陳 旭，陳 選，楊 炯，周少文，汪少蕓

（1.福州大學(xué)石油化工學(xué)院，福建 福州 350108；2.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350108；3.福州東澤健康食品有限公司，福建 福州 350002）

中國超過1 億的糖尿病患者由于傳統(tǒng)淀粉性主食習(xí)慣的原因，餐后常會(huì)出現(xiàn)較大幅度血糖波動(dòng)[1-2]。為控制血糖，除藥物治療外，很多糖尿病患者選擇粗雜糧和代餐食物作為長期主食，雖然對平穩(wěn)餐后血糖有所幫助，但是粗雜糧、代餐食物會(huì)降低飲食口感，長期食用粗雜食物可能造成營養(yǎng)不良甚至腸胃疾病，從而影響糖尿病患者的生活質(zhì)量[3-5]。

稻米是人類主食之一，全球超過一半人口以大米為主食[6-7]，在水分相對含量14%的稻米中，淀粉相對含量為70%～80%、蛋白相對含量為8%～10%[8]、脂肪相對含量1%～2%[9]、膳食纖維相對含量2%～5%[10]，其余為維生素[11]、灰分和礦物質(zhì)等[12-13]。稻米中易被人體消化吸收的貯藏蛋白可提供人體所需的必需氨基酸，稻米貯藏蛋白主要由谷蛋白、醇溶蛋白和球蛋白構(gòu)成，其中谷蛋白含量最高，約占大米總蛋白干質(zhì)量的80%左右[14-16]，其富含賴氨酸，且易被人體消化吸收；而醇溶蛋白因其結(jié)構(gòu)致密，很難被人體消化吸收。另一方面，我國現(xiàn)有慢性腎臟病患者1.2億，尿毒癥患者150多萬，每年還在以12～15萬新增尿毒癥患者的趨勢增加。雖然提高谷蛋白含量有助于提高稻米的營養(yǎng)價(jià)值，但是對腎臟機(jī)能障礙或糖尿病患者來說，大米中谷蛋白的大量吸收可能導(dǎo)致病情惡化，該類患者不宜食用可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過4%的大米[17-20]。因此，為滿足腎臟病人及糖尿病人對低含量可吸收蛋白食品的特定需求，研制低谷蛋白大米已成為當(dāng)前腎臟病患者和糖尿病人食用的特殊食品的一個(gè)重要方向。

本實(shí)驗(yàn)供試品W0868低谷蛋白大米是中國工程院院士萬建民教授帶領(lǐng)研究團(tuán)隊(duì)，從20世紀(jì)90年代后期開始研究，歷經(jīng)20 年，從10萬 株水稻品種中選育獲得的特殊營養(yǎng)功能大米品種[21]。與普通大米相比，低谷蛋白大米的顯著區(qū)別是其可溶性谷蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于4%，碳水化合物的消化吸收速率相對更低，可作為糖尿病和腎病患者的主食或食療輔助食品[22-23]。但是缺少關(guān)于大米中低谷蛋白含量與碳水化合物消化吸收速率關(guān)系的研究，因此，本實(shí)驗(yàn)通過評價(jià)健康成年Beagle犬?dāng)z食W0868低谷蛋白大米和普通大米的相對血糖生成指數(shù)和胰島素水平，以及對比和定量評價(jià)W0868低谷蛋白大米對餐后血糖的影響，為低谷蛋白大米的應(yīng)用及后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

Beagle犬，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號：SYXK（川）2018-123，購自成都華西海圻醫(yī)藥科技有限公司。實(shí)驗(yàn)期內(nèi)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用體質(zhì)量約6～10 kg的健康成年Beagle犬[24]。選用的Beagle犬健康狀況良好，自主活動(dòng)正常，皮膚被毛清潔，糞尿均未見明顯異常反應(yīng)，也未見與W0868低谷蛋白大米相關(guān)的其他毒性反應(yīng)。

W0868低谷蛋白大米 福州東澤健康食品有限公司；犬維持飼料 北京科澳協(xié)力飼料有限公司；五常大米（空白大米） 中糧國際（北京）有限公司；胰島素酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒 北京尚柏生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司；一水合葡萄糖 成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Cobas 6000 c501/Cobas c311全自動(dòng)生化分析儀 瑞士羅氏公司；Molecular Image?ChemiDOCTMXRS+凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；KDN-102C凱氏定氮儀上海纖檢儀器有限公司；AG246電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；Fresco17高速冷凍離心機(jī) 美國Thermo Fisher公司；DB2雙層不銹鋼沖洗式犬籠（800 mm×1 000 mm×2 060 mm） 蘇州市蘇杭科技器材有限公司；EBI全新風(fēng)中央空調(diào)自動(dòng)控制系統(tǒng)美國Honeywell公司。

