王 偉，何 平，江小明

（武漢食品化妝品檢驗(yàn)所，湖北 武漢 430012）

木犀草素（luteolin，lut）是一類典型C6-C3-C6結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物，廣泛存在于抗炎植物原料中[1-6]。木犀草素通常以黃酮苷形式存在，如黃酮氧苷結(jié)構(gòu)的木犀草苷（cynaroside，cyn）[2-4]，以及黃酮碳苷結(jié)構(gòu)的葒草素（orientin，ori）[7]與異葒草素（homoorientin，homo）[8]。木犀草素及其黃酮苷具有廣泛生理活性，如抗炎[2,9]、抗氧化[10]、抗腫瘤[11]、抑制肥胖[12]、緩解II型糖尿病[12]等。而抗炎、抗氧化活性是黃酮類化合物發(fā)揮抗腫瘤、抑制肥胖、II型糖尿病等生理活性的基礎(chǔ)[13]。

黃酮類化合物發(fā)揮抗炎活性的主要場(chǎng)所在免疫細(xì)胞（其中主要是巨噬細(xì)胞），黃酮類化合物對(duì)巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)的抑制活性可通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)[14]。黃酮類化合物在不同水平抑制NF-κB信號(hào)通路下調(diào)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。Hamalainen等[15]研究NO/誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和NF-κB抑制的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，在巨噬細(xì)胞模型中類黃酮在減少iNOS產(chǎn)生的同時(shí)也抑制了NF-κB蛋白家族的轉(zhuǎn)錄活性；槲皮素[16]、白藜蘆醇[17]、甘草素[18]、漆黃素[19]、木犀草素[20]等在相似的作用濃度下對(duì)NF-κB信號(hào)通路上游關(guān)鍵調(diào)控蛋白κB抑制因子α亞基（α inhibitor of κB，IκBα）具有相似的抑制活性；桑色素[21]、漆黃素[22]均可通過抑制NF-κB信號(hào)通路經(jīng)典途徑的直接上游靶點(diǎn)IκB激酶β亞基（IκB kinase β，IKKβ）從而抑制IKK對(duì)IκB的激活作用，進(jìn)而抑制NF-κB信號(hào)通路。

另一方面，Kelch樣ECH相關(guān)蛋白-1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）/核因子E2相關(guān)性因子2（nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2）信號(hào)通路是迄今發(fā)現(xiàn)最重要的黃酮類化合物抗氧化信號(hào)通路[23-24]。黃酮類化合物主要通過該信號(hào)通路降低細(xì)胞氧化應(yīng)激水平發(fā)揮抗氧化活性。其通過促使Keap1-Nrf2解偶聯(lián)，促進(jìn)Nrf2解離并發(fā)生核移位與抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）結(jié)合，調(diào)控一系列抗氧化物質(zhì)如谷胱甘肽血紅素氧合酶（heme oxygenase-1，HO-1）、還原型輔酶II醌氧化還原酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphat quinone oxidoreductase 1，NQO1）等表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抗氧化作用[25-26]。這是低利用率的黃酮類化合物可在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮高抗氧化活性的重要原因。

研究表明木犀草素及其黃酮苷具有較好的抗炎和抗氧化活性，然而，木犀草素及其黃酮苷能否在發(fā)揮抗炎活性的同時(shí)發(fā)揮抗氧化活性，其抗炎、抗氧化活性的兩條主要信號(hào)通路之間是否存在交叉作用尚鮮見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)基于人源巨噬細(xì)胞THP-1，從分子水平探究木犀草素及其黃酮苷抑制NF-κB信號(hào)通路而發(fā)揮的抗炎作用，及對(duì)Nrf2轉(zhuǎn)錄活性的激活作用，解析木犀草素及其黃酮苷的抗炎作用、抗氧化活性及作用機(jī)制，為開發(fā)天然來源的抗炎、抗氧化活性成分提供依據(jù)，為木犀草素作為天然抗氧化劑的拓展應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

