刁靜靜，劉妍兵，李朝陽，于 笛，左 鋒,*，張麗萍

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學 國家雜糧工程技術研究中心，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)加工品質量監(jiān)督檢驗測試中心，黑龍江 大慶 163319；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319）

綠豆（Vigna radiata(L.) Wilczek）具有清熱、解毒、降膽固醇等功效，是我國最受消費者喜愛的食用豆之一。綠豆含有約20%～25%的蛋白質，其必需氨基酸組成與大豆、蕓豆和糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織的參考蛋白質相比優(yōu)勢明顯[1]。但是，我國對于綠豆工業(yè)化加工利用多是制取淀粉，而其副產(chǎn)物綠豆蛋白則多作為飼料或低值化產(chǎn)品進行處理，造成了優(yōu)質資源的浪費。近20 年來的研究發(fā)現(xiàn)，從食源性蛋白質中獲得的多肽具有較為廣泛的生物活性功能，如抗氧化、降血壓、降膽固醇、提高機體免疫力等[2-3]，且食源性蛋白肽還不會對機體產(chǎn)生毒副作用，安全性高，逐漸引起國內外營養(yǎng)專家學者的關注[4]。研究發(fā)現(xiàn)綠豆蛋白經(jīng)生物酶法處理后，其酶解產(chǎn)物可提高機體的缺氧耐受力和免疫力、血管緊張素轉換酶抑制活性、降膽固醇等作用[5-6]，但是，國內關于綠豆肽（mung bean protein hydrolysate，MBPH）抗炎作用的研究鮮有報道。已有研究顯示，大豆、豌豆、羽扇豆等的蛋白水解產(chǎn)物具有抑制炎癥的潛力。Vernaza等發(fā)現(xiàn)利用大豆水解物能夠顯著降低脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的巨噬細胞RAW264.7中炎性標志物，如NO、誘導型一氧化氮合酶和前列腺素E2含量[7]。Millan-Linares等發(fā)現(xiàn)羽扇豆的蛋白質水解產(chǎn)物可以減弱THP-1巨噬細胞中促炎性細胞因子白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和NO的產(chǎn)生[8]。Ndiaye等發(fā)現(xiàn)豌豆水解物可通過抑制活化的巨噬細胞中NO、TNF-α和IL-6的產(chǎn)生發(fā)揮其抗炎作用[9]。急性肺損傷是肺部炎癥疾病的一種典型代表，很多因素都會導致這種疾病的發(fā)生，而臨床上多數(shù)是靠藥物來緩解病情，尚無特效藥和特效療法，如果單靠藥物在發(fā)病后再去治療勢必會對機體造成不良影響。許多研究探討了綠豆肽的多種生物活性，但對于綠豆肽對細菌內毒素誘導的急性肺損傷的保護作用知之甚少。因此，本實驗構建LPS誘導的急性肺損傷小鼠模型，研究綠豆肽對急性肺損傷小鼠的保護作用，以期明確綠豆肽是否具有極好的抗炎作用和效果，為綠豆功能性成分的開發(fā)和研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級C57 BL/6雄性小鼠72 只，6 周齡，體質量18～22 g，購自北京維通利華實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0011。

綠豆蛋白粉 山東招遠溫記食品有限公司；Alcalase 2.4 L 丹麥諾維信公司；IL-1β、IL-6、IL-10、干擾素γ（interferon γ，IFN-γ）等細胞因子酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 沈陽萬類生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

細胞培養(yǎng)箱 上海璽恒實業(yè)有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州榮冠實驗分析儀器廠；超凈工作臺 鄭州宏朗儀器設備有限公司；低速離心機 張家港市凱迪機械有限公司；高速冷凍離心機 北京時代北利離心機有限公司；電子顯微鏡 深圳市博視達光學儀器有限公司；ELX-800酶標儀 美國Bio-Tek儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 綠豆肽的制備

綠豆肽實驗室自制。將綠豆蛋白粉（蛋白質量分數(shù)80%）配制成底物質量分數(shù)為7%的溶液，用1 mol/L的NaOH溶液調pH值至9.0，加入1.0%（以底物質量計）Alcalase 2.4 L后于50 ℃水浴攪拌，用1 mol/L的NaOH溶液使pH值保持恒定，采用pH-stat法[6]測定水解度達到30%時終止酶解反應，調pH值至7.0，并邊攪拌邊迅速升溫至100 ℃滅酶10 min，獲得綠豆肽，然后經(jīng)脫鹽處理后凍干備用。采用反相高效液相色譜法測定得到95%以上的綠豆肽分子質量在1 000 Da以下。