1.3 方法

1.3.1 W0868低谷蛋白大米中總蛋白及谷蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定

總蛋白及谷蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定：隨機(jī)抽樣，分單粒提取種子全蛋白。提取樣品總蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）；蛋白凝膠采用Molecular Image?ChemiDOCTMXRS+凝膠成像儀成像；分析各泳道條帶，并對各條帶蛋白量進(jìn)行定量，計(jì)算谷蛋白占總蛋白的比例，重復(fù)取平均值；利用凱氏定氮法測定稻米的總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，根據(jù)谷蛋白占總蛋白的比例確定谷蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)[25]。

1.3.2 動(dòng)物分組

動(dòng)物分組參照蘇小建等[26]的方法，具體采用PRISTIMA 7.2.0版數(shù)據(jù)系統(tǒng)根據(jù)Beagle犬體質(zhì)量分性別隨機(jī)分成1組和2組；每組4 只，其中雌雄各2 只；具體分組信息見表1。

表 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組情況Table 1 Grouping of experimental animals

1.3.3 飼料配制

一水合葡萄糖：稱取定量葡萄糖并加蒸餾水溶解，配制成濃度為0.2 g/mL的葡萄糖溶液。

五常大米（空白大米）米漿：將大米按質(zhì)量比1∶1.7加水，混勻，不用洗米，不用延長時(shí)間浸泡，將加水的大米放入電飯煲中，煮成后燜10 min斷電，待米飯冷卻至室溫后，將米飯加入少量滅菌注射用水勻漿，再加滅菌注射用水定容至終體積。

W0868低谷蛋白大米米漿：將W0868低谷蛋白大米按質(zhì)量比1∶1.3加水，混勻，不用洗米，不用延長時(shí)間浸泡，將加水的大米放入電飯煲中，煮成后立即斷電，待米飯冷卻至室溫后，將米飯加入少量滅菌注射用水勻漿，再加滅菌注射用水定容至終體積。

1.3.4 劑量設(shè)計(jì)

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)，米漿中米飯最大質(zhì)量濃度為0.3 g/mL，按每只犬8 g葡萄糖給藥，第一階段葡萄糖組每只犬給予40 mL質(zhì)量濃度為0.2 g/mL的葡萄糖溶液；W0868組和五常大米組將米飯做成米漿，給予相當(dāng)于8 g葡萄糖量的米漿。具體劑量設(shè)計(jì)如表2所示。

表 2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)劑量設(shè)計(jì)Table 2 Doses used for animal experiments

1.3.5 給藥設(shè)計(jì)

分兩個(gè)階段經(jīng)口喂食給藥：第1階段給予葡萄糖按照劑量為8 g葡萄糖每只犬喂食，以確定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物糖耐量正常；第2階段，給予對照食物五常大米（R2）和W0868低谷蛋白大米（T），給予劑量相當(dāng)于每只犬8 g葡萄糖當(dāng)量的米飯喂食，具體給藥頻率及周期情況見表3。

表 3 動(dòng)物給藥周期及頻率Table 3 Time and frequency of animal administration

1.3.6 血漿葡萄糖濃度測定

血樣采集：每次給藥前（15±2）、（5±2）min及給藥后（1 0±2）、（2 0±2）、（3 0±2）、（40±2）、（50±2）、（60±2）、（90±2）、（120±2）、（150±2）、（180±2）min進(jìn)行定點(diǎn)血樣采集，具體血樣采集方法參照劉建高等[27]的方法。

血樣檢測：使用乙二胺四乙酸抗凝劑靜脈血3 mL，血液樣本離心前于冰盒中放置，于4 ℃、1 800×g離心10 min，通過全自動(dòng)生化分析儀檢測血漿葡萄糖濃度。

1.3.7 胰島素濃度測定

使用酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒測定血清胰島素濃度[28]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

參考Wolever[29]的方法計(jì)算血漿葡萄糖濃度-時(shí)間曲線下面積（AUC0～180min）和零點(diǎn)校正后的AUC0～180min，血漿葡萄糖達(dá)峰濃度（cmax）和零點(diǎn)校正后的cmax。AUC0～180min和cmax經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析，方差分析模型中順序、食物、周期作為固定效應(yīng)，動(dòng)物個(gè)體作為隨機(jī)效應(yīng)。分別計(jì)算AUC0～180min和cmax的幾何平均值比率（受試食物/對照食物）的90%置信區(qū)間，同時(shí)進(jìn)行雙單側(cè)t-檢驗(yàn)分析以及等效性評價(jià)。同時(shí)計(jì)算受試食物和對照食物AUC0～180min和cmax的個(gè)體內(nèi)變異系數(shù)和個(gè)體間變異系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 W0868低谷蛋白大米中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)

