屈 云，佟 堯，談永萍，趙燕英，唐俊妮

（西南民族大學生命科學與技術(shù)學院，四川 成都 610041）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）在自然界分布十分廣泛，無論是空氣、水、土壤等外界環(huán)境還是人畜皮膚黏膜表面或排泄物中均可存在，該細菌能引起皮膚、軟組織感染，造成食物中毒，以及引起心內(nèi)膜炎、敗血癥及中毒性休克等多種疾病癥狀[1-4]。其致病性主要是通過細菌產(chǎn)生的毒素或侵襲性酶，如腸毒素（staphylococcal enterotoxins，SEs）、表皮脫落毒素、溶血毒素、殺白細胞素、中毒性休克綜合征毒素等造成。其中，由SEs基因（sea-selx）編碼的多種SEs是引起人類食物中毒的主要毒力因子[5-6]，可與腸道神經(jīng)細胞受體作用刺激嘔吐中樞，導致以嘔吐為主要癥狀的急性腸胃炎[7]；由hlα、hlβ基因編碼的溶血毒素，主要損傷紅細胞和血小板，破壞溶酶體，引起機體局部缺血和壞死[8]；由eta和etb基因編碼的表皮脫落毒素可引起嚴重的葡萄球菌性燙傷樣皮膚綜合征[9]；另外，還涉及到由pvl基因編碼的殺白細胞素，由tsst-1基因編碼的中毒性休克綜合征毒素，這些毒素通過不同的作用機制引起宿主一系列炎癥和疾病。自20世紀抗生素被發(fā)現(xiàn)以來，抗生素不僅是治療人類細菌感染最有效的藥物，而且也作為預(yù)防及治療用特效藥、促生長劑、飼料添加劑等被廣泛用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)[10]?？股厮幬锏倪^度使用甚至濫用導致微生物耐藥性問題日益突出。近年來，從畜禽養(yǎng)殖和屠宰環(huán)節(jié)分離的耐藥菌株日益增多，耐藥菌的存在以及耐藥基因的傳播、擴散等嚴重威脅到人類與動物健康[11]。目前，針對牦牛源金黃色葡萄球菌的研究相關(guān)文獻報道不多，胡萍等[12]針對‘天祝白’牦牛肉和鮮乳中金黃色葡萄球菌及其SEs污染進行分析，發(fā)現(xiàn)牦牛乳中金黃色葡萄球菌的檢出率為26.67%，牦牛肉中金黃色葡萄球菌檢出率為14.70%，說明‘天祝白’牦牛產(chǎn)品中金黃色葡萄球菌污染嚴重；潘虎等[13]對拉薩市牦牛肉源金黃色葡萄球菌進行鑒定，并對其耐藥性進行分析，認為西藏拉薩市牦牛肉源金黃色葡萄球菌攜帶多種SEs基因，且對青霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類和磺胺類等多種抗菌藥物產(chǎn)生較強耐藥性；李穩(wěn)欣等[14]對送檢病死牦牛的病原進行鑒定，發(fā)現(xiàn)牦牛死亡的病原為金黃色葡萄球菌。這些研究表明牦牛源金黃色葡萄球菌污染情況日趨嚴重，且菌株具有較強的耐藥性。因此，應(yīng)加強對牦牛源金黃色葡萄球菌的監(jiān)測。本實驗于成都市某牦牛屠宰場采集樣品后進行金黃色葡萄球菌的分離鑒定，對細菌攜帶的毒力基因、耐消毒劑基因以及耐藥基因進行檢測，并進一步針對分離菌株進行藥敏檢測，以期為評價牦牛屠宰環(huán)節(jié)金黃色葡萄球菌安全風險提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

7.5%氯化鈉肉湯、Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基、1%亞碲酸鉀卵黃增菌液、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基、胰酪胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）培養(yǎng)基、Muller-Hinton瓊脂培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；十二烷基硫酸鈉 成都市科龍工試劑廠；Tris飽和酚 北京博奧拓達科技有限公司；無水乙醇 成都海興化學試劑廠；甘油 天津市瑞金特化學品有限公司；1×TAE電泳緩沖液（由三羥甲基氨基甲烷、乙酸和乙二胺四乙酸組成）、1×TE緩沖液（由三羥甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸組成）、Regular Agarose-10型瓊脂糖 英國Biowest公司；GELVIEW核酸染料、DL2000 Marker 寶生物工程（大連）有限公司；快速聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）混合液（1.1×T3 Super PCR Mix）北京擎科新業(yè)科技有限公司；含藥紙片 美國Oxiod Limited公司；實驗所用基因引物的合成及擴增產(chǎn)物的測序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 儀器與設(shè)備

