蘇天霞，袁敏蘭，周 艷，孫曉紅，張清海

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

隨著居民膳食結(jié)構(gòu)中高熱量食物的比例不斷增加，以及日?；顒?dòng)趨于靜態(tài)化，導(dǎo)致超重和肥胖的發(fā)病率逐年上升[1]，且呈現(xiàn)出年輕化、不可控的趨勢(shì)[2]。據(jù)報(bào)道，長(zhǎng)期的高脂膳食（high fat diet，HFD）會(huì)導(dǎo)致能量的攝入和消耗不平衡，多余的能量轉(zhuǎn)變?yōu)橹緝?chǔ)存在體內(nèi)，最終導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生肥胖和脂代謝紊亂[3]，繼而大大增加心血管疾病、高脂血癥、2型糖尿病等多種慢性代謝性疾病的發(fā)病率，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[4]。因此，研究如何有效預(yù)防和改善脂代謝紊亂的方法受到全社會(huì)的關(guān)注。當(dāng)前預(yù)防肥胖、調(diào)節(jié)脂代謝紊亂的方法存在安全性低、療效不佳等問(wèn)題[5-6]。故從天然產(chǎn)物中開(kāi)發(fā)安全、高效的藥物已成為研究的焦點(diǎn)。植物多酚是自然界最常見(jiàn)的一大類植物活性物質(zhì)，因其安全性高，且具有抗氧化、抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)糖脂代謝等多種生物活性而頗受關(guān)注[7-9]。

大量研究報(bào)道，多種植物多酚在預(yù)防和調(diào)節(jié)脂代謝紊亂過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Fernando等[10]研究證實(shí)蔓越莓多酚具有改善肥胖小鼠的糖脂代謝、緩解肝脂肪變性的作用；Kim等[11]以1 g/kgmb的劑量灌胃小鼠匙羹藤多酚4 周，發(fā)現(xiàn)小鼠的體質(zhì)量以及血清中甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平與高脂組比顯著降低，腹部脂肪含量顯著下降；Nilanjan等[12]研究發(fā)現(xiàn)辣木種子多酚提取物能夠消耗高脂膳食小鼠體內(nèi)多余的能量，維持能量代謝平衡，從而改善肝脂代謝紊亂，預(yù)防肥胖的發(fā)生。但是植物酚類化合物的組成和含量因其種類、產(chǎn)地、部位等不同存在較大差異[13-14]，而目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于獼猴桃皮多酚的研究大多集中在對(duì)多酚的提取、成分分析、體外抗氧化等方面[15-16]，基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探索獼猴桃皮多酚的功能報(bào)道較少，這在一定程度上影響了獼猴桃皮多酚的開(kāi)發(fā)利用。因此，本實(shí)驗(yàn)以SD大鼠為研究對(duì)象，探索獼猴桃皮多酚對(duì)高脂膳食大鼠脂代謝的影響及可能的作用機(jī)制，為獼猴桃皮多酚是否可作為調(diào)節(jié)脂代謝紊亂的功能因子提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SPF級(jí)雄性健康SD大鼠，體質(zhì)量（160.00±15.46）g，生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK（黔）2018-0001，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠基礎(chǔ)飼料購(gòu)于貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，高脂飼料含80%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）基礎(chǔ)飼料、9.5%豬油、0.5%膽固醇、10%蛋黃粉[17]。

TG、TC、LDL-C、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、游離脂肪酸（free fatty acids，F(xiàn)FA）、蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色試劑盒 南京建成生物工程研究所；動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒（TRIzol試劑） 江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司；去基因組反轉(zhuǎn)錄試劑盒、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒 上海索萊寶生物公司；其他試劑均為分析純；引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表 1 PCR引物設(shè)計(jì)序列Table 1 Primer sequences used for PCR