圖 1 W0868低谷蛋白大米蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig. 1 Protein content of low gluten rice

通過SDS-PAGE驗(yàn)證W0868低谷蛋白大米種子是否具有低谷蛋白特征性譜帶，其結(jié)果見圖1，可以看出W0868中谷蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著低于五常大米，球蛋白和醇溶蛋白組分顯著增加。W0868低谷蛋白大米中總蛋白和谷蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低于五常大米，且W0868低谷蛋白大米中谷蛋白占大米中總蛋白的32%，遠(yuǎn)低于五常大米中谷蛋白占大米總蛋白的80%。W0868低谷蛋白大米與五常大米相比可溶性谷蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低60%以上，醇溶蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高超過100%，且其蛋白質(zhì)分布也有明顯不同。

2.2 葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表 4 Beagle犬單次給予8 g葡萄糖后血漿葡萄糖濃度變化Table 4 Changes in plasma glucose concentrations in Beagle dogs after single administration of 8 g of glucose

8 只Beagle犬單次灌胃給予8 g葡萄糖，給藥前和給藥后180 min內(nèi)的血漿葡萄糖濃度數(shù)據(jù)見表4，平均血漿葡萄糖濃度隨時(shí)間變化曲線見圖2。結(jié)果顯示，8 只Beagle犬給予葡萄糖前后-15～180 min內(nèi)的血漿葡萄糖峰濃度（cmax）為（6.74±0.75）mmol/L，谷濃度（cmin）為（4.67±0.44）mmol/L，達(dá)峰時(shí)間（tmax）為（31±14）min，符合正常Beagle犬葡萄糖耐量后的血糖代謝特征[30]；各時(shí)間點(diǎn)血漿葡萄糖濃度水平的變異系數(shù)小于15%，表明本研究納入的8 只實(shí)驗(yàn)犬具有正常一致的糖代謝基礎(chǔ)水平。

圖 2 Beagle犬給予8 g葡萄糖后的血漿葡萄糖濃度隨時(shí)間變化曲線Fig. 2 Time-course curve of plasma glucose concentration in Beagle dogs after administration of 8 g of glucose

2.3 W0868低谷蛋白大米和五常大米的相對血糖生成指數(shù)

2.3.1 血漿葡萄糖濃度變化

采用雙交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將8 只Beagle犬隨機(jī)等分為2 組，在2 個(gè)連續(xù)的實(shí)驗(yàn)周期先后單次給予等量碳水化合物的W0868低谷蛋白大米（T）和五常大米（R2），干預(yù)前和干預(yù)后180 min內(nèi)的平均血漿葡萄糖濃度經(jīng)時(shí)變化曲線見圖3，每只Beagle犬在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)周期分別給予W0868低谷蛋白大米和五常大米后的血漿葡萄糖濃度經(jīng)時(shí)變化曲線見圖4。8 只Beagle犬在兩個(gè)周期分別喂食W0868低谷蛋白大米和五常大米后，與五常大米相比W0868低谷蛋白大米血漿葡萄糖濃度的達(dá)峰時(shí)間、0～90、0～120、0～150 min和0～180 min血漿葡萄糖濃度曲線下面積均顯著降低。

圖 3 Beagle犬單次給予T和R2后的平均血漿葡萄糖濃度隨時(shí)間變化曲線Fig. 3 Time-course curve of average plasma glucose concentration in Beagle dogs after single administration of WB0868 or control diet

圖 4 每只Beagle犬在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)周期分別給予T和R2后的血漿葡萄糖濃度隨時(shí)間變化曲線Fig. 4 Time-course curves of plasma glucose concentration in Beagle dogs after administration of WB0868 or control diet during two test periods

表 5 Beagle犬單次給予W0868低谷蛋白大米和五常大米后主要血漿葡萄糖參數(shù)及其統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果Table 5 Statistical analysis of main plasma glucose parameters in Beagle dogs after single administration of WB0868 or control diet

2.3.2 餐后血漿葡萄糖升高程度

根據(jù)非房室模型計(jì)算各只Beagle犬單次給予W0868低谷蛋白大米和五常大米后的血漿葡萄糖升高速率和程度的參數(shù)，包括tmax、cmax、AUC0～60min、AUC0～90min、AUC0～120min、AUC0～150min、AUC0～180min；tmax經(jīng)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，cmax、AUC0～60min、AUC0～90min、AUC0～120min、AUC0～150min和AUC0～180min經(jīng)自然對數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行配對t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)及其統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見表5。