THP-1單核巨噬細(xì)胞 上海細(xì)胞庫；木犀草素上海阿拉丁生化科技股份有限公司；木犀草苷、葒草素、異葒草素（均為色譜級(jí)，純度≥98%） 上海源葉生物科技有限公司；NF-κB抑制劑BAY 11-7082 美國(guó)MCE公司；RPMI培養(yǎng)基 美國(guó)HyClone公司；胎牛血清 澳大利亞AusGeneX公司；青鏈霉素溶液（100×）杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司； 噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、豆蔻佛波醇乙酯（phorbol 12-myristate13-acetate，PMA）、β-巰基乙醇 美國(guó)Sigma公司；高純總RNA提取試劑盒 北京艾德萊生物科技有限公司；漿蛋白與核蛋白提取試劑盒、Western Blot分析試劑 美國(guó)AspenTech公司；PrimeScriptTMreagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）SYBR Premix ExTaqTMII熒光定量試劑盒 日本TaKaRa公司；腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒北京欣博盛生物科技有限公司；所有分析用有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Multifuge X1R高速冷凍離心機(jī)、全波長(zhǎng)讀數(shù)儀美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；ECLIPSE TS100倒置顯微鏡 日本尼康公司；SW-CJ-1FD超凈操作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；N60超微量分光光度計(jì) 德國(guó)Implen公司；DW-86L626超低溫冰箱 青島海爾集團(tuán)公司；24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞刮刀、細(xì)胞凍存管 美國(guó)Corning公司；25 cm2及75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶 德國(guó)Greiner公司；Biospectrometer紫外分光光度計(jì) 德國(guó)Eppendorf公司；MG96G PCR儀 杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；ChemiDoc MP凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio Legend公司；qTOWER2.2熒光定量PCR儀 德國(guó)Analytik Jena公司；DYY-8C凝膠電泳儀、DYY-6C電泳儀、DYCZ-400D轉(zhuǎn)移電泳儀槽、DYCZ-24DN垂直電泳槽、WD-9405A脫色搖床 北京市六一儀器廠；T GL-16c 臺(tái)式離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠；TGL-16冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；IMS-20制冰機(jī) 常熟市雪科電器有限公司；HH-W-600水浴鍋 金壇市江南儀器廠；AX-II暗匣 廣東粵華醫(yī)療器械廠有限公司；LiDE110 DYY-6C掃描儀 日本Canon公司；0.45 μm聚偏氟乙烯膜 美國(guó)Millipore公司；醫(yī)用X射線膠片美國(guó)Kodak公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)方法參考Lund等[27]的方法并略作調(diào)整。THP-1單核巨噬細(xì)胞以RPMI完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基由10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、0.1 μmol/L的β-巰基乙醇組成，細(xì)胞于5% CO2、相對(duì)濕度90%、37 ℃ CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每24 h于倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)密度達(dá)到70%～80%左右時(shí)進(jìn)行分瓶傳代。

1.3.2 MTT實(shí)驗(yàn)

采用MTT法[19]測(cè)定黃酮類化合物對(duì)THP-1單核巨噬細(xì)胞的毒性作用。

稀釋細(xì)胞懸液，加入PMA試劑（0.1 μmol/L），接種100 μL細(xì)胞到96 板中，使其將密度為3×104個(gè)/孔，同時(shí)留一列不接種細(xì)胞（設(shè)為空白組1），細(xì)胞培養(yǎng)板放入CO2培養(yǎng)箱中使之貼壁。12 h后小心吸去上清液，以溫?zé)岬牧姿猁}緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）輕輕清洗細(xì)胞，棄去PBS，加入新鮮RPMI完全培養(yǎng)基，靜息24 h。

小心吸去靜息24 h的細(xì)胞上清液，加入新的培養(yǎng)液，培養(yǎng)液分為樣品組：含10%胎牛血清的RPMI完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)液中輕輕加入5 μmol/L黃酮類化合物溶液（lut、cyn、ori、homo）或10 μmol/L NF-κB抑制劑Bay-11-7082（Bay組，陽性對(duì)照）；CK組：含10%胎牛血清的RPMI完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)液不加黃酮類化合物溶液；空白組2：不含胎牛血清的RPMI完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)液不加黃酮類化合物溶液。處理后的細(xì)胞板放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，樣品組與空白組均設(shè)8 個(gè)平行。

小心吸去細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)上清液，輕輕加入配制好的MTT溶液（質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL），放入CO2培養(yǎng)箱中避光孵育3～4 h。小心吸去細(xì)胞培養(yǎng)板中MTT溶液，以150 μL二甲亞砜溶解細(xì)胞中甲瓚結(jié)晶，于37 ℃振蕩孵育10 min，在酶標(biāo)儀上讀取490 nm波長(zhǎng)處吸光度，按下式計(jì)算細(xì)胞存活率。