DYY-6C型電泳儀 北京六一儀器廠；WD800B型微波爐 順德市格蘭仕微波爐電器有限公司；PTC-200 PCR儀、Universal Hood II型凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；UV-6100分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；GHP-9080水式恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學儀器有限公司； HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱 江蘇省太倉市實驗設(shè)備廠；AKHL-III-24艾柯超純水機 成都康寧實驗專用純水設(shè)備；MLS-3020電熱自動滅菌鍋日本Sanyo公司；5804R型冷凍離心機 Eppendorf（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

2018年11月于成都市某牦牛定點屠宰場采集屠宰放血后牦牛的鼻腔樣本拭子60 份；剝皮后牦牛的肩頸及胸部胴體拭子30 份；屠宰環(huán)境樣本（屠宰刀具、屠宰接觸地面）拭子31 份；牦牛皮毛樣本拭子29 份；共計150 份。

1.3.2 金黃色葡萄球菌的分離純化

金黃色葡萄球菌的分離純化參照GB 4789.10—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》[15]進行。

1.3.3 金黃色葡萄球菌的分子鑒定

將純化的菌株接種到TSB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)18～24 h，采用文獻[16]報道方法提取菌株DNA，金黃色葡萄球菌ATCC6538為陽性參考菌株。以金黃色葡萄球菌的nuc基因引物進行PCR擴增，具體引物序列為：上游引物：5’-AGTATATAGTGCAACTTCAACTAA-3’；下游引物：5’-ATCAGCGTTGTCTTCGCTCCAAAT-3’[17]。PCR反應(yīng)體系20 μL，包含即用型快速PCR混合液（1.1×T3 Super PCR Mix）17 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL。PCR反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性20 s，59 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸2 min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，同時隨機選擇陽性條帶產(chǎn)物進行測序比對。

1.3.4 金黃色葡萄球菌毒力基因、耐消毒劑基因及耐藥基因檢測

DNA模板制備同上，金黃色葡萄球菌各檢測基因的引物序列、擴增片段長度、退火溫度詳見表1，PCR反應(yīng)體系同上。

表 1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

續(xù)表1

續(xù)表1

1.3.5 金黃色葡萄球菌耐藥表型檢測

藥敏實驗根據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會（clinical and laboratory standards in stitute，CLSI）推薦的K-B紙片擴散法進行操作，實驗結(jié)果按照CLSI的標準進行判定，所用抗菌藥物及紙片含量見表2。

表 2 24 種抗生素藥物及紙片含量Table 2 Concentrations of 24 antibiotic drugs used in K-B disc diffusion test

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

藥敏實驗每株菌和每個藥片平行3 次，結(jié)果以平均值±標準偏差表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件處理，采用Excel軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛屠宰環(huán)節(jié)金黃色葡萄球菌分離、鑒定結(jié)果

金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板的菌落形態(tài)為圓形黑色菌落，呈光滑凸起狀，表面濕潤，菌落周圍有透明環(huán)。本實驗共采集樣品150 份，其中，鼻腔拭子樣本60 份、牦牛肉胴體樣本拭子30 份、環(huán)境樣本拭子31 份、皮毛樣本拭子29 份。通過PCR檢測得到攜帶nuc基因的金黃色葡萄球菌株67 株，總檢出率約為44.67%。其中，鼻腔拭子樣本檢出22 株，檢出率約為36.67%；牦牛肉胴體樣本拭子檢出17 株，檢出率約為56.67%；環(huán)境樣本拭子檢出16 株，檢出率約為51.61%；皮毛樣本拭子檢出12 株，檢出率約為41.38%。

