劉堯堯，李 璐，柳婷婷，張珊珊，荀一萍，朱 宏，王世杰,3，邊艷青，趙寶華,*

（1.河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050011；2.石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司研發(fā)中心，河北 石家莊 050221；3.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018）

近年來，肥胖已成為嚴(yán)重威脅人類健康的主要疾病之一[1]。肥胖是由遺傳、飲食習(xí)慣等多因素綜合作用引發(fā)的代謝綜合征之一，不僅會造成人體內(nèi)脂肪大量堆積，同時也可能繼發(fā)性地引起糖尿病、高血壓等慢性疾病[2]。

飲食引起的肥胖癥，其疾病進展過程中一大特征是腸道屏障功能受損，而該特征也是其并發(fā)癥產(chǎn)生的主要原因之一[3]。腸道屏障功能是指腸道上皮具有分隔腸腔內(nèi)物質(zhì)、防止致病性抗原侵入的功能[4]。腸上皮屏障的重要組成部分之一是緊密連接，能有效防止腸腔內(nèi)致病性抗原或其他有害物質(zhì)進入腸黏膜，引發(fā)腸道免疫反應(yīng)。腸道緊密連接蛋白包括跨膜蛋白（如Occludin蛋白）、外周膜蛋白（如ZO-1蛋白）和細(xì)胞骨架蛋白（如Claudin-1蛋白）等，對維持動物腸道健康至關(guān)重要[5]。飲食習(xí)慣改變可能直接影響人體的腸道屏障功能。相對于普通飲食，高脂飲食的突出特點是脂肪比重高，大量攝入高脂飲食能引起機體脂質(zhì)代謝紊亂，脂肪大量堆積。同時，也可能引起腸道屏障功能受損，導(dǎo)致腸道通透性增加，進而產(chǎn)生細(xì)菌易位、內(nèi)毒素血癥、慢性低度炎癥等癥狀。有研究表明，腸道屏障損傷也可能是引起炎性腸病的重要因素之一[6]。因此，高脂飲食可誘導(dǎo)肥胖癥及繼發(fā)性腸道損傷、慢性炎癥等疾病，嚴(yán)重危害著人類健康，急需尋找一種預(yù)防或治療肥胖及其并發(fā)癥的新方法。

目前針對肥胖癥的治療方法有外科手術(shù)療法[7]、中醫(yī)療法[8]、藥物療法[9]、神經(jīng)調(diào)控技術(shù)療法[10]等，最新研究顯示，某些益生菌或益生菌制劑能夠調(diào)節(jié)飲食或谷氨酸鈉誘導(dǎo)的肥胖動物模型腸道菌群變化，進而改善其脂質(zhì)代謝紊亂狀態(tài)[11]。益生菌是一類能黏附在宿主腸道并對宿主產(chǎn)生益生作用的有益菌體，已證明補充益生菌、益生元或一些益生菌產(chǎn)品對抵抗宿主腸道內(nèi)病原體、調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答、調(diào)控脂肪儲存等均有有益效果[12]。益生菌也能夠改善諸多腸道疾病如炎性腸病、腹瀉等伴隨的腸道屏障功能損傷，Liu Meiling等的研究表明，乳酸乳球菌ML2018可阻止促炎因子的過量產(chǎn)生，抑制巨噬細(xì)胞的浸潤，從而改善腸上皮細(xì)胞屏障的完整性，抑制硫酸葡聚糖鈉誘導(dǎo)的腸道炎[13]。同時，益生菌也可以在一定程度上改善高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖患者體內(nèi)腸道屏障功能受損的癥狀。Krumbeck等的研究表明，雙歧桿菌BB-12能調(diào)節(jié)肥胖人群腸道菌群紊亂的狀態(tài)，改善結(jié)腸滲透性[14]。但目前針對菌粉類益生菌制品對肥胖患者的腸道屏障功能調(diào)節(jié)作用研究甚少，其作用機制也尚不清楚。

