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        利用密度泛函理論分析藍(lán)莓花色苷抗氧化活性

        2020-09-21 08:15:38王蘭嬌李大婧張良聰何偉偉黃午陽(yáng)包怡紅張鐘元
        食品科學(xué) 2020年17期
        關(guān)鍵詞:糖苷花色花青素

        王蘭嬌,李大婧,張良聰,柴 智,何偉偉,黃午陽(yáng),3,*,包怡紅,張鐘元

        (1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150040;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,江蘇 南京 210014;3.江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210014)

        藍(lán)莓(Vacciniumspp.)為杜鵑花科越橘屬的代表植物[1],除富含常見的糖、酸、VC、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外,還含有超氧化物歧化酶、熊果苷、花青素等特殊功能成分[2-3]。藍(lán)莓中的花青素含量十分豐富,花青素屬于黃酮類化合物,是一種有益于人體健康的抗氧化物質(zhì),具有清除細(xì)胞中自由基、調(diào)節(jié)人體機(jī)能、預(yù)防心血管疾病、加速視網(wǎng)膜的合成與再生以及抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等重要功效[4-5]。黃酮類化合物首要的活性功能就是抗氧化能力,藍(lán)莓果實(shí)中的花青素是最豐富的抗氧化劑來(lái)源之一[6-7]。研究表明,花青素是目前發(fā)現(xiàn)的最高效的天然抗氧化劑,它的抗氧化能力約為VE的50 倍、VC的20 倍[8],而其抗氧化能力主要與分子中酚羥基結(jié)構(gòu)存在不可分割的關(guān)聯(lián)[9]。

        標(biāo)準(zhǔn)體系是標(biāo)準(zhǔn)分類管理的重要依據(jù)。根據(jù)《測(cè)繪標(biāo)準(zhǔn)體系》(2017修訂版),按定義與描述、獲取與處理、成果、應(yīng)用服務(wù)、檢驗(yàn)與測(cè)試和管理六大類36小類對(duì)測(cè)繪標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類管理[3]。

        天然黃酮類化合物以游離或苷類的形式存在于自然界,而花青素與其他黃酮類化合物相比,最明顯的差別在于它的分子中含有氧正離子,并且在4位沒(méi)有羰基取代,根據(jù)B環(huán)各個(gè)碳位上的取代基不相同,形成了不同的花青素。目前已知自然界中有23 種花青素[10],其中矢車菊素(cyanidin,Cy)、飛燕草素(delphinidin,Dp)、矮牽牛素(petunidin,Pt)、芍藥素(peonidin,Pn)、錦葵色素(malvidin,Mv)、天竺葵素(pelargonidin,Pg)6 種花青素常見于一般天然植物中[11],而藍(lán)莓果實(shí)中的花青素通常由除天竺葵素以外的其他5 種花青素組成[12],并分別與葡萄糖苷(glucose,glc)、半乳糖苷(galactose,gal)、阿拉伯糖苷(arabinose,ara)相結(jié)合,形成不同的藍(lán)莓花色苷[13]。

        藍(lán)莓花色苷的抗氧化作用主要依靠酚羥基的脫氫反應(yīng)來(lái)完成,酚羥基脫去氫原子并同自由基反應(yīng),在消除自由基后形成共振穩(wěn)定的半醌式自由基結(jié)構(gòu),進(jìn)而按序終止自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[14]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)氧自由基吸收能力(oxygen radical absorbance capacity,ORAC)實(shí)驗(yàn)分析了13 種花色苷及不同品種藍(lán)莓花青素提取物的體外抗氧化活性,測(cè)定了藍(lán)莓花青素提取物中花色苷的組成成分與含量,并通過(guò)密度泛函理論對(duì)花色苷主要幾何結(jié)構(gòu)參數(shù)、酚羥基的解離能(bond dissociation energy,BDE)、電離勢(shì)(ionization potential,IP)及半醌式自由基的自旋密度分布等進(jìn)行計(jì)算分析,從而解析花色苷的抗氧化機(jī)理,對(duì)藍(lán)莓花色苷進(jìn)一步研究和利用提供有利參考。13 種花色苷分子結(jié)構(gòu)與花青素母核結(jié)構(gòu)見圖1。

        圖 1 13 種花色苷的分子結(jié)構(gòu)及花青素母核結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structures of 13 anthocyanins and basic structure of anthocyanindin

        1 材料與方法

        1.1 原料及材料

        藍(lán)莓‘US12’為野生種Vaccinium darrowi,采自江蘇省南京市中山植物園,果皮顏色較深,果粒較??;其余3 種均為南高叢藍(lán)莓,產(chǎn)自浙江諸暨,‘奧尼爾’(O’neal)果實(shí)粒大,果質(zhì)偏硬;‘海岸’(Gulfcoast)果實(shí)中粒,甜味較大;‘藍(lán)美1號(hào)’果粒呈圓球形、中等大小,有特殊香氣。