式中：AT為樣品組在490 nm波長(zhǎng)處的吸光度；AN為空白組1在490 nm波長(zhǎng)處的吸光度；AC為空白組2在490 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)TNF-α、IL-6、IL-1β水平

稀釋細(xì)胞懸液，接種2 mL細(xì)胞到12 孔板中，使其密度為5×106個(gè)/孔，待細(xì)胞覆蓋孔板底部80%～90%時(shí)，加入PMA試劑（終濃度為0.1 μmol/L），放入CO2培養(yǎng)箱中使之貼壁。培養(yǎng)12 h后小心吸去上清液，以溫?zé)岬腜BS輕輕清洗細(xì)胞，去PBS，加入新鮮RPMI完全培養(yǎng)基，靜息24 h。

以不含血清的RPMI培養(yǎng)液稀釋黃酮類化合物母液，使其終濃度為5 μmol/L，小心吸去細(xì)胞培養(yǎng)板上清液，加入新的培養(yǎng)液，培養(yǎng)液分為樣品組（分組及處理方式同1.3.2節(jié)）；LPS組：含10%胎牛血清的RPMI完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)液不加黃酮類化合物溶液；CK組：含10%胎牛血清的RPMI完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)液不加黃酮類化合物溶液和LPS。處理后的細(xì)胞培養(yǎng)板放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 h后取出12 孔板，樣品組和LPS組加入LPS（LPS終質(zhì)量濃度為1 μg/mL），CK組不加LPS，將12 孔板放回細(xì)胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)12 h。收集細(xì)胞上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、L-1β水平。

1.3.4 熒光定量PCR法檢測(cè)TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA的含量

采用熒光定量PCR法[28]相對(duì)定量細(xì)胞中TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA。稀釋細(xì)胞懸液，接種2 mL細(xì)胞到12 孔板中，使其密度為5×106個(gè)/孔，待細(xì)胞覆蓋孔板底部80%～90%時(shí)，加入PMA試劑（終濃度為0.1 μmol/L），放入CO2培養(yǎng)箱中使之貼壁。培養(yǎng)12 h后小心吸去上清液，以溫?zé)岬腜BS輕輕清洗細(xì)胞，棄去PBS，加入新鮮RPMI完全培養(yǎng)基，靜息24 h。

以不含血清的RPMI培養(yǎng)液稀釋黃酮類化合物母液，使其終濃度為5 μmol/L，小心吸去細(xì)胞培養(yǎng)板上清液，細(xì)胞處理同1.3.3節(jié)。以TRIzol試劑裂解細(xì)胞收集細(xì)胞樣品。采用熒光定量PCR法測(cè)定各處理組細(xì)胞中TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA水平。

樣品中RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、定量方法分別按試劑盒說明書操作。各指標(biāo)引物信息見表1。

表 1 熒光定量PCR引物信息Table 1 Primer sequences used for quantitative PCR

1.3.5 Western Blot法檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白相對(duì)含量

1.3.5.1 Western Blot法檢測(cè)P-IκBα、P-IKKβ相對(duì)含量

稀釋細(xì)胞懸液，接種2 mL細(xì)胞到6 孔板中，使其密度為1×107個(gè)/孔，待細(xì)胞覆蓋孔板底部80%～90%時(shí)，加入PMA試劑（終濃度為0.1 μmol/L），放入CO2培養(yǎng)箱中使之貼壁。培養(yǎng)12 h后小心吸去上清液，以溫?zé)岬腜BS輕輕清洗細(xì)胞，去PBS，加入新鮮RPMI完全培養(yǎng)基，靜息24 h。

以不含血清的RPMI培養(yǎng)液稀釋黃酮類化合物母液，使其終濃度為5 μmol/L，小心吸去細(xì)胞培養(yǎng)板上清液，分別加4 種黃酮類化合物溶液或10 μmol/L NF-κB抑制劑Bay；保留部分孔板不加黃酮類化合物，設(shè)置為CK組和LPS組，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 h后取出細(xì)胞培養(yǎng)板，樣品組和LPS組加入LPS（LPS終質(zhì)量濃度為1 μg/mL），CK組不加LPS，將細(xì)胞培養(yǎng)板放回細(xì)胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)30 min。以RPMI裂解液裂解細(xì)胞收集細(xì)胞總蛋白樣品，并采用Western Blot法測(cè)定總蛋白中P-IκBα、P-IKKβ含量[29]。分析抑制劑和黃酮類化合物對(duì)LPS刺激下THP-1單核巨噬細(xì)胞中P-IκBα和P-IKKβ影響，以CK組對(duì)含量記為0.000，LPS組對(duì)含量記為1.000。