1.3.2 動物實驗

72 只小鼠隨機分為6 組，分別為對照組、模型組（5 mg/kgmbLPS）以及MBPH低、中、高劑量組（MBPH劑量按照市售食源性蛋白多肽平均推薦劑量（按體質量60 kg的成人計）3.0 g/d（相當于0.05 g/（kgmb·d））的2.5、5 倍和10 倍設置，分別為125 mg/（kgmb·d）（MBPH-L組）、250 mg/（kgmb·d）（MBPH-M組） 和5 0 0 m g / （ k gmb· d ） （ M B P H - H組））、地塞米松（d e x a m e t h a s o n e，D E X）組（5 mg/（kgmb·d）DEX），每組12 只。各實驗組均連續(xù)灌胃給藥10 d，MBPH組灌胃給予小鼠低、中、高劑量綠豆肽，其他處理組灌胃相同體積的生理鹽水。第11天，造模前1 h，DEX組經(jīng)腹腔注射地塞米松磷酸鈉，其他組注射相同體積的生理鹽水，1 h后，經(jīng)腹腔注射10%的戊巴比妥鈉溶液（60 mg/kgmb）將小鼠麻醉，對照組鼻腔滴入100 μL生理鹽水，其余組鼻腔滴入100 μL質量濃度為5 mg/mL的LPS。造模5 h將小鼠斷頸處死，分別測定各處理組的炎癥反應指標。

1.3.3 肺組織病理學切片形態(tài)觀察

隨機選取1.3.2節(jié)對照組、模型組、處理組中的小鼠進行肺組織蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，觀察小鼠在經(jīng)LPS處理后肺組織炎性反應情況。

1.3.4 肺臟濕干質量比的測定

取小鼠肺臟用濾紙吸干表面水分和血液，稱量得到肺臟濕質量。80 ℃恒溫箱中干燥48 h，再次稱量得到肺臟干質量。肺臟濕質量與干質量比即為濕干質量比（wet dry ratio，W/D），能夠初步評估肺臟組織水腫程度。

1.3.5 肺泡灌洗液的制備

隨機選取1.3.2節(jié)各處理組小鼠，打開胸腔，分離氣管，將自制插管插入氣管中并固定，向肺部注入4 ℃預冷的磷酸鹽緩沖液，分3 次進行，每次0.5 mL，抽出的液體收集于1.5 mL離心管中。將肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）經(jīng)4 ℃、3 000 r/min離心10 min，收集上清液，存放于-20 ℃冰箱中。

1.3.6 細胞計數(shù)

采用Wright-Giemsa法進行染色，取適量肺泡細胞懸液平鋪于載玻片，室溫干燥。滴加2～3 滴Wright-Giemsa染色液使其覆蓋整個涂片。2 min后，向涂片中滴加等量的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.4～6.8），輕輕搖動，使其與Wright-Giemsa染色液充分混勻，繼續(xù)染色5 min。用流水緩慢沖洗涂片，晾干后鏡檢，每片至少計數(shù)200 個細胞。

1.3.7 BALF中細胞因子質量濃度的測定

取1.3.5節(jié)BALF上清液，采用ELISA法檢測BALF中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-10的質量濃度。

1.3.8 BALF中白蛋白質量濃度的測定

取1.3.5節(jié)BALF上清液，采用BCA法檢測BALF中白蛋白質量濃度。

1.3.9 髓過氧化物酶活力測定

準確稱取各處理組小鼠肺組織勻漿，采用ELISA試劑盒進行髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活力的測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所得數(shù)據(jù)均為3 次重復的平均值，用方差分析多參數(shù)檢驗方法進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05或P＜0.01為差異有統(tǒng)計學意義。并采用SigmaPlot 12.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 綠豆肽對急性肺損傷小鼠肺組織病理學切片形態(tài)的影響

肺組織的病理學可以反映LPS誘導小鼠急性肺損傷的嚴重程度[10-11]。由圖1可知，經(jīng)過HE染色后可以觀察到對照組小鼠肺組織結構正常，肺泡壁完好，肺泡腔清晰可見，肺泡及肺間質無明顯水腫現(xiàn)象，未觀察到炎性細胞浸潤。與對照組相比，模型組小鼠在鼻腔吸入LPS 5 h之后肺組織出現(xiàn)病理學變化，肺泡結構破壞、肺泡壁水腫、肺間質增厚、大量炎性細胞浸潤。與模型組相比，MBPH低劑量組炎癥程度有所減輕，但效果不明顯；MBPH中、高劑量組肺泡結構較為完整，肺間質滲出減少，炎性細胞浸潤程度明顯減輕。結果表明，MBPH對LPS誘導的急性肺損傷具有一定的保護作用，且隨著MBPH劑量的增加其恢復效果越好。