        Mv-3-O-gal、Mv-3-O-glc 美國(guó)Sigma-Aldrich公司;Dp-3-O-glc、Cy-3-O-gal、Cy-3-O-ara、Pt-3-O-gal、Pt-3-O-glc 北京索萊寶科技有限公司;Dp-3-O-ara、Pt-3-O-ara 上海吉至生化有限公司;Dp-3-O-gal、Pn-3-O-gal、Cy-3-O-glc 法國(guó)Extrasynthese公司;Mv-3-O-ara 上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司;乙腈(色譜純) 美國(guó)TEDIA試劑有限公司;磷酸(色譜純)阿拉丁試劑(上海)有限公司;Trolox 梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。其他試劑均為分析純。

        除此之外,隨著“一帶一路”建設(shè)的進(jìn)一步加深,惠臺(tái)政策80條也明確為臺(tái)商參與“一帶一路”建設(shè)指明了方向,在政策第三條中,明確指出要“支持符合條件的臺(tái)資企業(yè)項(xiàng)目納入廣西“一帶一路”重大項(xiàng)目?jī)?chǔ)備庫(kù),并優(yōu)先向國(guó)家“一帶一路”重大項(xiàng)目?jī)?chǔ)備庫(kù)推薦?!耙粠б宦贰苯ㄔO(shè)是習(xí)近平總書記在經(jīng)濟(jì)全球化背景下提出的“新絲綢之路經(jīng)濟(jì)帶”和“21世紀(jì)海上絲綢之路”的合作倡議,是依托于中國(guó)與相關(guān)國(guó)家開展的多邊機(jī)制的經(jīng)貿(mào)活動(dòng)?;菖_(tái)政策80條中為臺(tái)商參與“一帶一路”建設(shè)提供政策保障,不僅僅有利于兩岸經(jīng)貿(mào)往來(lái)的發(fā)展,更有利于提升中國(guó)在“一帶一路”建設(shè)中的戰(zhàn)略地位。

        1.2 儀器與設(shè)備

        1 2 0 0 高效液相色譜(h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y,H P L C)儀、X D B-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm) 美國(guó)安捷倫科技有限公司;TSQ Quantum HPLC-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用(electrospray ionization-mass spectrometry,ESI-MS)儀 美國(guó)Thermo- Fisher公司;Tristar LB 941微孔板多功能分析儀德國(guó)Berthold公司;KH7200DB數(shù)控超聲波處理設(shè)備昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;HZQ-F100恒溫培養(yǎng)箱太倉(cāng)市華美生化儀器廠。

        (2)教師要深入把控教學(xué)生成問(wèn)題?!爸参锏纳场币徽n中,教師采用了生物學(xué)中常用的對(duì)比學(xué)習(xí)法,對(duì)有性生殖和無(wú)性生殖兩種生殖方式在形成過(guò)程、遺傳特性、與母體的性狀一致性和后代個(gè)體變異等多個(gè)方面進(jìn)行對(duì)比的同時(shí),讓學(xué)生體會(huì)到兩種生殖方式各有利弊,從而知道:人們應(yīng)當(dāng)趨利避害,取長(zhǎng)補(bǔ)短,在植物不同的生命階段,采用不同的生殖方式以繁衍后代。在課堂中,教師還需分配更多時(shí)間、列舉更多例子來(lái)幫助學(xué)生分析和理解為了適應(yīng)環(huán)境以實(shí)現(xiàn)種族的繁衍,兩種生殖方式應(yīng)當(dāng)如何合理搭配應(yīng)用,將理論聯(lián)系生活實(shí)際,服務(wù)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。

        1.3 方法

        1.3.1 藍(lán)莓果花青素的提取

        由圖4可知,13 種花色苷均具備較好的抗氧化能力,在5 種花青素與3 種糖苷分別結(jié)合成的不同花色苷當(dāng)中,gal類花色苷的抗氧化能力顯著高于其他兩類,其中Pt-3-O-gal的抗氧化能力最強(qiáng),約為Pt-3-O-glc的6 倍;glc類花色苷的抗氧化能力低于ara類花色苷;相同糖苷的不同花青素之間抗氧化活性有一定的差異,但差異不大,推測(cè)藍(lán)莓果的抗氧化活性一方面由花色苷總含量決定;另一方面主要由gal類花色苷含量決定。

        土地承包有效期的迫近,導(dǎo)致土地流轉(zhuǎn)有效時(shí)期縮短,部分經(jīng)營(yíng)主體無(wú)法長(zhǎng)期轉(zhuǎn)入土地,潛在生產(chǎn)能力難以發(fā)揮出來(lái)。土地流轉(zhuǎn)的市場(chǎng)價(jià)格形成機(jī)制復(fù)雜,缺乏必要的制度性約束。久而久之,許多農(nóng)戶的轉(zhuǎn)入意愿難以實(shí)現(xiàn),土地規(guī)模經(jīng)營(yíng)及其一、二、三產(chǎn)業(yè)的融合都受到了嚴(yán)重制約。