1.3.5.2 Western Blot法檢測(cè)P65蛋白相對(duì)含量

稀釋細(xì)胞懸液，接種5 mL細(xì)胞到直徑6 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，使其將密度為5×106個(gè)/孔，待細(xì)胞覆蓋孔板底部80%～90%時(shí)，加入PMA試劑（終濃度為0.1 μmol/L），放入CO2培養(yǎng)箱中使之貼壁。培養(yǎng)12 h后小心吸去上清液，以溫?zé)岬腜BS輕輕清洗細(xì)胞，棄去PBS，加入新鮮RPMI完全培養(yǎng)基，靜息24 h。

以不含血清的RPMI培養(yǎng)液稀釋黃酮類化合物母液，使其終濃度為5 μmol/L，小心吸去細(xì)胞培養(yǎng)板上清液，細(xì)胞處理同1.3.5.1節(jié)。按試劑盒說明分別收集提取細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核蛋白樣品，采用Western Blot法測(cè)定樣品中P65相對(duì)含量[29]。

1.3.6 Western Blot法檢測(cè)Nrf2、HO-1蛋白相對(duì)含量

細(xì)胞處理同1.3.5.2節(jié)，按試劑盒說明分別收集提取細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核蛋白樣品，采用Western Blot法測(cè)定蛋白中Nrf2、HO-1相對(duì)含量[29]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用SAS 8.0軟件最小顯著差法進(jìn)行多重比較，分析數(shù)據(jù)顯著性差異，P＜0.05表明差異顯著，P＜0.01表明差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮類化合物對(duì)TPH-1單核巨噬細(xì)胞的毒性作用

表 2 5μmol/L黃酮類化合物對(duì)THP-1單核巨噬細(xì)胞的毒性作用Table 2 Toxicity of 5μmol/L flavonoids on THP-1 macrophages

由表2可知，在作用濃度下，與CK組對(duì)比，5 μmol/L的黃酮類化合物對(duì)THP-1單核巨噬細(xì)胞無細(xì)胞毒性作用（P＞0.05）。Bay-11-7082是NF-κB抑制劑，其推薦使用濃度為10 μmol/L左右，因此，實(shí)驗(yàn)時(shí)，對(duì)10 μmol/L的Bay抑制劑細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，10 μmol/L的Bay抑制劑對(duì)THP-1單核巨噬細(xì)胞無細(xì)胞毒害作用。

2.2 黃酮類化合物對(duì)THP-1單核巨噬細(xì)胞炎性模型細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平的影響

TNF-α是一種細(xì)胞因子，本質(zhì)上是一種信號(hào)蛋白，參與調(diào)控機(jī)體的炎癥反應(yīng)，也是炎性反應(yīng)早起的主要細(xì)胞因子之一，主要由單核巨噬細(xì)胞受到炎性刺激后產(chǎn)生，LPS是誘導(dǎo)TNF-α產(chǎn)生的較強(qiáng)刺激劑[30]。當(dāng)THP-1被誘導(dǎo)形成單核巨噬細(xì)胞后經(jīng)LPS刺激，細(xì)胞內(nèi)TNF-α含量顯著提高，TNF-α是判斷炎性發(fā)生的重要炎癥因子之一[31]。

圖 1 4 種黃酮類化合物對(duì)LPS刺激下THP-1單核巨噬細(xì)胞中TNF-α的影響Fig. 1 TNF-α contents of THP-1 macrophages pretreated with 4 flavonoids before being stimulated with LPS

