后分別取腹主動(dòng)脈血和肝門靜脈血，檢測(cè)血谷丙轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、炎癥因子、門靜脈血內(nèi)毒素水平；與Normal組相比，Model組大鼠血的各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)顯著升高，表明此次急性酒精性肝損傷模型大鼠造模成功。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：用SPASS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 MiSeq高通量測(cè)序結(jié)果分析處理：在97%相似度下用微生態(tài)定量分析流程（QIIME）軟件將所測(cè)序列聚類為用于物種分類的操作分類單元（OTU），統(tǒng)計(jì)各個(gè)樣本每個(gè)OTU的豐度信息。同時(shí)通過應(yīng)用Mothur軟件進(jìn)行Alpha多樣性分析。

2 結(jié)果

2.1 OTU分析結(jié)果：在本實(shí)驗(yàn)中采用QIIME軟件將最終得到的有效序列聚類為OTU，來用于物種分類。通過OTU分析可以觀察樣本中不同微生物的豐度和多樣性。統(tǒng)計(jì)各組在不同OTU中的豐度信息（每組計(jì)算各樣本的OTU總數(shù)），同時(shí)對(duì)OTU按從門到種依次進(jìn)行分類，結(jié)果見表1。由表1可知，LGM組的OTU數(shù)目最多，Model組、Normal組、PPC組的OTU較少，提示烏藥各組大鼠腸道內(nèi)有著較多的細(xì)菌種類。

表1 OTU數(shù)目和分類水平統(tǒng)計(jì)表

2.2 各組大鼠腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析：對(duì)OTUs的代表序列進(jìn)行物種注釋后，比較各組在屬水平上豐度排名前10的物種，見圖1。圖中顯示，Model組大鼠腸道菌群各菌屬中以普氏菌（Prevotella）比例最大，瘤胃球菌（Ruminococcus）、乳酸菌（Lactobacillus）等比例較小。與Model組比較，烏藥各組及PPC組大鼠腸道中瘤胃球菌比例增加，普氏菌比例降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），同時(shí)LGL組及PPC組的乳酸菌比例較Model組明顯增加（P＜0.05）。

2.3 Alpha多樣性分析：本實(shí)驗(yàn)是在97%相似度下，對(duì)單個(gè)樣本進(jìn)行Alpha多樣性分析，通過Mothur軟件來計(jì)算各樣本細(xì)菌群落的物種豐度和多樣性（見表2）。Shannon-Wiener曲線，利用各樣本的測(cè)序量在不同測(cè)序數(shù)量時(shí)的Shannon指數(shù)構(gòu)建的曲線。結(jié)果6組的Shannon-Wiener曲線均已達(dá)到平臺(tái)期，說明該實(shí)驗(yàn)測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，幾乎已獲取了全部的微生物物種信息，可用來后續(xù)分析。Chao1和ACE是用來衡量群落豐度的指數(shù)，指數(shù)越大，說明群落豐富度越高。由表2可知，烏藥各組及PPC組大鼠腸道菌群的Chao1和ACE指數(shù)均較Model組大，尤以LGL組的Chao1和ACE指數(shù)、LGH組的ACE指數(shù)最為顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示LGL、LGH組大鼠腸道細(xì)菌群落的豐度較高。在細(xì)菌群落的多樣性分析上，與Model組相比烏藥各組及PPC組的Simpson、Shannon指數(shù)均較大，即多樣性高，以LGL組最為明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 比例最高的前10個(gè)屬構(gòu)成圖

表2 各組Alpha多樣性指數(shù)比較（xˉ±s）

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，烏藥為理氣藥，對(duì)胃腸道功能有調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)烏藥各組的OTU數(shù)目明顯比Normal組多，提示了烏藥對(duì)正常腸道微生態(tài)具有一定的調(diào)節(jié)作用，這與新近研究相符[4]。OTU分析結(jié)果顯示，烏藥各組的OTU數(shù)目較Model組及PPC組多，說明烏藥可能增加酒精性肝損傷大鼠腸道微生物的種類，而且效果較思密達(dá)更優(yōu)。對(duì)OTUs的代表序列進(jìn)行物種注釋后，比較各組在屬水平上豐度排名前10的物種，發(fā)現(xiàn)Model組大鼠腸道菌群中乳酸菌、瘤胃球菌等比例相對(duì)較小，普氏菌比例明顯增加，提示急性酒精性肝損傷時(shí)益生菌明顯減少，有害細(xì)菌過度生長(zhǎng)。與Model組、Normal組比較，LGH組、LGM組、LGL組及PPC組大鼠腸道中普氏菌比例降低，瘤胃球菌比例增加，以LGH組的作用最明顯，同時(shí)發(fā)現(xiàn)LGL組及PPC組的乳酸菌比例較Model組、Normal組明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能提示了普氏菌、瘤胃球菌對(duì)低劑量的烏藥不敏感，而乳酸菌對(duì)低劑量的烏藥較敏感。說明烏藥有可能通過增加益生菌的量、抑制有害細(xì)菌的生長(zhǎng)。

在Alpha多樣性分析中，烏藥各組大鼠腸道菌群的Chao1和ACE指數(shù)均較Model組大，說明了烏藥各組大鼠腸道細(xì)菌群落的豐度較高；與Model組相比，烏藥各組的Simpson、Shannon指數(shù)均較大，即多樣性高，預(yù)示著烏藥各組大鼠腸道中有著較多的細(xì)菌種類，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。Model組多樣性低，提示其腸道內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單，可能存在相對(duì)單一的腸道優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，結(jié)合各組在屬水平上豐度排名，考慮為普氏菌過度生長(zhǎng)。

本研究顯示，烏藥可通過提高大鼠腸道菌群的物種多樣性，增加細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，對(duì)酒精性肝損傷大鼠腸道微生物具有一定的調(diào)節(jié)作用。