徐嬋娣 譚明明 王軍偉

天臺縣人民醫(yī)院 浙江 天臺 317200

酒精性肝?。ˋLD）是由長期大量飲酒引起的肝病，其發(fā)病率高、后果嚴重[1],已成為我國的第二大肝病[2]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)[3]，烏藥具有保護酒精性肝損傷、抑制炎癥因子產(chǎn)生、降低門脈內毒素水平等作用，但具體的作用機制尚不十分明確，可能與調節(jié)腸道細菌微生態(tài)相關。本實驗擬通過觀察烏藥對酒精性肝損傷大鼠腸道細菌群落結構及多樣性的影響，初步探討其對急性酒精性肝損傷大鼠腸道微生態(tài)的調節(jié)作用及機制。

1 材料和方法

1.1 方法：取健康雄性SD大鼠60只，隨機分為6組，分別為正常對照組（Normal組）、模型對照組（Model組）、陽性對照組（PPC組）、烏藥高劑量干預組（LGH組）、烏藥中劑量干預組（LGM組）、烏藥低劑量干預組（LGL組），每組10只。除Normal組灌服等體積的蒸餾水外，其余各組大鼠均給予酒精體積濃度為50%的白酒灌胃，灌胃容積為1ml/100g，每日1次，連續(xù)20天。自造模第l天起，Normal組和Model組給予等體積的蒸餾水灌胃，其余各給藥組分別灌服相應的藥物，灌胃容積為1ml/100g，每日1次，連續(xù)20天。PPC組的給藥劑量為思密達0.6g/kg，LGH組、LGM組、LGL組的給藥劑量分別為3g/kg、2g/kg、1g/kg。

1.2 標本處理：收集大鼠新鮮糞便（每組各取5份大便，每份2g），采用Bead-beating法從大鼠糞便中提取腸道菌群總DNA，予PCR擴增并純化后在Illumina Miseq平臺進行高通量測序及16S元基因組的生物信息學分析。末次給藥后分別取腹主動脈血和肝門靜脈血，檢測血谷丙轉氨酶、總膽紅素、炎癥因子、門靜脈血內毒素水平；與Normal組相比，Model組大鼠血的各項檢測指標顯著升高，表明此次急性酒精性肝損傷模型大鼠造模成功。

1.3 統(tǒng)計學處理：用SPASS 20.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，組間比較采用兩樣本t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

1.4 MiSeq高通量測序結果分析處理：在97%相似度下用微生態(tài)定量分析流程（QIIME）軟件將所測序列聚類為用于物種分類的操作分類單元（OTU），統(tǒng)計各個樣本每個OTU的豐度信息。同時通過應用Mothur軟件進行Alpha多樣性分析。

2 結果

2.1 OTU分析結果：在本實驗中采用QIIME軟件將最終得到的有效序列聚類為OTU，來用于物種分類。通過OTU分析可以觀察樣本中不同微生物的豐度和多樣性。統(tǒng)計各組在不同OTU中的豐度信息（每組計算各樣本的OTU總數(shù)），同時對OTU按從門到種依次進行分類，結果見表1。由表1可知，LGM組的OTU數(shù)目最多，Model組、Normal組、PPC組的OTU較少，提示烏藥各組大鼠腸道內有著較多的細菌種類。

表1 OTU數(shù)目和分類水平統(tǒng)計表

2.2 各組大鼠腸道細菌群落結構分析：對OTUs的代表序列進行物種注釋后，比較各組在屬水平上豐度排名前10的物種，見圖1。圖中顯示，Model組大鼠腸道菌群各菌屬中以普氏菌（Prevotella）比例最大，瘤胃球菌（Ruminococcus）、乳酸菌（Lactobacillus）等比例較小。與Model組比較，烏藥各組及PPC組大鼠腸道中瘤胃球菌比例增加，普氏菌比例降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），同時LGL組及PPC組的乳酸菌比例較Model組明顯增加（P＜0.05）。

2.3 Alpha多樣性分析：本實驗是在97%相似度下，對單個樣本進行Alpha多樣性分析，通過Mothur軟件來計算各樣本細菌群落的物種豐度和多樣性（見表2）。Shannon-Wiener曲線，利用各樣本的測序量在不同測序數(shù)量時的Shannon指數(shù)構建的曲線。結果6組的Shannon-Wiener曲線均已達到平臺期，說明該實驗測序數(shù)據(jù)量足夠大，幾乎已獲取了全部的微生物物種信息，可用來后續(xù)分析。Chao1和ACE是用來衡量群落豐度的指數(shù)，指數(shù)越大，說明群落豐富度越高。由表2可知，烏藥各組及PPC組大鼠腸道菌群的Chao1和ACE指數(shù)均較Model組大，尤以LGL組的Chao1和ACE指數(shù)、LGH組的ACE指數(shù)最為顯著，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示LGL、LGH組大鼠腸道細菌群落的豐度較高。在細菌群落的多樣性分析上，與Model組相比烏藥各組及PPC組的Simpson、Shannon指數(shù)均較大，即多樣性高，以LGL組最為明顯，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖1 比例最高的前10個屬構成圖

表2 各組Alpha多樣性指數(shù)比較（xˉ±s）

3 討論

中醫(yī)學認為，烏藥為理氣藥，對胃腸道功能有調節(jié)作用。本實驗中發(fā)現(xiàn)烏藥各組的OTU數(shù)目明顯比Normal組多，提示了烏藥對正常腸道微生態(tài)具有一定的調節(jié)作用，這與新近研究相符[4]。OTU分析結果顯示，烏藥各組的OTU數(shù)目較Model組及PPC組多，說明烏藥可能增加酒精性肝損傷大鼠腸道微生物的種類，而且效果較思密達更優(yōu)。對OTUs的代表序列進行物種注釋后，比較各組在屬水平上豐度排名前10的物種，發(fā)現(xiàn)Model組大鼠腸道菌群中乳酸菌、瘤胃球菌等比例相對較小，普氏菌比例明顯增加，提示急性酒精性肝損傷時益生菌明顯減少，有害細菌過度生長。與Model組、Normal組比較，LGH組、LGM組、LGL組及PPC組大鼠腸道中普氏菌比例降低，瘤胃球菌比例增加，以LGH組的作用最明顯，同時發(fā)現(xiàn)LGL組及PPC組的乳酸菌比例較Model組、Normal組明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義。這可能提示了普氏菌、瘤胃球菌對低劑量的烏藥不敏感，而乳酸菌對低劑量的烏藥較敏感。說明烏藥有可能通過增加益生菌的量、抑制有害細菌的生長。

在Alpha多樣性分析中，烏藥各組大鼠腸道菌群的Chao1和ACE指數(shù)均較Model組大，說明了烏藥各組大鼠腸道細菌群落的豐度較高；與Model組相比，烏藥各組的Simpson、Shannon指數(shù)均較大，即多樣性高，預示著烏藥各組大鼠腸道中有著較多的細菌種類，細菌群落結構穩(wěn)定。Model組多樣性低，提示其腸道內細菌群落結構比較簡單，可能存在相對單一的腸道優(yōu)勢細菌，結合各組在屬水平上豐度排名，考慮為普氏菌過度生長。

本研究顯示，烏藥可通過提高大鼠腸道菌群的物種多樣性，增加細菌群落結構穩(wěn)定性，對酒精性肝損傷大鼠腸道微生物具有一定的調節(jié)作用。