獼猴桃皮多酚提取物實(shí)驗(yàn)室自制（獼猴桃皮原料由貴州修文三圣金果公司提供），獼猴桃皮經(jīng)過(guò)烘干、粉碎后，采用實(shí)驗(yàn)室前期優(yōu)化的提取方法提取獼猴桃皮多酚[18]，提取條件為：甲醇體積分?jǐn)?shù)為60%、料液比1∶30、超聲提取時(shí)間20 min、溫度60 ℃、功率450 W，提取完成后進(jìn)行過(guò)濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，最終凍干得到獼猴桃皮多酚的提取物，經(jīng)Folin-Ciocalteu法檢測(cè)獼猴桃皮多酚提取物中多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65.4%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)獼猴桃皮多酚提取物配制成總酚質(zhì)量濃度為10 mg/mL溶液，通過(guò)高效液相色譜法測(cè)得獼猴桃皮中含7 種多酚物質(zhì)（單位為mg/mL），分別為原兒茶酸6.45、表兒茶素1.60、七葉亭0.53、沒(méi)食子酸0.086、綠原酸0.082、對(duì)-香豆酸0.074、兒茶素0.068。

1.2 儀器與設(shè)備

ABIViiA7熒光定量PCR儀 美國(guó)ABI公司；MK-3酶標(biāo)儀、冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司；721可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；超聲清洗器 江蘇昆山美美超聲儀器有限公司；數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器公司；光學(xué)顯微鏡 日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物飼養(yǎng)及分組

將40 只SPF級(jí)雄性SD大鼠用正常飼料預(yù)飼喂1 周后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為5 組，每組8 只：正常組（NC組）、高脂組（HF組）和獼猴桃皮多酚低（50 mg/（kgmb·d），LKP組）、中（75 mg/（kgmb·d），MKP組）、高（100 mg/（kgmb·d），HKP組）劑量干預(yù)組。正常組飼喂普通飼料，其余4 組飼喂高脂飼料。連續(xù)灌胃9 周，每日一次，獼猴桃皮多酚干預(yù)組按照相應(yīng)的濃度進(jìn)行灌胃，NC組、HF組灌一定體積蒸餾水。

飼養(yǎng)條件：實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房，同室分籠，每組3 籠，每籠3～4 只，環(huán)境溫度控制在（23±2）℃，相對(duì)濕度55%～58%，12 h/12 h晝夜循環(huán)光照，保持飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生。實(shí)驗(yàn)期間所有動(dòng)物均自由攝食和飲水，每周同一時(shí)間稱量并記錄體質(zhì)量。

1.3.2 樣本的采集及處理

9 周后實(shí)驗(yàn)結(jié)束、大鼠宰殺前禁食12 h，稱體質(zhì)量，用10%水合氯醛給大鼠進(jìn)行麻醉，麻醉狀態(tài)心臟取血入非抗凝管中，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上層血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?。立即解剖大鼠，在冰浴上迅速取肝、?nèi)臟脂肪，包括腸系膜、腹周、睪周、腎周脂肪，精確稱質(zhì)量并記錄，肝臟用冷生理鹽水洗滌，洗凈血水，去掉筋膜血管等附著物，用濾紙拭干，稱質(zhì)量。取100 mg左右肝臟組織置于TRIzol試劑中，剪碎，-80 ℃保存，用于總RNA的提??；取部分肝組織浸入10%中性多聚甲醛溶液中固定，4 ℃保存?zhèn)溆?。剩余肝組織液氮冷凍后，-80 ℃保存。

1.3.3 大鼠生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定

1.3.4 血生化水平的測(cè)定

采用試劑盒法測(cè)定血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、FFA的濃度，具體方法按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.5 肝臟指標(biāo)的測(cè)定

1.3.5.1 肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察

HE染色：甲醛固定超過(guò)24 h以上的肝臟組織進(jìn)行乙醇梯度脫水，二甲苯透明，浸入石蠟包埋，預(yù)冷后切片（厚度5 μm）[19]。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)將切片進(jìn)行HE染色，滴少許中性樹(shù)膠封片，自然通風(fēng)晾干，收集并進(jìn)行鏡檢（400×），觀察肝臟組織形態(tài)變化。

