陳 旭，陳 選，楊 炯，周少文，汪少蕓

（1.福州大學石油化工學院，福建 福州 350108；2.福州大學生物科學與工程學院，福建 福州 350108；3.福州東澤健康食品有限公司，福建 福州 350002）

中國超過1 億的糖尿病患者由于傳統(tǒng)淀粉性主食習慣的原因，餐后常會出現(xiàn)較大幅度血糖波動[1-2]。為控制血糖，除藥物治療外，很多糖尿病患者選擇粗雜糧和代餐食物作為長期主食，雖然對平穩(wěn)餐后血糖有所幫助，但是粗雜糧、代餐食物會降低飲食口感，長期食用粗雜食物可能造成營養(yǎng)不良甚至腸胃疾病，從而影響糖尿病患者的生活質量[3-5]。

稻米是人類主食之一，全球超過一半人口以大米為主食[6-7]，在水分相對含量14%的稻米中，淀粉相對含量為70%～80%、蛋白相對含量為8%～10%[8]、脂肪相對含量1%～2%[9]、膳食纖維相對含量2%～5%[10]，其余為維生素[11]、灰分和礦物質等[12-13]。稻米中易被人體消化吸收的貯藏蛋白可提供人體所需的必需氨基酸，稻米貯藏蛋白主要由谷蛋白、醇溶蛋白和球蛋白構成，其中谷蛋白含量最高，約占大米總蛋白干質量的80%左右[14-16]，其富含賴氨酸，且易被人體消化吸收；而醇溶蛋白因其結構致密，很難被人體消化吸收。另一方面，我國現(xiàn)有慢性腎臟病患者1.2億，尿毒癥患者150多萬，每年還在以12～15萬新增尿毒癥患者的趨勢增加。雖然提高谷蛋白含量有助于提高稻米的營養(yǎng)價值，但是對腎臟機能障礙或糖尿病患者來說，大米中谷蛋白的大量吸收可能導致病情惡化，該類患者不宜食用可溶性蛋白質量分數(shù)超過4%的大米[17-20]。因此，為滿足腎臟病人及糖尿病人對低含量可吸收蛋白食品的特定需求，研制低谷蛋白大米已成為當前腎臟病患者和糖尿病人食用的特殊食品的一個重要方向。

本實驗供試品W0868低谷蛋白大米是中國工程院院士萬建民教授帶領研究團隊，從20世紀90年代后期開始研究，歷經(jīng)20 年，從10萬 株水稻品種中選育獲得的特殊營養(yǎng)功能大米品種[21]。與普通大米相比，低谷蛋白大米的顯著區(qū)別是其可溶性谷蛋白質量分數(shù)低于4%，碳水化合物的消化吸收速率相對更低，可作為糖尿病和腎病患者的主食或食療輔助食品[22-23]。但是缺少關于大米中低谷蛋白含量與碳水化合物消化吸收速率關系的研究，因此，本實驗通過評價健康成年Beagle犬攝食W0868低谷蛋白大米和普通大米的相對血糖生成指數(shù)和胰島素水平，以及對比和定量評價W0868低谷蛋白大米對餐后血糖的影響，為低谷蛋白大米的應用及后續(xù)實驗提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

Beagle犬，實驗動物使用許可證號：SYXK（川）2018-123，購自成都華西海圻醫(yī)藥科技有限公司。實驗期內(nèi)，實驗動物選用體質量約6～10 kg的健康成年Beagle犬[24]。選用的Beagle犬健康狀況良好，自主活動正常，皮膚被毛清潔，糞尿均未見明顯異常反應，也未見與W0868低谷蛋白大米相關的其他毒性反應。

W0868低谷蛋白大米 福州東澤健康食品有限公司；犬維持飼料 北京科澳協(xié)力飼料有限公司；五常大米（空白大米） 中糧國際（北京）有限公司；胰島素酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒 北京尚柏生物醫(yī)學技術有限公司；一水合葡萄糖 成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

Cobas 6000 c501/Cobas c311全自動生化分析儀 瑞士羅氏公司；Molecular Image?ChemiDOCTMXRS+凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；KDN-102C凱氏定氮儀上海纖檢儀器有限公司；AG246電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；Fresco17高速冷凍離心機 美國Thermo Fisher公司；DB2雙層不銹鋼沖洗式犬籠（800 mm×1 000 mm×2 060 mm） 蘇州市蘇杭科技器材有限公司；EBI全新風中央空調自動控制系統(tǒng)美國Honeywell公司。