圖 1 綠豆肽作用下的急性肺損傷小鼠病理學變化（×200）Fig. 1 Effect of MBPH on pathological changes of mice with ALI (× 200)

2.2 綠豆肽對急性肺損傷小鼠肺組織W/D的影響

圖 2 綠豆肽作用下的急性肺損傷小鼠肺W/D變化Fig. 2 Effect of MBPH on lung W/D weight ratio in mice with ALI

由圖2可知，與對照組相比，模型組小鼠的W/D極顯著增加（P＜0.01）。與模型組相比，通過灌胃不同劑量的MBPH溶液，小鼠的W/D呈劑量依賴性顯著降低，且高劑量效果最佳。結果表明，通過預先灌胃中、高濃度的MBPH能顯著減輕急性肺損傷造成的肺水腫，說明綠豆肽對小鼠肺組織具有一定的保護作用。

2.3 綠豆肽對急性肺損傷小鼠肺組織MPO活力的影響

由圖3可知，與對照組相比，模型組肺組織中MPO活力極顯著增加（P＜0.01）。與模型組相比，MBPH組小鼠肺組織中MPO活力顯著下降（P＜0.05，P＜0.01），并且隨著MBPH濃度的升高，MPO活力呈劑量依賴性降低。結果表明，MBPH對LPS誘導引起的小鼠肺組織MPO活力升高具有抑制作用，說明綠豆肽可減輕肺組織中中性粒細胞的聚集。

圖 3 綠豆肽作用下的急性肺損傷小鼠肺組織中MPO活力變化Fig. 3 Effect of MBPH on MPO activity in lung tissue of ALI mice

2.4 綠豆肽對急性肺損傷小鼠BALF中細胞因子的影響

圖 4 綠豆肽作用下的急性肺損傷小鼠BALF中細胞因子質量濃度變化Fig. 4 Effect of MBPH on cytokine concentrations in BALF of ALI mice

由圖4可知，模型組的TNF-α、IL-1β、IL-6、I L-1 0 和I F N-γ 的質量濃度均顯著高于對照組（P＜0.05），MBPH處理則顯著改善模型組炎癥細胞因子和IL-10的表達，且呈劑量依賴性。不同劑量的MBPH均能降低小鼠BALF中TNF-α、IL-1β和IFN-γ的質量濃度，但是中、高劑量組的IL-1β和IFN-γ效果沒有顯著性差異。高劑量MBPH處理能顯著降低小鼠BALF中IL-6質量濃度。IL-10是多功能抗炎性細胞因子，能夠抑制多種炎癥介質的生成從而減輕炎癥損傷程度。不同劑量的MBPH處理均能下調BALF中IL-10的水平，但是隨著MBPH劑量的升高，降低作用并不明顯，且高劑量組的IL-10水平顯著高于DEX組，這說明MBPH既可降低LPS誘導的炎癥反應，又可改善機體的免疫狀態(tài)。以上研究結果均表明綠豆肽可通過調節(jié)促炎因子和抗炎因子的表達改善肺組織的炎癥反應。也就是說MBPH對急性肺損傷小鼠具有一定的保護作用。

2.5 綠豆肽對急性肺損傷小鼠BALF中蛋白質量濃度的影響

由圖5可知，模型組BALF中白蛋白質量濃度極顯著高于對照組（P＜0.01），說明模型組小鼠肺泡組織受損[12]，這與HE染色結果一致。與模型組相比，MBPH組蛋白質量濃度顯著下降（P＜0.05），且呈量效關系。結果表明，MBPH能顯著緩解LPS誘導引起的BALF中白蛋白質量濃度的升高。

圖 5 綠豆肽作用下的急性肺損傷小鼠BALF中蛋白質量濃度變化Fig. 5 Effect of MBPH on BALF protein concentration in ALI mice

2.6 綠豆肽對急性肺損傷小鼠BALF中中性粒細胞數(shù)目的影響

圖 6 綠豆肽作用下的急性肺損傷小鼠BALF中中性粒細胞數(shù)目變化Fig. 6 Effect of MBPH on number of neutrophils in BALF of ALI mice

由圖6可知，模型組中性粒細胞數(shù)目顯著高于對照組（P＜0.05）。與模型組相比，MBPH組中性粒細胞數(shù)目顯著下降（P＜0.05），且呈量效關系。結果表明，MBPH能顯著緩解LPS誘導引起的BALF中中性粒細胞數(shù)目的升高。