1.3.5.2 肝臟脂代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)量測(cè)定

TRIzol法提取肝臟中的總RNA，加入適量DEPC水稀釋，通過(guò)測(cè)定溶液A260nm/A280nm確定所得RNA的純度，比值在1.8～2.0時(shí)用于下一步實(shí)驗(yàn)。嚴(yán)格按照去基因組反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，消除提取產(chǎn)物中的基因組DNA，并將RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA。

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)在冰上配制10 μL反應(yīng)體系。該體系包含熒光染料TB Green Premix ExTaqII（2×）5 μL，正向及反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA溶液1 μL，滅菌水3 μL。設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，使用ABIViiA7熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件參考童鑫等的方法[20]，并有所改動(dòng)，收集熒光信號(hào)時(shí)，退火溫度為58 ℃。擴(kuò)增條件如下：預(yù)變性95 ℃、3 min；95 ℃、15 s，58 ℃、30 s（收集熒光信號(hào)），40 個(gè)循環(huán)。熔解曲線分析：溫度65～95 ℃，每30 s讀1 次。以β-actin為內(nèi)參基因，mRNA相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組間差異性比較采用單因素方差分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05有顯著性意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃皮多酚對(duì)大鼠生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

圖 1 獼猴桃皮多酚對(duì)大鼠生長(zhǎng)指標(biāo)的影響Fig. 1 Effect of kiwifruit peel polyphenols on growth indexes in rats

由圖1A可知，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，各組大鼠的初始體質(zhì)量均為（207±12）g，組間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠體質(zhì)量逐漸增加。第9周時(shí)，HF組大鼠的體質(zhì)量為（524.50±28.70）g，與NC組相比具有顯著差異性（P＜0.05）；獼猴桃皮多酚干預(yù)后，MKP和HKP大鼠的體質(zhì)量與HF組相比顯著下降（P＜0.05），與NC組無(wú)顯著差異性（P＞0.05），說(shuō)明獼猴桃皮多酚的干預(yù)可以緩解高脂膳食引起的體質(zhì)量增加（圖1B）。如圖1C所示，對(duì)各組大鼠腸系膜脂肪、腹部脂肪、睪腎周脂肪質(zhì)量進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組腹部脂肪質(zhì)量之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；HF組腸系膜脂肪、睪腎周脂肪質(zhì)量顯著高于NC、MKP、HKP組（P＜0.05）。如圖1D、E所示，對(duì)不同組間脂肪指數(shù)、肝指數(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)HF組脂肪指數(shù)、肝指數(shù)顯著高于NC組（P＜0.05）；與HF組相比，干預(yù)組的肝指數(shù)以及MKP、HKP組脂肪指數(shù)顯著下降（P＜0.05），并且存在劑量效應(yīng)關(guān)系。說(shuō)明獼猴桃皮多酚能有效緩解高脂膳食引起的大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、脂肪質(zhì)量增加。

2.2 獼猴桃皮多酚對(duì)大鼠血生化水平的影響

表 2 獼猴桃皮多酚對(duì)大鼠血生化指標(biāo)的影響Table 2 Effect of kiwifruit peel polyphenols on blood biochemical parameters in rats

由表2可知，與NC組相比，HF組大鼠血清TG、TC、LDL-C、FFA水平顯著升高（P＜0.05），HDL-C水平顯著下降（P＜0.05），說(shuō)明高脂膳食會(huì)導(dǎo)致大鼠血脂異常。與HF組相比，3 個(gè)干預(yù)組的TG、LDL-C水平顯著降低（P＜0.05）；MKP、HKP組的TC、FFA水平顯著降低（P＜0.05），HDL-C水平顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果表明，獼猴桃皮多酚可正向調(diào)節(jié)高脂喂養(yǎng)導(dǎo)致的脂代謝異常，其中HKP組的調(diào)節(jié)效果最好。

2.3 獼猴桃皮多酚對(duì)大鼠肝組織形態(tài)以及脂代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的影響