1.3 方法

1.3.1 W0868低谷蛋白大米中總蛋白及谷蛋白質量分數(shù)測定

總蛋白及谷蛋白質量分數(shù)測定：隨機抽樣，分單粒提取種子全蛋白。提取樣品總蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）；蛋白凝膠采用Molecular Image?ChemiDOCTMXRS+凝膠成像儀成像；分析各泳道條帶，并對各條帶蛋白量進行定量，計算谷蛋白占總蛋白的比例，重復取平均值；利用凱氏定氮法測定稻米的總蛋白質量分數(shù)，根據(jù)谷蛋白占總蛋白的比例確定谷蛋白質量分數(shù)[25]。

1.3.2 動物分組

動物分組參照蘇小建等[26]的方法，具體采用PRISTIMA 7.2.0版數(shù)據(jù)系統(tǒng)根據(jù)Beagle犬體質量分性別隨機分成1組和2組；每組4 只，其中雌雄各2 只；具體分組信息見表1。

表 1 實驗動物分組情況Table 1 Grouping of experimental animals

1.3.3 飼料配制

一水合葡萄糖：稱取定量葡萄糖并加蒸餾水溶解，配制成濃度為0.2 g/mL的葡萄糖溶液。

五常大米（空白大米）米漿：將大米按質量比1∶1.7加水，混勻，不用洗米，不用延長時間浸泡，將加水的大米放入電飯煲中，煮成后燜10 min斷電，待米飯冷卻至室溫后，將米飯加入少量滅菌注射用水勻漿，再加滅菌注射用水定容至終體積。

W0868低谷蛋白大米米漿：將W0868低谷蛋白大米按質量比1∶1.3加水，混勻，不用洗米，不用延長時間浸泡，將加水的大米放入電飯煲中，煮成后立即斷電，待米飯冷卻至室溫后，將米飯加入少量滅菌注射用水勻漿，再加滅菌注射用水定容至終體積。

1.3.4 劑量設計

根據(jù)前期實驗，米漿中米飯最大質量濃度為0.3 g/mL，按每只犬8 g葡萄糖給藥，第一階段葡萄糖組每只犬給予40 mL質量濃度為0.2 g/mL的葡萄糖溶液；W0868組和五常大米組將米飯做成米漿，給予相當于8 g葡萄糖量的米漿。具體劑量設計如表2所示。

表 2 動物實驗劑量設計Table 2 Doses used for animal experiments

1.3.5 給藥設計

分兩個階段經(jīng)口喂食給藥：第1階段給予葡萄糖按照劑量為8 g葡萄糖每只犬喂食，以確定實驗動物糖耐量正常；第2階段，給予對照食物五常大米（R2）和W0868低谷蛋白大米（T），給予劑量相當于每只犬8 g葡萄糖當量的米飯喂食，具體給藥頻率及周期情況見表3。

表 3 動物給藥周期及頻率Table 3 Time and frequency of animal administration

1.3.6 血漿葡萄糖濃度測定

血樣采集：每次給藥前（15±2）、（5±2）min及給藥后（1 0±2）、（2 0±2）、（3 0±2）、（40±2）、（50±2）、（60±2）、（90±2）、（120±2）、（150±2）、（180±2）min進行定點血樣采集，具體血樣采集方法參照劉建高等[27]的方法。

血樣檢測：使用乙二胺四乙酸抗凝劑靜脈血3 mL，血液樣本離心前于冰盒中放置，于4 ℃、1 800×g離心10 min，通過全自動生化分析儀檢測血漿葡萄糖濃度。

1.3.7 胰島素濃度測定

使用酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒測定血清胰島素濃度[28]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

參考Wolever[29]的方法計算血漿葡萄糖濃度-時間曲線下面積（AUC0～180min）和零點校正后的AUC0～180min，血漿葡萄糖達峰濃度（cmax）和零點校正后的cmax。AUC0～180min和cmax經(jīng)對數(shù)轉換后進行方差分析，方差分析模型中順序、食物、周期作為固定效應，動物個體作為隨機效應。分別計算AUC0～180min和cmax的幾何平均值比率（受試食物/對照食物）的90%置信區(qū)間，同時進行雙單側t-檢驗分析以及等效性評價。同時計算受試食物和對照食物AUC0～180min和cmax的個體內(nèi)變異系數(shù)和個體間變異系數(shù)。