在本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過LPS刺激后，THP-1單核巨噬細(xì)胞內(nèi)TNF-αmRNA（圖1a）和上清液中TNF-α（圖1b）的含量極顯著上升（P＜0.01）。與LPS刺激組相比，木犀草素及NF-κB抑制劑Bay均可顯著降低細(xì)胞內(nèi)TNF-αmRNA和上清液中TNF-α的表達(dá)，同Bay抑制劑類似，木犀草素可通過抑制NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮抗炎活性，且5 μmol/L的木犀草素對(duì)TNF-α的抑制作用與10 μmol/L抑制劑Bay的抑制作用相當(dāng)（P＞0.05）。木犀草苷、葒草素、異葒草素均可顯著降低細(xì)胞中上清液中TNF-α的表達(dá)（圖1b）（P＜0.05，P＜0.01）。

圖 2 4 種黃酮類化合物對(duì)LPS刺激下THP-1單核巨噬細(xì)胞中IL-6的影響Fig. 2 IL-6 contents of THP-1 macrophages pretreated with 4 flavonoids before being stimulated with LPS

NF-κB信號(hào)通路激活后，NF-κB蛋白家族迅速進(jìn)入細(xì)胞核打開各種κB依賴性基因的表達(dá)，如IL-6和IL-1β，同時(shí)IL-6和IL-1β可以反饋調(diào)控NF-κB。

IL-6是一種多效性的促炎因子。如圖2所示，經(jīng)過LPS刺激后，THP-1單核巨噬細(xì)胞上清液中IL-6濃度極顯著上升（P＜0.01），木犀草素和Bay均可極顯著抑制細(xì)胞內(nèi)IL-6mRNA和上清液中IL-6的表達(dá)（P＜0.01），且木犀草素對(duì)IL-6的抑制作用與抑制劑Bay相當(dāng)（P＞0.05）。木犀草苷、葒草素、異葒草素均可極顯著降低細(xì)胞中上清液中IL-6的表達(dá)（P＜0.01）。

IL-1β是IL-1的主要成分[32]，是一種多功能的炎癥因子，主要表現(xiàn)在致炎和對(duì)組織的膠原降解的破壞作用。如圖3所示，LPS作用于THP-1單核巨噬細(xì)胞后，胞內(nèi)IL-1β濃度極顯著增高（P＜0.01）。

木犀草素及其黃酮苷對(duì)IL-1β的抑制作用較其對(duì)TNF-α和IL-6的弱，木犀草素對(duì)細(xì)胞內(nèi)IL-1βmRNA的表達(dá)具有顯著抑制作用（P＜0.05），葒草素對(duì)細(xì)胞上清液液中IL-1β表現(xiàn)出顯著抑制作用（P＜0.05）。

圖 3 4 種黃酮類化合物對(duì)LPS刺激下THP-1單核巨噬細(xì)胞中IL-1β的影響Fig. 3 IL-6 contents of THP-1 macrophages pretreated with 4 flavonoids before being stimulated with LPS

2.3 黃酮類化合物對(duì)THP-1單核巨噬細(xì)胞炎性模型P-IκBα、P-IKKβ信號(hào)通路的調(diào)控作用

圖 4 黃酮類化合物對(duì)LPS刺激下THP-1單核巨噬細(xì)胞P-IκBα、P-IKKβ的影響Fig. 4 P-IκBα and P-IKKβ contents of THP-1 macrophages pretreated with flavonoids before being stimulated with LPS

由圖4可見，陽性對(duì)照組NF-κB抑制劑Bay的預(yù)處理可以抑制IκBα和IKKβ發(fā)生磷酸化，降低P-IκBα和P-IKKβ的含量。木犀草素、木犀草苷、葒草素、異葒草素均可以下調(diào)細(xì)胞中P-IκBα和P-IKKβ的產(chǎn)生，木犀草素及其黃酮苷對(duì)于抑制IκBα和IKKβ發(fā)生磷酸化具有較好的作用。

2.4 黃酮類化合物對(duì)THP-1單核巨噬細(xì)胞炎性模型中P65調(diào)控作用

同樣通過計(jì)算相對(duì)比率分析抑制劑及黃酮類化合物對(duì)LPS刺激下THP-1單核巨噬細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中P65的影響。LPS作用30 min后，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中P65較大程度地增加（圖5）。陽性對(duì)照組NF-κB抑制劑Bay的預(yù)處理抑制了P65的生成，同時(shí)抑制了P65含量的核移位，這可以直接抑制NF-κB核轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的炎性介質(zhì)的表達(dá)。木犀草苷、葒草素和異葒草素也可以通過抑制P65入核而發(fā)揮抗炎活性。