本研究利用植物乳桿菌菌粉干預(yù)肥胖模型大鼠，菌粉的主要活菌成分為植物乳桿菌N3117菌株，分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心的保藏編號為CGMCC 10133。通過對該菌株pH值在線發(fā)酵情況分析、保質(zhì)期內(nèi)活菌數(shù)、酸度、pH值的評價，以及其與Caco-2細(xì)胞的黏附性的檢測，發(fā)現(xiàn)其耐酸性強，能耐受動物體腸道的不良環(huán)境并有效黏附于宿主腸道，發(fā)揮益生作用[15]。因此，本實驗探究植物乳桿菌菌粉對肥胖大鼠腸道屏障功能影響將為預(yù)防或治療高脂飲食引起的肥胖患者腸道屏障功能損傷尋找新方法。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

清潔級健康雄性SD大鼠50 只，體質(zhì)量（130±10）g，合格證號：1806113，生產(chǎn)許可證號：SCXK（冀）2013-1003，購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。所有大鼠同室分籠飼養(yǎng)，每籠5 只，自由進食和飲水，晝夜光照變化周期為12 h光照12 h黑暗。環(huán)境溫度控制在（23±2）℃，相對濕度55%～65%。實驗動物購入后在動物飼養(yǎng)室適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后開始造模?；A(chǔ)飼料購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。高脂飼料購自北京博泰宏達(dá)生物技術(shù)有限公司，含碳水化合物42.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）、脂肪25.4%、蛋白質(zhì)24.2%，于-20 ℃冰箱保存。

植物乳桿菌菌粉由石家莊某公司提供，植物乳桿菌N3117菌粉接種至MRS固態(tài)瓊脂培養(yǎng)基倒置培養(yǎng)48 h，對培養(yǎng)后的益生菌菌落計數(shù)，確定活菌數(shù)為4×1011CFU。

ZO-1 一抗、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記山羊抗兔二抗 武漢賽維爾生物科技有限公司；Occludin一抗 武漢Proteintech公司；Claudin-1一抗 美國Abcam公司；蛋白提取試劑盒 北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法蛋白定量試劑盒上海捷瑞生物工程有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒 南京諾唯贊生物科技有限公司；大鼠脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）酶聯(lián)免疫吸附測定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、大鼠D-乳酸（D-lactic acid，D-LA）ELISA試劑盒 蘇州艾萊薩生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高壓蒸汽滅菌鍋 日本Panasonic公司；-80 ℃超低溫冰箱 青島海爾集團；低溫離心機 德國Eppendorf公司；電子稱 寧波美佳寧公司；電子天平 日本Shimadzu公司；烘箱 北京永光明醫(yī)療儀器有限公司；臺式高速冷凍離心機、超微量分光光度計 美國Thermo Fisher公司；酶標(biāo)檢測儀 美國BioTek公司；全自動生化分析儀 深圳Mindray公司；37 ℃恒溫培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械；熒光定量PCR系統(tǒng)、蛋白發(fā)光成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；蛋白電泳及轉(zhuǎn)移系統(tǒng)北京六一生物科技有限公司；脫水機、包埋機 武漢俊杰電子有限公司；病理切片機 德國徠卡儀器有限公司；組織攤片機 浙江科迪儀器設(shè)備有限公司；脫色搖床 美國Scilogex公司；組化筆 美國Gene Tech公司；正置光學(xué)顯微鏡 日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組

50 只雄性SD大鼠依隨機數(shù)字表法分為正常對照組（ND組，n＝10）和高脂飲食組（HFD組，n＝40），分別給予普通飼料及高脂飼料飼喂。飼喂5 周后，分析兩組大鼠的體質(zhì)量數(shù)據(jù)，以高脂飲食組大鼠體質(zhì)量超過正常對照組大鼠（ND組，n＝10）體質(zhì)量的20%為造模成功標(biāo)準(zhǔn)，最終高脂飲食組中造模失敗的6 只大鼠予以剔除，34 只誘導(dǎo)肥胖成功的大鼠隨機分為肥胖模型組（HFD組，n＝8）、高劑量菌粉干預(yù)組（High組，n＝9）、中劑量菌粉干預(yù)組（Middle組，n＝9）、低劑量菌粉干預(yù)組（Low組，n＝8）。菌粉干預(yù)組大鼠給予菌粉灌胃液，使用生理鹽水配制，高、中、低劑量組每1 mL生理鹽水分別溶解332、166、33.2 mg菌粉，灌胃劑量為1 mL/100 gmb，對照組以同體積生理鹽水灌胃，每日1 次，共干預(yù)8 周。

