邵靚 ，丁夢蝶，周莉媛，鄧飛，裴超信，陳弟詩，陳亮，周明忠

（1.四川省動物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041；2.四川省德陽市動物疫病預(yù)防控制中心，四川 德陽 618000）

兔病毒性出血癥2 型（RHD2）又稱兔瘟2型，是由兔出血癥病毒2型（RHDV2）引起的危害家兔和野兔的一種新型高度傳染性、急性致死性疫病。該病是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）法定通報疫病，我國將其列為二類動物疫病。RHD2自2010 年4 月在法國首次報道后，主要在歐洲國家流行。

1 發(fā)病情況及臨床癥狀

某兔場存欄種兔和商品兔約600 只，兔已免兔病毒性出血癥、多殺性巴氏桿菌病二聯(lián)蜂膠滅活疫苗（YT株+JN株）。商品兔飼養(yǎng)期間出現(xiàn)零星發(fā)病死亡，至發(fā)病第4 d共計(jì)死亡商品兔56只，種兔未見異常。患兔主要表現(xiàn)為精神較差、嗜睡、體溫升高，個別兔死前口鼻出血。

2 剖檢病變

病死兔氣管出血，肺出血、腫大，呈花斑樣，肝臟腫大、出血、質(zhì)脆，脾臟瘀血，邊緣梗死，心臟出血、瘀血，腎臟出血、瘀血（見圖1）。

3 實(shí)驗(yàn)室診斷

圖1 剖檢病變

3.1 熒光RT-PCR 擴(kuò)增 分別取4 只病死兔的肝脾等臟器混合研磨勻漿，8 000 r/min 離心2min后取上清，使用磁珠法核酸提取試劑盒和核酸自動提取儀（天?。┻M(jìn)行核酸提取。使用OIE推薦的引物和TaqMan熒光探針對RHDV2 VP60特異性基因片段進(jìn)行熒光RT-PCR擴(kuò)增。上游引物序列為5′-TGGAACTTGGCTTGAGTGTTGA-3′，下游引物序列為5′-ACAAGCGTGCTTGTGGACGG-3′，探針序列為5′-FAM-TGTCAGAACTTGTTGACATCCGCCC-TAMRA-3′。熒光RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：RT-PCR 反應(yīng)液10 μL、RT 酶0.4 μL、Taq 酶0.4 μL、上下游引物各1 μL、探針0.7 μL、2 μL RNA 模板、RNase Free H2O 補(bǔ)足到20 μL。反應(yīng)條件為：42 ℃5 min，95 ℃20 s；95 ℃10 s，60 ℃40 s（此階段結(jié)束時采集熒光信號），40個循環(huán)；報告基團(tuán)“FAM”，淬滅基團(tuán)“None”。熒光PCR 儀型號為BIO-RAD CFX96。結(jié)果顯示，陰陽性對照成立，4 只病死兔肝脾等臟器混合樣品在12-16個循環(huán)出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，均為RHDV2核酸陽性。

3.2 序列分析 使用OIE推薦的RHDV2特異性引物進(jìn)行VP60 基因片段擴(kuò)增，上游引物序列為5′-GAATGTGCTTGAGTTYTGGTA-3′，下游引物序列為5′-CAAGTCCCAGTCCRATRAA-3′，理論上可擴(kuò)增得到大小為794 bp的特異性條帶。RTPCR 反應(yīng)體系為：2×one step buffer 10 μL、Enzyme mix 0.8 μL、上下游引物各0.5 μL、RNA 模板2 μL、RNase Free H2O補(bǔ)足到20 μL。RT-PCR反應(yīng)采用一步法，反應(yīng)條件為：50 ℃30 min，94 ℃2 min；94 ℃30 s，52 ℃30 s，72 ℃50 s，35個循環(huán)；72 ℃5 min。取3 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，樣品在790 bp 處有條帶，與理論值相符。

將RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送測，測序結(jié)果進(jìn)行Blast 序列比對，結(jié)果顯示所測序列與RHDV2 參考毒株的VP60 部分序列高度同源，其中同源性最高的是荷蘭RHDV2 分離株RHDV2-NL2016（GenBank登錄號MN061492.1），同源率為96.83%。從GenBank 數(shù)據(jù)庫中下載部分RHDV2和經(jīng)典RHDV 毒株序列，采用Larsergene 軟件MegAlign 進(jìn)行核苷酸同源性分析，結(jié)果顯示所測序列與國外公布的RHDV2 毒株VP60 基因片段的核苷酸序列同源性為92.5%～97.6%，用MEGA6軟件Neighbor-Joining 法進(jìn)行遺傳變異分析，結(jié)果顯示所測序列與RHDV2 毒株在同一分支上，親緣關(guān)系較近，而與經(jīng)典RHDV 毒株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

根據(jù)上述序列分析數(shù)據(jù)，將本次發(fā)病兔場家兔組織病料中的RHDV2 毒株命名為SCADCZJ01。

4 防控

確診后立即開展應(yīng)急處置，病死兔全部深埋和無害化處理，發(fā)病兔和疑似病兔隔離飼養(yǎng)，每天觀察2～3 次，兔舍、用具、飼料、飲水及周邊環(huán)境每天嚴(yán)格消毒2～4 次。禁止出售、轉(zhuǎn)（贈）送、轉(zhuǎn)移活兔及其產(chǎn)品，禁止購進(jìn)新兔，嚴(yán)禁外來人員入場。

5 小結(jié)

兔瘟2 型目前尚無有效治療藥物和疫苗，其與經(jīng)典兔瘟臨床癥狀相似，故做好該病的診斷與監(jiān)測是防控的關(guān)鍵。防控兔瘟2 型應(yīng)加強(qiáng)引種隔離和檢疫，最好自繁自養(yǎng)。養(yǎng)兔場應(yīng)定期消毒和清理糞便等污物，做好滅蚊、滅蠅、滅鼠等工作，種兔和肉兔分點(diǎn)飼養(yǎng)，做好臨床觀察和記錄。發(fā)現(xiàn)疑似病兔應(yīng)立即隔離，并早診斷、早處理。