3 討 論

肺部在細菌感染時，肺循環(huán)毛細血管中的中性粒細胞會滲出到肺內[13-15]，在感染部位表達多種細胞毒性產(chǎn)物，包括MPO以及IL-1β、TNF-α等促炎細胞因子[16-17]，從而導致彌漫性肺間質及肺泡水腫，最終導致急性呼吸功能障礙[18-19]。本研究采用鼻腔滴注LPS建立急性肺損傷小鼠模型，探討MBPH對LPS誘導急性肺損傷小鼠的保護作用。研究結果表明LPS的刺激顯著增加了急性肺損傷小鼠BALF中中性粒細胞數(shù)目，同時增強了MPO活力，肺泡結構破壞、肺間質增厚、大量炎性細胞浸潤，促炎細胞因子顯著表達，這說明LPS可刺激小鼠發(fā)生肺實質損傷，這是由于中性粒細胞的活化會促使機體氧自由基和顆粒酶的過量產(chǎn)生，以及促炎細胞因子的產(chǎn)生[20-21]，從而促進感染部位細胞毒產(chǎn)物的表達。而經(jīng)過灌胃MBPH的小鼠情況發(fā)生了逆轉，表明MBPH可有效緩解

LPS誘導的小鼠肺組織損傷。為了量化肺水腫的嚴重程度，本實驗分析了各處理組的肺W/D和BALF的蛋白質量濃度，結果顯示MBPH顯著降低了小鼠肺W/D，且能防止富含蛋白質的水腫液滲透到肺組織中。這表明MBPH可以減輕LPS刺激引起的肺水腫，該研究結果與于笛的研究結果[22]一致，其研究也表明綠豆寡肽可有效緩解LPS誘導的肺水腫，這可能是由于低分子質量寡肽更易被機體吸收，促進細胞的代謝活性，從而發(fā)揮其抗炎效果。目前許多研究證實食源性活性肽的抗炎作用多與其氨基酸組成、序列、長度、電荷、疏水性等密切相關。結合本研究結果得出MBPH和綠豆寡肽都具有緩解LPS誘導的肺水腫，這可能與MBPH特殊的氨基酸組成以及疏水性有關。Chignard[23]和Abraham[24]等研究發(fā)現(xiàn)急性肺損傷小鼠肺屏障通透性的增加是由中性粒細胞介導引起的。本實驗結果也證實小鼠經(jīng)LPS滴注后，肺組織被大量中性粒細胞浸潤，而MBPH顯著減少了肺組織中中性粒細胞的增多。此外，細胞計數(shù)的結果進一步證實了MBPH可改善LPS誘導的急性肺損傷小鼠肺水腫、中性粒細胞浸潤的組織病理學特征。這一研究結果表明MBPH對LPS誘導的急性肺損傷小鼠的保護作用可能與抑制肺部炎癥過程有關。細胞因子分析結果顯示LPS會引起急性肺損傷小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IFN-γ等細胞因子水平的顯著升高[25-28]，結合肺組織病理學特征、中性粒細胞數(shù)量等研究結果得出，鼻腔滴注LPS會導致小鼠急性肺損傷，這可能的機制是LPS誘導小鼠產(chǎn)生TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎細胞因子，這些促炎細胞因子通過協(xié)同作用引發(fā)炎癥級聯(lián)反應并促成了急性肺損傷的發(fā)生[29-31]。MBPH可顯著緩解LPS誘導的TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ等促炎細胞因子的產(chǎn)生。本課題組前期研究也證實MBPH可抑制LPS誘導RAW264.7細胞NF-κB信號通路的激活，從而抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎細胞因子的分泌[32]。MBPH可上調IL-10等抗炎細胞因子的表達，IL-10能有效抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等細胞因子的產(chǎn)生，在機體中發(fā)揮拮抗炎癥作用，從而對機體組織起到保護作用，這與Ndiaye等發(fā)現(xiàn)的植物蛋白水解物可抑制促炎細胞因子表達發(fā)揮抗炎作用的研究結果[9]一致。綜合以上實驗結果得出，MBPH對LPS誘導的急性肺損傷小鼠的保護機制在于MBPH通過減輕肺水腫和肺微血管滲漏、改善肺組織的病理學變化，減少急性肺損傷小鼠肺部中性粒細胞浸潤，下調急性肺損傷小鼠的TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ等促炎細胞因子和上調IL-10等抗炎細胞因子的表達，以及降低MPO的活力等方式發(fā)揮其保護作用。