1.3.2 樣品采集及體脂率測定

實驗期間每周記錄大鼠體質(zhì)量，8 周干預(yù)結(jié)束后，所有大鼠禁食不禁水12 h后用10%水合氯醛麻醉，心尖取血處死，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，獲得血清于-80 ℃超低溫冰箱保存。取腎周脂肪、附睪脂肪、腹腔脂肪并稱質(zhì)量。取大鼠小腸組織，部分固定于通用型組織固定液，其余液氮冷凍后于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。體脂率按下式計算。

1.3.3 指標(biāo)測定

1.3.3.1 血清LPS及D-LA水平的測定

根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測血清LPS及D-LA水平。

1.3.3.2 小腸組織病變評估

根據(jù)Lang Junchao等[16]對大鼠小腸組織進行常規(guī)石蠟包埋，并進行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠小腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3.3.3 小腸Occludin、ZO-1、Claudin-1基因表達(dá)的檢測

采用TRIzol法提取大鼠小腸組織總RNA并測定其純度及濃度。去除基因組DNA后，依據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書對所有RNA樣品進行反轉(zhuǎn)錄處理。根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心中GenBank公布的大鼠Occludin、ZO-1、Claudin-1、β-actin的基因序列，采用Primer 5軟件設(shè)計引物，引物序列如表1所示。

表 1 引物信息及退火溫度Table 1 Primer sequences and annealing temperatures used in this study

依據(jù)熒光定量PCR試劑盒說明書，設(shè)計熒光定量PCR反應(yīng)體系，設(shè)定程序并進行擴增，結(jié)果以2-ΔΔCt法計算其相對表達(dá)量。

1.3.3.4 小腸Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)的檢測

取大鼠小腸組織包埋，切片并脫蠟。將脫蠟后的切片置于盛滿檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液（pH 6.0）的修復(fù)盒中進行熱修復(fù)，3%雙氧水溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，3%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）均勻覆蓋組織以封閉非特異性抗原。甩掉封閉液，在切片上滴加磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）按抗體效價比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜。磷酸鹽緩沖液洗滌3 次后加入與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育50 min。之后經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺顯色、蘇木精復(fù)染、梯度乙醇和二甲苯脫水，中性樹膠封片。顯微鏡下鏡檢，每張切片隨機挑選3 個100 倍視野進行拍照并應(yīng)用Image-pro plus 6.0軟件計算切片免疫組化平均光密度值。

1.3.3.5 小腸Claudin-1蛋白表達(dá)的檢測

依據(jù)蛋白提取試劑盒說明書提取大鼠小腸組織總蛋白，BCA法測定蛋白質(zhì)量濃度。取40 μg蛋白上樣后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳完成后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白從凝膠上轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜上，5% BSA封閉。一抗孵育過夜，TBST快搖洗膜后二抗孵育，電化學(xué)發(fā)光試劑發(fā)光，掃描圖像，蛋白分析軟件對蛋白圖像進行灰度分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用單因素方差T-test分析，P＜0.05為具有顯著性差異，P＜0.01為具有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌菌粉對各組大鼠體質(zhì)量的影響

表 2 各組大鼠體質(zhì)量比較Table 2 Comparison of body masses of rats from different groups

由表2 可知，實驗前各組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。實驗結(jié)束后，HFD組體質(zhì)量極顯著高于ND組（P＜0.01），High組體質(zhì)量顯著高于ND組（P＜0.05），Middle組及Low組體質(zhì)量平均值高于ND組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與HFD組相比，High組體質(zhì)量無顯著差異（P＞0.05），Middle組顯著降低（P＜0.05），Low組極顯著降低（P＜0.01）。表明高脂飲食可誘導(dǎo)大鼠體質(zhì)量顯著增加，而中、低劑量植物乳桿菌菌粉干預(yù)可顯著降低由高脂飲食引起的體質(zhì)量升高。