2.3.1 獼猴桃皮多酚對(duì)大鼠肝組織形態(tài)的影響

由圖2可見(jiàn)，與NC組相比，HF組大鼠肝臟出現(xiàn)嚴(yán)重的脂質(zhì)蓄積現(xiàn)象，呈現(xiàn)彌漫性脂肪變性，肝索紊亂，肝細(xì)胞腫脹，內(nèi)含數(shù)量、大小不一的脂肪空泡；經(jīng)過(guò)獼猴桃皮多酚的干預(yù)，LKP、MKP組肝脂質(zhì)蓄積現(xiàn)象、細(xì)胞腫脹的程度、脂肪空泡的數(shù)量較HF組得到明顯的改善；NC組、HKP組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)趨于一致，結(jié)構(gòu)清晰完整、排列緊密，細(xì)胞內(nèi)偶見(jiàn)少量脂肪空泡。

圖 2 肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察、HE染色結(jié)果（400×）Fig. 2 Hepatic histomorpholgical observation (400 ×)

2.3.2 獼猴桃皮多酚對(duì)大鼠脂代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的影響

圖 3 獼猴桃皮多酚對(duì)大鼠肝臟脂代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的影響Fig. 3 Effect of kiwifruit peel polyphenols on the mRNA expression of lipid metabolism related gene in liver of rats

如圖3所示，與NC組相比，HF組大鼠肝臟脂肪合成相關(guān)基因ACC、FASmRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），脂肪氧化分解相關(guān)的基因CPT-1、PPAR-αmRNA表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）。經(jīng)過(guò)獼猴桃皮多酚干預(yù)后，與HF組相比，LKP、MKP、HKP組大鼠肝臟脂肪合成基因ACC、FASmRNA表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）；而與脂肪分解相關(guān)的CPT-1mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），M K P、H K P 組的P PA R-αm R NA 的表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）；結(jié)果表明獼猴桃皮多酚能夠通過(guò)調(diào)控與脂肪合成和脂肪氧化分解相關(guān)的基因來(lái)改善高脂膳食導(dǎo)致的脂代謝紊亂，且在一定劑量范圍內(nèi)，與獼猴桃皮多酚的攝入量呈正相關(guān)。

3 討 論

獼猴桃是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富、具有獨(dú)特風(fēng)味的水果，深受世界人民喜愛(ài)。近年來(lái)，我國(guó)獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，種植面積和年產(chǎn)量均居世界第一[21]。但在獼猴桃產(chǎn)業(yè)飛速發(fā)展的同時(shí)也存在原料浪費(fèi)嚴(yán)重現(xiàn)象，如獼猴桃皮這一主要加工副產(chǎn)物約占獼猴桃原料質(zhì)量的30%，富含多種營(yíng)養(yǎng)成分，具有很大的開(kāi)發(fā)價(jià)值；但目前未得到充分利用，主要作為廢渣處理，這不僅浪費(fèi)資源，還給環(huán)境增加負(fù)荷[22]。因此，開(kāi)發(fā)相關(guān)的高附加值產(chǎn)品是一個(gè)急需解決的問(wèn)題。

本研究顯示，獼猴桃皮多酚的干預(yù)能夠抑制高脂膳食大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、腸系膜脂肪、睪腎周脂肪質(zhì)量的增加，且存在劑量反應(yīng)關(guān)系，HKP組高脂膳食大鼠體質(zhì)量、腸系膜脂肪、睪腎周脂肪質(zhì)量的降低效果最顯著。而劉清清[23]利用與獼猴桃皮同源的獼猴桃籽多酚提取物對(duì)高脂大鼠進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果也顯示，獼猴桃籽多酚提取物可顯著降低大鼠體質(zhì)量，且存在劑量反應(yīng)關(guān)系。長(zhǎng)期的高脂膳食是脂質(zhì)代謝紊亂最主要的原因，最直觀的表現(xiàn)就是血脂異常，肝臟作為脂質(zhì)代謝的主要場(chǎng)所，在脂質(zhì)的吸收、合成、分解和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中發(fā)揮十分重要的作用[24]。一般來(lái)說(shuō)，血脂的變化常常預(yù)示著肝臟脂肪合成和分解的變化。已有研究表明植物多酚可顯著改善機(jī)體的血脂水平，抑制肝臟脂肪的積累[25]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)獼猴桃皮多酚的干預(yù)可顯著改善因HFD造成的肝臟脂肪空泡增多，肝脂過(guò)度蓄積的現(xiàn)象；同時(shí)顯著降低高脂大鼠血清TG、TC、LDL-C、FFA水平，顯著提高血清HDL-C水平；且隨著獼猴桃皮多酚灌胃劑量的增加，其改善肝脂蓄積的效果越明顯，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用越強(qiáng)。

