趙凱 林大鈞 盧俊 于瑞國 黃梓輝

1.廣東省公安廳刑事技術(shù)中心2.廣東省湛江市公安局

3.中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院4.高盛生物技術(shù)股份有限公司

引言

得益于容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化提取的優(yōu)勢，磁珠法作為目前主流的核酸DNA提取手段，在法醫(yī)鑒定領(lǐng)域得到了非常廣泛的應(yīng)用。但在此趨勢下，不易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的硅珠法仍然沒有被市場淘汰，就是因?yàn)楣柚榉ň哂写胖榉ㄋ痪邆涞膬?yōu)勢。與磁珠相比，硅珠法提取在靈敏度方面并沒有明顯差異，而且硅珠法提取所得的產(chǎn)物更為純凈，適用于法醫(yī)上的疑難檢材提取，如陳舊骨骼、腐敗組織等[1,2]。由于法醫(yī)檢材的復(fù)雜性以及特殊性，在提取過程中會(huì)存在各種抑制物，如泥土、灰塵、油污等，大大增加了提取的難度。因此，核酸提取方法的抗抑制能力在法醫(yī)領(lǐng)域尤其重要。為驗(yàn)證硅珠法提取DNA的靈敏度，并且探究該方法的抗抑制能力，本文設(shè)計(jì)方案，模擬法醫(yī)樣品進(jìn)行測試，以期正確評價(jià)硅珠提取法的靈敏度及抗抑制性能。

一、材料與方法

（一）材料

實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)準(zhǔn)DNA為ABI公司VeriFilerTMPlus PCR擴(kuò)增試劑盒中自帶的007標(biāo)準(zhǔn)DNA，濃度為100pg/ul；血液樣本用EDTA抗凝管采集混勻后分裝，-20℃凍存，使用前隨機(jī)取3管分裝的血液混合，充分混勻后用無菌超純水稀釋1000倍待用；硅珠提取以及磁珠提取分別采用一款常見市售試劑盒；提取產(chǎn)物的擴(kuò)增使用VeriFilerTMPlus PCR試劑盒，并采用ABI公司Veriti 96 Well Fast Thermal Cycler型號(hào)擴(kuò)增儀；電泳分析采用ABI公司3500型號(hào)測序儀。

（二）樣品處理

標(biāo)準(zhǔn)DNA混勻后直接吸取相應(yīng)體積，添加至離心管上層套管待用；稀釋血液混勻后吸取相應(yīng)體積，滴加至棉簽頭上，剪下棉簽頭，放置到離心管上層套管待用；抗抑制能力測試組，稀釋血如上所述處理好后，再添加抑制物至上層套管內(nèi)，盡量混勻，待用。磁珠提取和硅珠提取的樣本處理方式保持一致，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

（三）樣品提取

樣品準(zhǔn)備好之后，硅珠提取和磁珠提取各自按說明書進(jìn)行裂解、結(jié)合、清洗、烘干以及洗脫等步驟。磁珠提取最終轉(zhuǎn)移上清產(chǎn)物待用，硅珠提取則保留硅珠得到最終產(chǎn)物。

（四）STR擴(kuò)增及電泳分析

擴(kuò)增體系為2ul Mix+1ul Primer+7ul提取產(chǎn)物，總共進(jìn)行29個(gè)循環(huán)。硅珠提取產(chǎn)物可帶珠擴(kuò)增，因此吸取擴(kuò)增模板前應(yīng)充分混勻。擴(kuò)增結(jié)束后使用ABI 3500測序儀進(jìn)行電泳分析，體系為9.7ul HIDI+0.3ul Size Standard（LIZ 600）+1ul PCR product；電泳參數(shù)為電壓1.2kV，進(jìn)樣時(shí)間18秒，進(jìn)樣量1ul。