2.2 植物乳桿菌菌粉對各組大鼠體脂率的影響

圖 1 各組大鼠體脂率比較Fig. 1 Comparison of body fat percentages of rats from different groups

由圖1可知，與ND組相比，HFD組、High組及Middle組大鼠體脂率顯著升高（P＜0.05），Low組無顯著差異（P＞0.05）；與HFD組相比，High組體脂率無顯著差異（P＞0.05），Middle組及Low組均顯著降低（P＜0.05）。由此可知，高脂飲食引起大鼠體脂率顯著升高，中劑量及低劑量植物乳桿菌菌粉干預(yù)可顯著緩解大鼠體脂率的升高。

2.3 植物乳桿菌菌粉對各組大鼠血清LPS和D-LA質(zhì)量濃度的影響

表 3 各組大鼠血清LPS和D-LA質(zhì)量濃度Table 3 Serum LPS and D-LA levels in rats from different groups

由表3可知，與ND組相比，HFD組大鼠血清LPS、D-LA水平均顯著升高（P＜0.05），其余各組均無顯著差異（P＞0.05）；與HFD組相比，Middle組血清LPS水平顯著降低（P＜0.05），D-LA水平無顯著變化（P＞0.05），Low組兩指標(biāo)均極顯著降低（P＜0.01）。表明高脂飲食可引起大鼠血清中LPS、D-LA質(zhì)量濃度升高，低劑量菌粉干預(yù)可極顯著降低高脂飲食升高的血清LPS、D-LA質(zhì)量濃度。

2.4 植物乳桿菌菌粉對各組大鼠小腸組織病理情況的影響

如圖2所示，ND組腸黏膜組織無損傷性改變，腸上皮細(xì)胞和絨毛完整、排列整齊；與ND組相比，HFD組大鼠腸上皮細(xì)胞大量脫落，腸黏膜受損嚴(yán)重，小腸絨毛出現(xiàn)水腫及脫落現(xiàn)象；8 周菌粉干預(yù)后，High組腸黏膜組織損傷有輕微改善，Middle組和Low組可較明顯緩解上述病變，表現(xiàn)為腸上皮細(xì)胞輕度受損，絨毛少量脫落，尤以Low組改善效果最優(yōu)。

圖 2 各組大鼠小腸組織病理情況（×200）Fig. 2 Pathological conditions of small intestine in rats from different groups (× 200)

2.5 植物乳桿菌菌粉對各組大鼠小腸ZO-1、Occludin、Claudin-1 mRNA表達(dá)水平的影響

高脂飲食可誘導(dǎo)大鼠肥胖，并影響大鼠腸道屏障功能，但具體機制尚不明確。本研究選取大鼠小腸緊密連接蛋白進行研究，通過檢測其mRNA表達(dá)水平變化來探究植物乳桿菌菌粉對肥胖大鼠腸道屏障功能的影響。

圖 3 各組大鼠小腸ZO-1 mRNA相對表達(dá)水平Fig. 3 mRNA expression of ZO-1 in small intestine of rats from different groups

利用GraphPad Prism 5軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，標(biāo)準(zhǔn)差對差異的顯著性有影響，不能通過柱狀圖直觀判斷。該結(jié)果核驗無誤。由圖3可知，與ND組相比，HFD組小腸組織中ZO-1mRNA相對表達(dá)量顯著下降（P＜0.05），其余各組無顯著變化（P＞0.05）。與HFD組相比，High組無顯著差異（P＞0.05），Middle組、Low組小腸組織ZO-1mRNA相對表達(dá)量極顯著提高（P＜0.01）。說明高脂飲食引起的大鼠肥胖伴隨著小腸組織ZO-1mRNA相對表達(dá)量顯著降低，但經(jīng)過中劑量、低劑量菌粉干預(yù)后可顯著緩解這種降低趨勢。