植物多酚可通過(guò)調(diào)控脂代謝合成和分解相關(guān)基因，改善肝脂代謝紊亂[26]。Huang Kang等[27]用高脂飼料喂養(yǎng)雄性SD大鼠，并用高、低兩種劑量的綠原酸對(duì)其進(jìn)行灌胃，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明綠原酸能有效降低FAS、ACC表達(dá)，抑制肝臟脂肪的合成；同時(shí)還可上調(diào)CPT-1的表達(dá)，促進(jìn)脂肪酸氧化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)獼猴桃皮多酚的干預(yù)，同樣可顯著下調(diào)高脂大鼠肝臟脂肪合成相關(guān)基（ACC、FAS）的表達(dá)；顯著上調(diào)脂肪分解相關(guān)基因（PPAR-α、CPT-1）的表達(dá)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)脂代謝紊亂的正向調(diào)控。ACC是脂肪酸合成限速酶，在調(diào)節(jié)能量代謝和控制肥胖發(fā)展方面起著重要的作用，其催化脂肪酸合成的第一步反應(yīng)，即乙酰輔酶A羧合成丙二酰輔酶A[28]；FAS是ACC下游的另一個(gè)脂肪酸合成限速酶，在脂肪酸合成中起到關(guān)鍵的作用，機(jī)體脂肪沉積所需的脂肪酸大多是由FAS催化乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A轉(zhuǎn)變而成，其在肝臟組織中的表達(dá)較高[29]。本研究中ACC和FAS的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，說(shuō)明獼猴桃皮多酚可以下調(diào)脂肪合成相關(guān)基因，在轉(zhuǎn)錄水平上抑制肝臟脂肪的合成，進(jìn)而抑制血脂的升高。PPAR-α是過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated receptors，PPARs）中的一個(gè)亞型，在肝臟的脂質(zhì)代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用，它能夠調(diào)控許多線粒體脂肪酸氧化相關(guān)酶的表達(dá)，刺激脂肪酸β氧化，從而改善脂代謝紊亂狀況，維持脂質(zhì)代謝平衡[30]。CPT-1是脂肪酸氧化的限速酶，其表達(dá)直接受到PPAR-α的調(diào)控；它可使長(zhǎng)鏈的乙酰輔酶A進(jìn)入線粒體基質(zhì)內(nèi)，參與三羧酸循環(huán)，促進(jìn)脂肪酸β氧化[31]。獼猴桃皮多酚通過(guò)上調(diào)PPAR-α和CPT-1的表達(dá)，在轉(zhuǎn)錄水平刺激β氧化，降低脂肪酸的水平，抑制TG合成；同時(shí)PPAR-α還可催化TG水解為游離脂肪酸FFA和單酰甘油，提高血清中HDL-C的濃度[32]。

綜上所述，本研究從動(dòng)物水平證明了獼猴桃皮多酚具有預(yù)防肥胖、改善脂代謝紊亂的作用，其作用機(jī)制與抑制生脂基因的表達(dá)，促進(jìn)脂質(zhì)分解基因的表達(dá)有關(guān)。提示獼猴桃皮多酚可作為預(yù)防肥胖、調(diào)節(jié)脂代謝紊亂的功能因子，為指導(dǎo)獼猴桃皮的精深加工利用提供了新的思路。結(jié)果對(duì)于脂代謝紊亂的預(yù)防和控制具有非常重要的研究?jī)r(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。