二、結(jié)果

（一）提取靈敏度對比

對于硅珠法提取靈敏度的驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)設(shè)置了樣品的濃度梯度進(jìn)行測試：標(biāo)準(zhǔn)DNA 300pg、400pg、500pg；1000×稀釋血10ul、20ul、30ul；磁珠提取僅設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)DNA 300pg、1000×稀釋血10ul進(jìn)行測試。洗脫體積皆為50ul。結(jié)果如圖1A所示，當(dāng)DNA投入量為300pg時(shí)，硅珠提取法平均可獲得23.7個(gè)位點(diǎn)，檢出率在95%以上，與磁珠提取效率相同（圖1B）；而當(dāng)DNA投入量為500pg時(shí)，已經(jīng)可以穩(wěn)定檢出全位點(diǎn)（25個(gè)）。對于10ul稀釋血樣品（圖1 A），硅珠提取平均可檢出21.7個(gè)位點(diǎn)，與磁珠提取結(jié)果相同（圖1B），無顯著差異（表1）；當(dāng)稀釋血量為30ul時(shí)，硅珠提取可穩(wěn)定檢出全位點(diǎn)。通過STR圖譜分析，可知硅珠法在提取300pg DNA時(shí)，峰值范圍為300~1400 RFU（圖2A），相比磁珠法提取峰值范圍300~4000 RFU（圖2 B），在最高峰值上有所差異；在提取10ul稀釋血時(shí)，硅珠法峰值范圍為300~3500 RFU（圖2C），效果比磁珠法（峰值范圍200~1200 RFU）更優(yōu)（圖2D）。

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（二）硅珠提取靈敏度優(yōu)化方法

納米硅珠顆粒粒徑一般比磁珠顆粒小，且不帶磁核，對PCR擴(kuò)增無抑制作用，因此可以帶珠擴(kuò)增[6]。硅珠這一特性使小體積洗脫以提高靈敏度成為可能，這也是磁珠所不具備的優(yōu)勢。在本實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置了標(biāo)準(zhǔn)DNA 100pg、1000×稀釋血5ul進(jìn)行測試，洗脫體積分為10ul和20ul兩個(gè)梯度。結(jié)果顯示，用10ul體積洗脫時(shí)，100pg標(biāo)準(zhǔn)DNA平均可穩(wěn)定檢出24個(gè)位點(diǎn)，5ul 1000×稀釋血平均可檢出23.7個(gè)位點(diǎn)，兩者位點(diǎn)檢出率皆在94.8%以上；20ul洗脫時(shí)，100pg標(biāo)準(zhǔn)DNA和5ul 1000×稀釋血皆平均可檢出21.3個(gè)位點(diǎn)（圖3A）。STR圖譜顯示，在10ul洗脫條件下，硅珠法提取100pg DNA的STR峰值范圍可達(dá)200~1800 RFU（圖3 B）；提取10ul稀釋血時(shí)峰值甚至可達(dá)400~2000 RFU（圖3C）。因此，通過減小洗脫體積并帶珠擴(kuò)增的方式，硅珠法提取DNA的靈敏度可得到顯著提升（表2）。

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（三）模擬抗抑制能力測試

在真實(shí)案件中，檢材類別豐富多樣，經(jīng)常會(huì)含有各種可能會(huì)對檢材DNA的提取和擴(kuò)增帶來干擾的物質(zhì)，因此提取方法的抗抑制能力尤其重要。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)日常案件常見檢材可能攜帶的抑制物，收集了包括鐵銹、灰塵、墻灰、牙膏、果汁、油脂、單寧酸在內(nèi)的7種模擬抑制物，以500pg標(biāo)準(zhǔn)DNA以及30ul 1000×稀釋血為提取樣本，分別加入單倍量及雙倍量的抑制物進(jìn)行測試，洗脫體積皆為50ul。模擬抑制物具體添加量見表3：牙膏事先均勻涂在濾紙上晾干，然后剪取適當(dāng)大小紙片；果汁為人工榨取蘋果、橙汁混合，常溫放置1天；單寧酸事先配制成11mg/ml母液；油脂為植物油；其余材料采集自室內(nèi)或室外。結(jié)果顯示，在單倍量抑制物存在時(shí)，單寧酸對標(biāo)準(zhǔn)DNA及血樣的結(jié)果都有較大影響，但是位點(diǎn)平均都在18個(gè)以上；其余抑制物則位點(diǎn)平均都在20個(gè)以上，對硅珠法提取的影響較小。在加倍量抑制物存在時(shí)，抑制效果比單倍量有所加強(qiáng)，但平均仍可獲得18個(gè)STR位點(diǎn)以上。由此可見，硅珠法提取DNA具有良好的抗抑制能力（表4）。