圖 4 各組大鼠小腸Occludin mRNA相對表達(dá)水平Fig. 4 mRNA expression of Occludin in small intestine of rats from different groups

由圖4可知，與ND組相比，HFD組、High組及Middle組小腸組織中OccludinmRNA相對表達(dá)量無顯著變化（P＞0.05），Low組相對于ND組及HFD組均有升高趨勢，且差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。說明高脂飲食并沒有引起小腸組織OccludinmRNA表達(dá)水平的顯著降低，但經(jīng)過低劑量菌粉干預(yù)后可顯著提高Occludin基因的表達(dá)量。

圖 5 各組大鼠小腸Claudin-1 mRNA相對表達(dá)水平Fig. 5 mRNA expression of Claudin-1 in small intestine of rats from different groups

圖5結(jié)果顯示，與ND組相比，HFD組、High組小腸組織中Claudin-1mRNA相對表達(dá)量均顯著下降（P＜0.05）。與HFD組相比，High組、Middle組無顯著差異（P＞0.05），Low組小腸組織Claudin-1mRNA相對表達(dá)量顯著提高（P＜0.05）。這表明高脂飲食引起小腸組織Claudin-1mRNA表達(dá)水平顯著降低，低劑量植物乳桿菌菌粉干預(yù)可顯著緩解這種降低趨勢。

2.6 植物乳桿菌菌粉對各組大鼠小腸ZO-1、Occludin蛋白表達(dá)水平的影響

由圖6可知，ZO-1在ND組的腸上皮細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜中呈陽性表達(dá)，表現(xiàn)為較多棕黃色著色。HFD組棕黃色著色明顯減少，表明該組大鼠小腸組織ZO-1蛋白的表達(dá)減少。各劑量菌粉干預(yù)組棕黃色著色均增多，其中Low組棕黃色著色增多情況最為顯著，提示低劑量植物乳桿菌菌粉對高脂飲食引起的大鼠小腸組織ZO-1蛋白表達(dá)下降有明顯緩解作用。由圖7可知，腸緊密連接蛋白Occludin在ND組的腸上皮細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞的近胞膜胞質(zhì)中陽性表達(dá)，表現(xiàn)為較多棕黃色著色。HFD組棕黃色著色明顯減少，表明該組大鼠小腸組織Occludin蛋白的表達(dá)減少。Low組棕黃色著色顯著增多，提示低劑量植物乳桿菌菌粉對高脂飲食引起的大鼠小腸組織Occludin蛋白表達(dá)下降有緩解作用。

圖 6 免疫組織化學(xué)檢測ZO-1蛋白表達(dá)（×100）Fig. 6 Immunohistochemical detection of ZO-1 protein expression (× 100)

圖 7 免疫組織化學(xué)檢測Occludin蛋白表達(dá)（×100）Fig. 7 Immunohistochemical detection of Occludin protein expression (× 100)

表 4 免疫組織化學(xué)分析ZO-1和Occludin平均光密度值Table 4 Average optical density of ZO-1 and Occludin in immunohistochemical analysis

應(yīng)用Image-pro plus 6.0軟件分析免疫組化切片平均光密度值可知（表4），與ND組相比，HFD組大鼠的小腸組織中ZO-1蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），其余組無顯著變化（P＞0.05）。與HFD相比，Middle組、Low組ZO-1表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），High組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與ND組相比，HFD組大鼠小腸組織中Occludin蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。與HFD組相比，Low組Occludin表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），其余各組無顯著變化（P＞0.05）。

2.7 植物乳桿菌菌粉對各組大鼠小腸Claudin-1蛋白表達(dá)水平的影響

圖 8 各組大鼠小腸Claudin-1蛋白相對表達(dá)水平Fig. 8 Protein expression of Claudin-1 in small intestine of rats from different groups