2.2 牦牛屠宰環(huán)節(jié)金黃色葡萄球菌分離菌株毒力基因攜帶情況檢出結(jié)果

圖 1 SEs基因的檢出結(jié)果Fig. 1 Detection rates of enterotoxin genes

圖 2 其他毒力基因的檢出結(jié)果Fig. 2 Detection rates of other virulence genes

PCR檢測結(jié)果顯示，67 株分離菌株中，傳統(tǒng)SEs A-E基因（sea-see）未檢出，新型SEs中seg、sei、sej、sek、sem、seo、sep、ser、ses、set、seu、selx共計12 種SEs基因被檢出，其中sej、set、seu和selx的檢出率較高，selx和seu檢出率高達97.01%和91.04%，sej檢出率為64.18%，set的檢出率為31.34%（圖1）。針對其他毒力基因檢測結(jié)果如圖2所示，溶血毒素基因hlα和hlβ的檢出率分別為76.12%和38.81%；表皮剝脫毒素基因eta、etb的檢出率分別為4.48%、11.94%；殺白細胞素基因pvl的檢出率為5.97%，中毒休克征毒素基因tsst-1的檢出率為11.94%，所有菌株攜帶2 種及以上毒力基因。

2.3 金黃色葡萄球菌耐消毒劑基因攜帶情況檢出結(jié)果

圖 3 耐消毒劑基因的檢出結(jié)果Fig. 3 Detection rates of disinfectant resistance genes

如圖3所示，耐消毒劑基因qacA/B的檢出率為28.36%，qacG、qacH的檢出率均較高，分別為70.15%和71.64%；其中qacC/D的檢出率最高，達到95.52%。2.4 金黃色葡萄球菌耐藥基因攜帶情況檢出結(jié)果

圖 4 耐藥基因的檢出結(jié)果Fig. 4 Detection rates of drug resistance genes

如圖4所示，67 株分離菌株的14 種耐藥基因檢測結(jié)果中，氨基糖苷類耐藥基因（aac6’/aph2’）和大環(huán)內(nèi)脂類基因（ermB）的檢出率均高達86.57%；其次是blaZ（76.12%）、tetM（64.18%）、mecA（62.69%）、ermA（61.19%）、chlA（50.75%）、tetA（40.30%）、norA（35.82%）和grlA（25.37%）；只有1 株分離菌株攜帶vanA基因（1.49%），oxa、msrA和mefA基因未檢出。

2.5 金黃色葡萄球菌的藥敏實驗結(jié)果

67 株分離菌株對24 種抗生素有不同的耐藥譜，如表3所示。金黃色葡萄球菌對克林霉素 （92.54%）耐藥率最高，其次是青霉素（8 5.0 7%）、利福平（82.09%）、氨芐西林（77.61%）、左氧氟沙星（71.64%）、四環(huán)素（64.18%）、紅霉素（62.69%）、甲氧芐啶（55.22%）、阿米卡星（55.22%）、慶大霉素（44.78%）和環(huán)丙沙星（40.30%）。對頭孢類抗生素頭孢西?。?0.15%）、頭孢噻肟（65.67%）、頭孢曲松（61.19%）和頭孢他啶（53.73%）的抗性較強。相較之下，對卡那霉素（2 8.3 6%）、氯霉素（2 2.3 9%）、桿菌肽B（2 2.3 9%）、諾氟沙星（1 6.4 2%）、萬古霉素（1 6.4 2%）和呋喃妥因（13.43%）的抗性較低，所有分離菌株對亞胺培南敏感。64 株（95.52%）具有多重耐藥性（抗3 種及以上抗生素）。82.09%菌株抗5 種以上抗生素，59.70%菌株抗10 種以上抗生素，9.00%菌株對18 種抗生素有抗性。

表 3 金黃色葡萄球菌對24 種抗生素的藥敏檢測結(jié)果Table 3 Results of antimicrobial susceptibility test to 24 drugs for S. aureus isolates

3 討 論

本實驗從牦牛屠宰場采集樣本共150 份，分離出金黃色葡萄球菌67 株，檢出率為44.67%，說明牦牛屠宰環(huán)節(jié)存在較嚴重的金黃色葡萄球菌污染。現(xiàn)有研究表明其他畜產(chǎn)品中也存在較高的金黃色葡萄球菌檢出率，例如谷曉紅等[29]在山東地區(qū)生鮮乳中金黃色葡萄球菌的檢出率為44.62%～64.28%；宋明輝等[30]在市售生鮮肉樣品中分離金黃色葡萄球菌，檢出率為37.84%。本實驗取樣的牦牛養(yǎng)殖屠宰場長期處于完全暴露的環(huán)境條件下，為金黃色葡萄球菌的生長提供了有利的條件。