圖 5 黃酮類化合物對(duì)LPS刺激下THP-1單核巨噬細(xì)胞核內(nèi)與胞漿中P65的影響Fig. 5 P65 contents in THP-1 macrophages pretreated with flavonoids before being stimulated with LPS

2.5 黃酮類化合物對(duì)THP-1單核巨噬細(xì)胞炎性模型中Nrf2和HO-1的調(diào)控作用

LPS刺激后，較CK組相比，細(xì)胞中總Nrf2表達(dá)量降低，細(xì)胞核中Nrf2相對(duì)含量顯著減少，而細(xì)胞質(zhì)中Nrf2相對(duì)含量顯著增多，表明LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)中，Nrf2發(fā)生核移位程度低，LPS刺激THP-1單核巨噬細(xì)胞建立的炎性細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)源Keap1-Nrf2抗氧化系統(tǒng)受到一定程度抑制。

Bay-11-7082作為NF-κB抑制劑可以顯著提高細(xì)胞中Nrf2的表達(dá)，但不能使表達(dá)的Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)抗氧化系統(tǒng)，發(fā)揮抗氧化活性。而葒草素不僅可以顯著促進(jìn)細(xì)胞中Nrf2的表達(dá)，還可以顯著促進(jìn)Nrf2發(fā)生核移位；木犀草苷、異葒草素同Bay類似，僅可促進(jìn)Nrf2的表達(dá)（P＜0.01）。

圖 6 黃酮類化合物對(duì)LPS刺激下THP-1單核巨噬細(xì)胞核內(nèi)與胞漿中Nrf2的影響Fig. 6 Nrf2 contents of THP-1 macrophages pretreated with flavonoids before being stimulated with LPS

LPS增強(qiáng)了細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，為增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性，HO-1表達(dá)增多（P＜0.01）。在作用12 h后，葒草素中HO-1表達(dá)量處于較低水平，可能是由于其通過顯著促進(jìn)細(xì)胞中Nrf2的表達(dá)，顯著促進(jìn)Nrf2發(fā)生核移位（圖6c、e），黃酮類化合物發(fā)揮了一定的抗氧化活性，細(xì)胞內(nèi)氧化水平已經(jīng)得到控制（圖7b），因而細(xì)胞內(nèi)HO-1表達(dá)處于較低水平；木犀草素、木犀草苷、異葒草素3 種黃酮類化合物對(duì)HO-1的表達(dá)具有下調(diào)作用，這可能是經(jīng)過黃酮類化合物的預(yù)處理后，抑制了IκBα和IKKβ發(fā)生磷酸化反應(yīng)，直接抑制了NE-κB信號(hào)通路，較強(qiáng)程度上抑制了細(xì)胞內(nèi)炎性反應(yīng)（圖6），細(xì)胞氧化應(yīng)激水平不高，HO-1表達(dá)量較低。

圖 7 黃酮類化合物對(duì)LPS刺激下THP-1單核巨噬細(xì)胞HO-1的影響Fig. 7 HO-1 contents of THP-1 macrophages pretreated with flavonoids before being stimulated with LPS

3 討 論

NF-κB信號(hào)通路是目前發(fā)現(xiàn)的最關(guān)鍵的抗炎信號(hào)通路之一，它是參與炎癥和先天免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)通路[33]。許多參與炎癥反應(yīng)啟動(dòng)的炎性介質(zhì)與細(xì)胞因子在轉(zhuǎn)錄水平上受到NF-κB的調(diào)控，如TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性因子。本研究發(fā)現(xiàn)木犀草素黃酮碳苷葒草素可極顯著地抑制促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β的蛋白表達(dá)，且葒草素通過抑制NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵調(diào)控蛋白上游調(diào)控器IKKβ、上游調(diào)控蛋白IκBα的活性及下游調(diào)控蛋白P65的活性發(fā)揮抗炎活性，表現(xiàn)出了更好的NF-κB信號(hào)通路抑制活性，發(fā)揮了極強(qiáng)的抗炎活性。