由圖8可知，與ND組相比，HFD組、High組、Middle組Claudin-1蛋白相對表達(dá)水平均顯著下降（P＜0.05），Low組無顯著變化（P＞0.05）。菌粉干預(yù)后，與HFD組相比，Low組Claudin-1蛋白相對表達(dá)水平顯著提高（P＜0.05）。這表明高脂飲食引起小腸組織Claudin-1蛋白表達(dá)水平顯著降低，低劑量植物乳桿菌菌粉干預(yù)可顯著緩解這種降低趨勢。

3 討 論

飲食、腸道菌群、氧化應(yīng)激等多種因素均可改變腸道黏膜的通透性[17]，其中飲食與生活最為息息相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，長期高脂飲食可引起機體脂質(zhì)代謝紊亂，脂質(zhì)合成水平高于分解代謝水平，從而引起機體脂質(zhì)堆積。與此同時，不當(dāng)?shù)娘嬍沉?xí)慣也會使機體腸道屏障功能異常，腸道通透性的增加可能導(dǎo)致內(nèi)毒素、炎癥介質(zhì)、病原體等物質(zhì)滲透入血，隨肝門靜脈進入血液循環(huán)，進而使機體產(chǎn)生炎性腸病、內(nèi)毒素血癥、慢性炎癥等多種疾病，進一步惡化腸道屏障受損的程度[18-19]。已有大量實驗和臨床數(shù)據(jù)證明，益生菌能夠通過調(diào)節(jié)肥胖患者腸道菌群以達(dá)到緩解肥胖癥相關(guān)癥狀的作用，目前市面上常見的益生菌產(chǎn)品中使用最多的菌屬是雙歧桿菌和乳桿菌，其中乳桿菌屬常用嗜酸乳桿菌，以植物乳桿菌為主要成分的益生菌產(chǎn)品較少。由于植物乳桿菌有穩(wěn)定定植宿主體內(nèi)等優(yōu)良特性，探究植物乳桿菌菌粉對肥胖患者常伴隨的腸道屏障功能受損狀況保護作用具有現(xiàn)實意義。

大量研究已經(jīng)報道了益生菌或益生菌產(chǎn)品可有效抑制高脂飲食引起的大鼠體質(zhì)量增加和脂肪積累[20-21]。本實驗結(jié)果表明，長期高脂飲食能顯著提高SD大鼠的體質(zhì)量及體脂率，與高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖模型大鼠相比，經(jīng)過中、低劑量植物乳桿菌菌粉干預(yù)的大鼠體質(zhì)量和體脂率顯著下降，提示該劑量下菌粉對改善動物肥胖程度有積極作用。

為全面評價長期高脂飲食對腸黏膜造成的損傷及植物乳桿菌菌粉的保護作用，本實驗對各組大鼠血清LPS及D-LA含量進行了檢測。LPS又稱內(nèi)毒素，是多數(shù)革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁成分，健康狀況下，機體血液中的LPS含量很低，當(dāng)腸道屏障功能受損時，腸道通透性增加，腸道內(nèi)產(chǎn)生的內(nèi)毒素便滲透入血液循環(huán)中，過量的LPS可與細(xì)胞膜上的TLR4受體結(jié)合并激活下游的NF-κB通路，引起促炎因子大量產(chǎn)生，造成機體炎癥[22]。因此，血清中LPS含量是判斷機體炎癥與腸道通透性的重要指標(biāo)之一。D-LA是腸道菌群的發(fā)酵代謝產(chǎn)物，在哺乳動物體內(nèi)缺少將其快速降解的酶，一旦哺乳動物腸黏膜損傷從而導(dǎo)致腸道通透性增加時，腸腔內(nèi)的D-LA便會大量釋放入血，引起機體血清中D-LA水平顯著升高[23]。本實驗結(jié)果表明，經(jīng)過高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖模型組大鼠的血清LPS、D-LA質(zhì)量濃度顯著升高，與肥胖模型組相比，低劑量植物乳桿菌菌粉干預(yù)組大鼠血清中的上述指標(biāo)水平均顯著降低，這提示該劑量的植物乳桿菌菌粉可能對肥胖患者常伴有的慢性炎癥及腸道屏障功能受損有保護及緩解作用。梁惠等[24]的研究中也提出了相同的結(jié)論。