本實驗牦牛屠宰環(huán)節(jié)來源的金黃色葡萄球菌攜帶毒力基因以及抗消毒劑基因的情況較為嚴重，所分離的67 株菌株共攜帶12 種SEs基因，盡管傳統(tǒng)SEs基因sea-see未檢出，但所有菌株都攜帶2 種及以上毒力基因，說明牦牛屠宰環(huán)境分離株具有潛在的致病性。實驗結(jié)果與劉保光等[31]針對牛奶源金黃色葡萄球菌的毒力基因檢測結(jié)果有一定的一致性。另外，分離菌株對耐消毒劑基因具有較高的檢出率，幾乎大多數(shù)分離菌株都攜帶qacC/D基因，攜帶率最低的qacA/B基因的檢出率也達到28.36%。這可能與屠宰環(huán)境長期頻繁的使用各類消毒劑有關(guān)。有學者認為亞洲地區(qū)對細菌抗消毒劑基因檢出率普遍較高，且發(fā)現(xiàn)qacA/B基因檢出率明顯高于qacC/D基因，認為qacA/B基因是亞洲地區(qū)介導消毒劑抗性的主要因素[32]。另有文獻報道美洲地區(qū)金黃色葡萄球菌的qacA/B的檢出率較低（2%），qacC/D檢出率（7%）相對稍高[33]。本實驗qacC/D基因的檢出率遠遠高于qacA/B基因，這可能與菌株來源不同有關(guān)，實驗檢測的為牦牛源金黃色葡萄球菌，關(guān)于牦牛源金黃色葡萄球菌抗消毒劑基因的檢測報道不多，以后應(yīng)加大這方面的研究力度。目前，屠宰企業(yè)采用的常用化學消毒劑主要有醛類消毒劑、過氧化物類消毒劑、鹵素類消毒劑、酚類消毒劑、季銨鹽類消毒劑、復(fù)方化學消毒劑等[34]。其中，季銨鹽類消毒劑是一種陽離子表面活性劑，其殺滅微生物的機制主要是通過破壞菌體的通透性，使菌體內(nèi)的蛋白質(zhì)變性，導致病原微生物死亡。此類消毒劑使用范圍廣泛，通?？捎糜谛笄輽谏岬膰婌F消毒[35]?？梢?，抗消毒劑基因攜帶率高低與該地區(qū)消毒劑的使用情況可能具有密切關(guān)系。

本實驗中分離菌株對克林霉素、青霉素、利福平、氨芐西林、左氧氟沙星、頭孢西丁、頭孢噻肟、四環(huán)素、紅霉素、頭孢曲松、甲氧芐啶、阿米卡星、頭孢他啶、慶大霉素和環(huán)丙沙星等抗生素的抗性較強，耐藥基因檢測結(jié)果也顯示分離菌株攜帶的7 種耐藥基因檢出率超過50%，表明牦牛屠宰源分離的金黃色葡萄球菌耐藥情況十分嚴重。這與余璐[36]對食源性金黃色葡萄球菌的耐藥分析以及潘虎等[13]對西藏拉薩市牦牛肉源金黃色葡萄球菌耐藥分析結(jié)果相符。近年來，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）逐漸成為多重耐藥性金黃色葡萄球菌的代名詞，mecA作為MRSA的判定基因，檢出率為62.69%，這說明本實驗分離出的大部分菌株屬于MRSA菌株，存在多重耐藥性。與姚詠明等[37]報道金黃色葡萄球菌耐藥譜廣，耐藥性強一致。管程程等[38]認為，金黃色葡萄球菌的耐藥機制是由于抗生素、消毒劑的使用不當。有文獻報道細菌消毒劑抗性與抗菌藥物耐藥性存在相關(guān)性，并且感染細菌抗性已從抗菌藥物擴展到抗消毒劑[39]。由于近年來金黃色葡萄球菌的耐藥菌株大幅增加，耐藥譜也越來越廣泛，提示抗生素、消毒劑合理使用的重要性，以避免細菌的耐藥情況進一步加重。實驗結(jié)果揭示了金黃色葡萄球菌牦牛屠宰環(huán)節(jié)分離菌株耐藥基因、毒力基因的分布和耐藥情況，對食品安全風險評估提供參考。