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三、討論

當(dāng)檢材中所含有的人源細(xì)胞被充分裂解后，納米硅珠顆粒通過自身攜帶的硅羥基，在低pH、高鹽條件下與DNA互相結(jié)合，在高pH、低鹽條件下逆轉(zhuǎn)，釋放DNA[3,4]。這種提取原理簡單高效，可從各類復(fù)雜樣本中穩(wěn)定獲得高純度的DNA，方便后續(xù)STR位點(diǎn)分析。通過本文的驗(yàn)證和測試，證實(shí)了硅珠法具有媲美磁珠法的靈敏度。在50ul洗脫時(shí)，硅珠法可穩(wěn)定檢出300pg標(biāo)準(zhǔn)DNA及20ul 1000×稀釋血。當(dāng)洗脫體積減少至10~20ul時(shí)，甚至可有效檢出100pg標(biāo)準(zhǔn)DNA以及5ul 1000×稀釋血。在保證靈敏度的同時(shí)，硅珠法提取還具有良好的抗抑制能力。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室以往測試及案件分析結(jié)果，本文所選取的7種模擬抑制物在日常真實(shí)案件中較為常見，且對磁珠法的提取效果皆有一定影響，而對于硅珠法提取的提取效果則影響較小。其中，單寧酸對硅珠法的影響相對較大，推測原因?yàn)閱螌幩峥膳c溶液中可溶性蛋白結(jié)合形成不溶性固體，高速離心時(shí)隨著硅珠一起沉淀，最終被帶到提取產(chǎn)物中，影響PCR擴(kuò)增。另外，單寧酸可能存在于土壤或者皮革衣物中，一般含量較少，本文測試中所加的單寧酸量相對較大，因此增加了對結(jié)果的影響。

分析靈敏度測試結(jié)果發(fā)現(xiàn)，硅珠法提取標(biāo)準(zhǔn)DNA的效率高于提取稀釋血液的效率。血液成分復(fù)雜程度遠(yuǎn)超純凈的標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品，在提取穩(wěn)定性上會(huì)受到一定程度的影響。另外，為模擬真實(shí)條件，血液樣本滴加在棉簽頭上進(jìn)行裂解。在此過程中，棉纖維會(huì)牢固吸附部分DNA，使其被截留，且細(xì)微的棉纖維還會(huì)隨離心進(jìn)入下層管，造成硅珠及磁珠的輕微聚團(tuán)，降低了吸附以及洗脫效率，最終影響STR位點(diǎn)檢出率，這也是該類提取方法今后需要優(yōu)化的方向之一。盡管如此，硅珠法在提取稀釋血方面仍具有優(yōu)異的表現(xiàn)。

經(jīng)過不斷的改良，硅珠法的提取效果已經(jīng)得到顯著提升，在真實(shí)疑難案件中的應(yīng)用也常有報(bào)道[5-7]。汗?jié)撝讣y中脫落細(xì)胞稀少，較難獲得完整STR分型，在雒彩虹等的研究中，硅珠法提取汗?jié)撝讣y等接觸性檢材效果優(yōu)異[8,9]。而對于高度腐敗、污穢的案件檢材，硅珠法的表現(xiàn)也可圈可點(diǎn)，林大鈞等就通過該方法，成功從高度腐敗的肋軟骨組織、污水浸泡的鋼絲，以及污穢指甲垢中獲取了有效的STR分型結(jié)果[10-12]。這些研究都表明，硅珠法在面對超微量、高度污穢、腐敗等復(fù)雜檢材時(shí)，具有更高的抗抑制能力，并且得益于可帶珠擴(kuò)增的特點(diǎn)，可以通過減小洗脫體積的方式，極大提高提取靈敏度。因此，硅珠法可作為磁珠法的重要補(bǔ)充，可更有效處理磁珠法提取無法檢出的檢材。綜上所述，硅珠法作為一種具備獨(dú)特優(yōu)勢的提取方法，必將在未來得到更廣闊的應(yīng)用。