2 結果與分析

2.1 W0868低谷蛋白大米中蛋白質量分數(shù)

圖 1 W0868低谷蛋白大米蛋白質量分數(shù)Fig. 1 Protein content of low gluten rice

通過SDS-PAGE驗證W0868低谷蛋白大米種子是否具有低谷蛋白特征性譜帶，其結果見圖1，可以看出W0868中谷蛋白質量分數(shù)顯著低于五常大米，球蛋白和醇溶蛋白組分顯著增加。W0868低谷蛋白大米中總蛋白和谷蛋白質量分數(shù)均低于五常大米，且W0868低谷蛋白大米中谷蛋白占大米中總蛋白的32%，遠低于五常大米中谷蛋白占大米總蛋白的80%。W0868低谷蛋白大米與五常大米相比可溶性谷蛋白質量分數(shù)降低60%以上，醇溶蛋白質量分數(shù)升高超過100%，且其蛋白質分布也有明顯不同。

2.2 葡萄糖耐量實驗結果

表 4 Beagle犬單次給予8 g葡萄糖后血漿葡萄糖濃度變化Table 4 Changes in plasma glucose concentrations in Beagle dogs after single administration of 8 g of glucose

8 只Beagle犬單次灌胃給予8 g葡萄糖，給藥前和給藥后180 min內(nèi)的血漿葡萄糖濃度數(shù)據(jù)見表4，平均血漿葡萄糖濃度隨時間變化曲線見圖2。結果顯示，8 只Beagle犬給予葡萄糖前后-15～180 min內(nèi)的血漿葡萄糖峰濃度（cmax）為（6.74±0.75）mmol/L，谷濃度（cmin）為（4.67±0.44）mmol/L，達峰時間（tmax）為（31±14）min，符合正常Beagle犬葡萄糖耐量后的血糖代謝特征[30]；各時間點血漿葡萄糖濃度水平的變異系數(shù)小于15%，表明本研究納入的8 只實驗犬具有正常一致的糖代謝基礎水平。

圖 2 Beagle犬給予8 g葡萄糖后的血漿葡萄糖濃度隨時間變化曲線Fig. 2 Time-course curve of plasma glucose concentration in Beagle dogs after administration of 8 g of glucose

2.3 W0868低谷蛋白大米和五常大米的相對血糖生成指數(shù)

2.3.1 血漿葡萄糖濃度變化

采用雙交叉試驗設計，將8 只Beagle犬隨機等分為2 組，在2 個連續(xù)的實驗周期先后單次給予等量碳水化合物的W0868低谷蛋白大米（T）和五常大米（R2），干預前和干預后180 min內(nèi)的平均血漿葡萄糖濃度經(jīng)時變化曲線見圖3，每只Beagle犬在兩個實驗周期分別給予W0868低谷蛋白大米和五常大米后的血漿葡萄糖濃度經(jīng)時變化曲線見圖4。8 只Beagle犬在兩個周期分別喂食W0868低谷蛋白大米和五常大米后，與五常大米相比W0868低谷蛋白大米血漿葡萄糖濃度的達峰時間、0～90、0～120、0～150 min和0～180 min血漿葡萄糖濃度曲線下面積均顯著降低。

圖 3 Beagle犬單次給予T和R2后的平均血漿葡萄糖濃度隨時間變化曲線Fig. 3 Time-course curve of average plasma glucose concentration in Beagle dogs after single administration of WB0868 or control diet

圖 4 每只Beagle犬在兩個實驗周期分別給予T和R2后的血漿葡萄糖濃度隨時間變化曲線Fig. 4 Time-course curves of plasma glucose concentration in Beagle dogs after administration of WB0868 or control diet during two test periods

表 5 Beagle犬單次給予W0868低谷蛋白大米和五常大米后主要血漿葡萄糖參數(shù)及其統(tǒng)計分析結果Table 5 Statistical analysis of main plasma glucose parameters in Beagle dogs after single administration of WB0868 or control diet

2.3.2 餐后血漿葡萄糖升高程度

根據(jù)非房室模型計算各只Beagle犬單次給予W0868低谷蛋白大米和五常大米后的血漿葡萄糖升高速率和程度的參數(shù)，包括tmax、cmax、AUC0～60min、AUC0～90min、AUC0～120min、AUC0～150min、AUC0～180min；tmax經(jīng)Wilcoxon秩和檢驗，cmax、AUC0～60min、AUC0～90min、AUC0～120min、AUC0～150min和AUC0～180min經(jīng)自然對數(shù)轉換后進行配對t檢驗，數(shù)據(jù)及其統(tǒng)計分析結果見表5。