Nrf2是細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子，正常狀態(tài)下，Nrf2與Keap1呈結(jié)合形式，存在于細(xì)胞漿中，處于穩(wěn)定狀態(tài)，細(xì)胞核內(nèi)Nrf2處于較低水平[34]。在氧化應(yīng)激條件下，Nrf2與Keap1解離轉(zhuǎn)譯，大量的Nrf2迅速發(fā)生核移位，并激活多種抗氧化酶如HO-1等表達(dá)。激活的HO-1能夠催化血紅素分解釋放出膽綠素，膽綠素在膽綠素還原酶作用下進(jìn)一步降解為具有強(qiáng)大抗氧化能力的膽紅素[35]。HO-1在氧化應(yīng)激水平增高時(shí)表達(dá)則明顯增高，迅速對(duì)沉積的血紅素做出反應(yīng)，催化血紅素代謝產(chǎn)生膽綠素，通過抗氧化活性的調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化/抗氧化的平衡[36]。實(shí)驗(yàn)中葒草素使細(xì)胞處于較低水平的氧化應(yīng)激水平，發(fā)現(xiàn)其主要通過可以顯著促進(jìn)細(xì)胞中Nrf2的表達(dá)，顯著促進(jìn)Nrf2發(fā)生核移位，發(fā)揮了較強(qiáng)的抗氧化活性。

具有IKKβ抑制活性可能是葒草素同時(shí)發(fā)揮抗炎、抗氧化活性的基礎(chǔ)。IKKβ可與抗氧化信號(hào)通路Keap1-Nrf2中Keap1蛋白通過一段保守基序直接結(jié)合，抑制IKKβ或IKK復(fù)合體的活性，降低其對(duì)IκB的激活活性，這種Keap1介導(dǎo)IKKβ泛素化并降解的反應(yīng)只發(fā)生在高等哺乳動(dòng)物中[37]。在Keap1敲除的人巨噬細(xì)胞中，IKK復(fù)合體和NF-κB家族的總量及磷酸化程度均顯著升高，NF-κB信號(hào)通路活化程度升高[38]，證明IKKβ的存在與Keap1蛋白結(jié)合可抑制NF-κB信號(hào)通路的活化。類似地，本研究中葒草素通過抑制IKKβ上游調(diào)節(jié)器抑制NF-κB信號(hào)通路，發(fā)揮了抗炎活性，進(jìn)一步地實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，葒草素促進(jìn)Nrf2表達(dá)及核移位，使細(xì)胞中HO-1處于較低水平，發(fā)揮了一定的抗氧化活性。即IKKβ作為葒草素抑制NF-κB信號(hào)通路并激活Nrf2的交叉靶點(diǎn)發(fā)揮了抗炎/抗氧化雙重生物活性。

此外，葒草素是以木犀草素為黃酮苷元母核，在C8位形成的黃酮碳苷，研究發(fā)現(xiàn)相同濃度下，葒草素在發(fā)揮抗炎活性和抗氧化活性時(shí)，其活性強(qiáng)于木犀草素，較木犀草素表現(xiàn)出更高的生物利用度。有研究表明II相代謝酶中的葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶引起的首過效應(yīng)是黃酮類化合物生物利用度低的重要原因[39]。木犀草素在體內(nèi)易被代謝稱為葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物，而被排出細(xì)胞而無法發(fā)揮藥理作用[40]。李燁[41]的研究也發(fā)現(xiàn)，在人、大鼠肝微粒體反應(yīng)體系中，木犀草素的葡萄糖醛酸代謝代謝速率均高于葒草素。這可能是相同濃度下，葒草素較木犀草素發(fā)揮了更強(qiáng)抗炎、抗氧化活性的原因。

4 結(jié) 論

木犀草素及其黃酮苷具有較好的抗炎活性，其中黃酮碳苷葒草素可以通過抑制NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵調(diào)控蛋白上游調(diào)控器P-IKKβ、上游調(diào)控蛋白IκBα的活性及下游調(diào)控蛋白P65的活性，下調(diào)細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β，發(fā)揮較強(qiáng)的抗炎活性；同時(shí)葒草素通過促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和核移位發(fā)揮較好的抗氧化活性，IKKβ可能是葒草素抑制NF-κB信號(hào)通路并激活Nrf2發(fā)揮抗炎/抗氧化雙重生物活性的交叉靶點(diǎn)；葒草素較木犀草素發(fā)揮了更強(qiáng)的抗炎、抗氧化活性，原因可能是其較木犀草素具有更低的代謝速率和更高的生物利用度。