為直觀觀察肥胖大鼠的腸道損傷程度及菌粉的干預(yù)效果，對大鼠小腸組織進行了HE染色。HE染色結(jié)果顯示，肥胖模型組大鼠小腸上皮細(xì)胞組織破碎，腸黏膜受損嚴(yán)重，腺體以及腸黏膜大量脫落。低劑量菌粉干預(yù)組相對于肥胖模型組，小腸上皮組織破裂較少，黏膜輕度受損，腺體及腸黏膜少量脫落。這一結(jié)果進一步直觀說明了該菌粉能較大程度地改善由高脂飲食引起的腸道黏膜屏障受損情況。

Xue Li等[25]在復(fù)合益生菌在改善大鼠非酒精性脂肪肝實驗中，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠小腸組織中緊密連接蛋白Occludin表達(dá)水平極顯著下調(diào)，益生菌干預(yù)后該蛋白表達(dá)水平顯著提高。這可能是由于復(fù)合益生菌定植在大鼠腸道，可改善模型大鼠腸道菌群紊亂情況，使腸道屏障功能得到恢復(fù)。緊密連接是腸上皮屏障的重要組成部分，由多種腸道緊密連接蛋白組成，主要包括跨膜蛋白、外周膜蛋白和細(xì)胞骨架蛋白等[26]。Occludin是緊密連接蛋白中跨膜蛋白的重要成員之一，多表達(dá)于腸上皮細(xì)胞、腺體細(xì)胞表面、胞漿及少數(shù)細(xì)胞核內(nèi)，主要負(fù)責(zé)調(diào)控緊密連接的通透性并且維持細(xì)胞極性[27]。ZO-1是外周膜蛋白中的代表性蛋白，在細(xì)胞骨架形成中發(fā)揮重要作用[28]。Claudin-1是構(gòu)成緊密連接的主要骨架蛋白，對于維持細(xì)胞間緊密連接的完整性和上皮細(xì)胞屏障功能的發(fā)揮具有重要作用[29]。大量研究顯示，緊密連接蛋白表達(dá)水平的顯著下調(diào)是導(dǎo)致機體腸道屏障功能損傷的主要原因[30-31]，因此猜測植物乳桿菌菌粉可能是通過上調(diào)緊密連接蛋白的表達(dá)水平來恢復(fù)受損腸道屏障功能的。本實驗為探究其具體的作用機制，從mRNA與蛋白質(zhì)水平分別檢測了腸道緊密連接蛋白Occludin、ZO-1及Claudin-1的表達(dá)情況。實驗結(jié)果顯示，肥胖模型組大鼠腸道中的Occludin、ZO-1及Claudin-1蛋白表達(dá)水平均顯著下降，低劑量菌粉干預(yù)后其表達(dá)水平顯著上升，這一結(jié)果表明植物乳桿菌菌粉對肥胖大鼠腸道屏障功能的保護機制可能是通過上調(diào)腸道緊密連接蛋白的表達(dá)，進而促進受損傷的腸道屏功能得以恢復(fù)。

本實驗設(shè)計高、中、低3 個劑量的菌粉對肥胖大鼠進行干預(yù)處理，結(jié)果表明高劑量菌粉干預(yù)在緩解肥胖及腸道黏膜損傷中未顯示出顯著作用，中劑量僅在部分指標(biāo)上顯示出顯著作用，而低劑量菌粉干預(yù)對肥胖大鼠脂質(zhì)堆積水平和腸道黏膜損傷狀況均顯示出顯著有益效果。根據(jù)實驗結(jié)果，推測植物乳桿菌菌粉可能通過上調(diào)Occludin、ZO-1及Claudin-1蛋白表達(dá)，從而保護高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠腸道黏膜屏障功能。因此，深入研究開發(fā)以植物乳桿菌為主要成分的益生菌制品可能對于緩解肥胖引起的腸道屏障功能損傷具有重要意義，本實驗所體現(xiàn)的劑量差異效果也可能對益生菌制品的開發(fā)提供有效參考。