統(tǒng)計分析結果表明，與五常大米相比，8 只Beagle犬經(jīng)W0868低谷蛋白大米干預后血漿葡萄糖濃度的tmax、AUC0～90min、AUC0～120min、AUC0～150min、和AUC0～180min均顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；cmax和AUC0～60min存在一定的差異，但無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3.3 基線校正血漿葡萄糖濃度數(shù)據(jù)及血糖生成指數(shù)

表 6 Beagle犬單次給予T和R2后的基線校正血漿葡萄糖濃度數(shù)據(jù)及相對血糖生成指數(shù)Table 6 Baseline corrected plasma glucose concentration data and relative glycemic index in Beagle dogs after single administration of WB0868 or control diet

以干預前5 min和15 min的平均血漿葡萄糖濃度作為基線值，以干預后的血漿葡萄糖濃度減去基線值，分別對每條血糖曲線進行基線校正，負值計為0。8 只Beagle犬單次給予W0868低谷蛋白大米和五常大米后基線校正的血漿葡萄糖濃度數(shù)據(jù)見表6。根據(jù)校正后的血漿葡萄糖濃度數(shù)據(jù)計算0～120 min血漿葡萄糖曲線下面積AUC0～120min，分別以每只Beagle犬給予W0868低谷蛋白大米后的基線校正后的AUC0～120min除以給予五常大米組后的基線校正后的AUC0～120min，計算W0868低谷蛋白大米和五常大米的相對血糖生成指數(shù)，結果見表6。8 只Beagle犬單次給與W0868低谷蛋白大米后AUC0～120min均顯著低于給與五常大米組的Beagle犬，且相對血糖生成指數(shù)顯著降低。

2.3.4 相對血糖生成指數(shù)統(tǒng)計分析結果

將基線校正后的AUC0～120min經(jīng)對數(shù)轉換后計算幾何平均值比率（W0868低谷蛋白大米/五常大米）的90%置信區(qū)間，同時進行雙單側t-檢驗分析，統(tǒng)計分析結果見表7。按照血糖生成指數(shù)的定義，采用基線校正后的0～120 min血漿葡萄糖曲線下面積，計算W0868低谷蛋白大米和五常大米相比的相對血糖生成指數(shù)的幾何平均值為59.33%，90%置信區(qū)間為42.56%～82.72%。因此可以認為，以相同標準單次定量喂食Beagle犬，W0868低谷蛋白大米升高Beagle犬血糖的速率和程度比五常大米低40.67%。

表 7 基線校正后AUC0～120min的相對血糖生成指數(shù)統(tǒng)計分析結果（n＝8）Table 7 Statistical analysis of relative glycemic index calculated from baseline corrected AUC0-120min (n= 8)

2.4 W0868低谷蛋白大米對餐后Beagle犬胰島素分泌情況

采用雙交叉試驗設計，8 只Beagle犬隨機等分為兩組，在兩個連續(xù)的實驗周期先后單次給予等量碳水化合物的W0868低谷蛋白大米和五常大米，干預前5 min和干預后30、60、90 min的血清胰島素濃度數(shù)據(jù)，平均血清胰島素濃度隨時間變化曲線見圖5。統(tǒng)計分析結果表明，與對照大米相比，Beagle犬喂食W0868低谷蛋白大米后30 min和60 min的血清胰島素濃度存在一定降低的現(xiàn)象，該現(xiàn)象與血糖生成指數(shù)實驗結果一致；由于存在個體差異且樣本數(shù)較小，兩組血清胰島素濃度的差異尚未達到統(tǒng)計學意義（P＝0.09）。

圖 5 Beagle犬單次給予T和R2后的平均血清胰島素濃度隨時間變化曲線Fig. 5 Time-course curves of mean serum insulin concentrations in Beagle dogs after single administration of WB0868 or control diet

3 結 論

以相同標準單次定量喂食時，與W0868低谷蛋白大米相比，對照食物五常大米在30～60 min具有更高的升糖效應，同時在約90 min后出現(xiàn)血漿葡萄糖濃度低于基線值的情況；血清胰島素檢測結果證實，對照食物五常大米干預后30 min和60 min的血清胰島素濃度在一定程度上高于W0868低谷蛋白大米，該現(xiàn)象與血糖生成指數(shù)實驗結果完全一致。根據(jù)本實驗結果可以認為，以相同標準單次定量喂食，W0868低谷蛋白大米升高Beagle犬血糖的速率和程度比對照食物五常大米低40.67%，并在一定程度上降低了Beagle犬的代償性胰島素分泌。因此可以推測，與對照食物五常大米相比，W0868低谷蛋白大米可能在一定程度上具有減緩胰島素抵抗進展的作用，該作用或存在對2型糖尿病人的臨床意義。