統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，與五常大米相比，8 只Beagle犬經(jīng)W0868低谷蛋白大米干預(yù)后血漿葡萄糖濃度的tmax、AUC0～90min、AUC0～120min、AUC0～150min、和AUC0～180min均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；cmax和AUC0～60min存在一定的差異，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3.3 基線校正血漿葡萄糖濃度數(shù)據(jù)及血糖生成指數(shù)

表 6 Beagle犬單次給予T和R2后的基線校正血漿葡萄糖濃度數(shù)據(jù)及相對血糖生成指數(shù)Table 6 Baseline corrected plasma glucose concentration data and relative glycemic index in Beagle dogs after single administration of WB0868 or control diet

以干預(yù)前5 min和15 min的平均血漿葡萄糖濃度作為基線值，以干預(yù)后的血漿葡萄糖濃度減去基線值，分別對每條血糖曲線進(jìn)行基線校正，負(fù)值計(jì)為0。8 只Beagle犬單次給予W0868低谷蛋白大米和五常大米后基線校正的血漿葡萄糖濃度數(shù)據(jù)見表6。根據(jù)校正后的血漿葡萄糖濃度數(shù)據(jù)計(jì)算0～120 min血漿葡萄糖曲線下面積AUC0～120min，分別以每只Beagle犬給予W0868低谷蛋白大米后的基線校正后的AUC0～120min除以給予五常大米組后的基線校正后的AUC0～120min，計(jì)算W0868低谷蛋白大米和五常大米的相對血糖生成指數(shù)，結(jié)果見表6。8 只Beagle犬單次給與W0868低谷蛋白大米后AUC0～120min均顯著低于給與五常大米組的Beagle犬，且相對血糖生成指數(shù)顯著降低。

2.3.4 相對血糖生成指數(shù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

將基線校正后的AUC0～120min經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后計(jì)算幾何平均值比率（W0868低谷蛋白大米/五常大米）的90%置信區(qū)間，同時(shí)進(jìn)行雙單側(cè)t-檢驗(yàn)分析，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見表7。按照血糖生成指數(shù)的定義，采用基線校正后的0～120 min血漿葡萄糖曲線下面積，計(jì)算W0868低谷蛋白大米和五常大米相比的相對血糖生成指數(shù)的幾何平均值為59.33%，90%置信區(qū)間為42.56%～82.72%。因此可以認(rèn)為，以相同標(biāo)準(zhǔn)單次定量喂食Beagle犬，W0868低谷蛋白大米升高Beagle犬血糖的速率和程度比五常大米低40.67%。

表 7 基線校正后AUC0～120min的相對血糖生成指數(shù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果（n＝8）Table 7 Statistical analysis of relative glycemic index calculated from baseline corrected AUC0-120min (n= 8)

2.4 W0868低谷蛋白大米對餐后Beagle犬胰島素分泌情況

采用雙交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)，8 只Beagle犬隨機(jī)等分為兩組，在兩個(gè)連續(xù)的實(shí)驗(yàn)周期先后單次給予等量碳水化合物的W0868低谷蛋白大米和五常大米，干預(yù)前5 min和干預(yù)后30、60、90 min的血清胰島素濃度數(shù)據(jù)，平均血清胰島素濃度隨時(shí)間變化曲線見圖5。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，與對照大米相比，Beagle犬喂食W0868低谷蛋白大米后30 min和60 min的血清胰島素濃度存在一定降低的現(xiàn)象，該現(xiàn)象與血糖生成指數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致；由于存在個(gè)體差異且樣本數(shù)較小，兩組血清胰島素濃度的差異尚未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.09）。

圖 5 Beagle犬單次給予T和R2后的平均血清胰島素濃度隨時(shí)間變化曲線Fig. 5 Time-course curves of mean serum insulin concentrations in Beagle dogs after single administration of WB0868 or control diet

3 結(jié) 論

以相同標(biāo)準(zhǔn)單次定量喂食時(shí)，與W0868低谷蛋白大米相比，對照食物五常大米在30～60 min具有更高的升糖效應(yīng)，同時(shí)在約90 min后出現(xiàn)血漿葡萄糖濃度低于基線值的情況；血清胰島素檢測結(jié)果證實(shí)，對照食物五常大米干預(yù)后30 min和60 min的血清胰島素濃度在一定程度上高于W0868低谷蛋白大米，該現(xiàn)象與血糖生成指數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全一致。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以認(rèn)為，以相同標(biāo)準(zhǔn)單次定量喂食，W0868低谷蛋白大米升高Beagle犬血糖的速率和程度比對照食物五常大米低40.67%，并在一定程度上降低了Beagle犬的代償性胰島素分泌。因此可以推測，與對照食物五常大米相比，W0868低谷蛋白大米可能在一定程度上具有減緩胰島素抵抗進(jìn)展的作用，該作用或存在對2型糖尿病人的臨床意義。