        1.3.2 HPLC-ESI-MS鑒定藍(lán)莓花青素成分

        采用HPLC-ESI-MS法鑒定藍(lán)莓花青素[16]。分析柱為XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)。流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)6%甲酸(溶劑為超純水),流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)6%甲酸(溶劑為乙腈)。梯度洗脫:0~5 min,5% B;15~25 min,10% B;25~35 min,12% B;3 5 ~5 0 m i n,1 5% B;5 0 ~6 0 m i n,1 8% B;60~80 min,25% B;80 ~90 min,30% B。在陽(yáng)離子模式下,ESI毛細(xì)管電壓為3.0 kV,毛細(xì)管溫度為350 ℃。離子化時(shí)使用的1.5 L/min霧化氣體和10 L/min干燥氣體都是氮?dú)?。ESI的掃描范圍m/z100~1 200。

        1.3.3 HPLC測(cè)定藍(lán)莓花青素含量

        將1.3.1節(jié)中提取出的花青素用0.22 μm聚偏二氟乙烯膜過(guò)濾后,通過(guò)HPLC法測(cè)定得出13 種花色苷標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線[17],并測(cè)定各品種藍(lán)莓果花青素提取物中13 種花色苷的含量,1200 HPLC儀配置G1311A二元泵和G1315D二極管陣列檢測(cè)器,并采用C18色譜柱進(jìn)行分離。以體積分?jǐn)?shù)1.0%的磷酸緩沖液為流動(dòng)相A,以100%的乙腈為流動(dòng)相B。流速設(shè)置為0.6 mL/min,運(yùn)行柱溫為25 ℃,波長(zhǎng)設(shè)置520 nm。洗脫梯度與1.3.2節(jié)HPLC-ESI-MS所用的洗脫梯度相同。

        2016年7月在德國(guó)漢堡召開的ICME-13上有兩件大事值得一提,一是在會(huì)前的ICMI會(huì)員代表大會(huì)(General Assembly,GA)上,中國(guó)數(shù)學(xué)會(huì)推薦的候選人徐斌艷在九選五的差額選舉中當(dāng)選下一屆ICMI EC成員,這是中國(guó)的第五位EC成員,中國(guó)大陸第四位EC成員;二是在ICME-13開幕式上,中國(guó)香港大學(xué)梁貫成教授正式被授予弗賴登塔爾獎(jiǎng)(2013年度).

        整體看來(lái),A環(huán)與C環(huán)間夾角普遍較小,B環(huán)與C環(huán)間存在著12°~25°的微小轉(zhuǎn)角,推測(cè)C環(huán)對(duì)B環(huán)的影響要稍小于其對(duì)A環(huán)的影響。3 類糖苷類花色苷分子中,gal類花色苷在A環(huán)與C環(huán)、B環(huán)與C環(huán)間的夾角均呈現(xiàn)較大值,從而推測(cè)gal類花色苷分子各環(huán)間所形成的夾角更有助于電子解離。

        如果是為了穩(wěn)定,去做思想工作,那出發(fā)的前提就是老同志是不穩(wěn)定的因素是站在一個(gè)教育、對(duì)立的情緒上做思想工作。如果是“讓老同志幸?!保浅霭l(fā)的前提就是老同志的家里人,是穩(wěn)定的主力軍,是站在一個(gè)認(rèn)同的情緒上做工作。

        通過(guò)Gauss View 5.0軟件建立優(yōu)化分子模型,使用Gaussian 09 D.01軟件包在M062-x/6-311G*水平上對(duì)13 個(gè)分子進(jìn)行幾何結(jié)構(gòu)全優(yōu)化,相同水平下進(jìn)行了頻率分析確認(rèn)無(wú)虛頻,證明所得結(jié)構(gòu)為勢(shì)能面上的極小值點(diǎn),所得結(jié)構(gòu)為穩(wěn)定結(jié)構(gòu)[19]。幾何結(jié)構(gòu)參數(shù)基于此穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。能量計(jì)算也基于此穩(wěn)定結(jié)構(gòu),在M062-x/6-311++G**水平上對(duì)分子結(jié)構(gòu)參數(shù)、活性羥基BDE、IP及半醌式自由基自旋密度布局進(jìn)行計(jì)算。

        在計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)發(fā)展中存在很多問(wèn)題隱患,其中主要的一條就是信息網(wǎng)絡(luò)自身固有的局限性,這個(gè)局限性絕對(duì)是計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)安全隱患出現(xiàn)的重要原因之一。在信息網(wǎng)絡(luò)不斷發(fā)展的今天,各種信息技術(shù)被應(yīng)用在我們的周圍,很多企業(yè)和學(xué)校都實(shí)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)化辦公,政府部門也已經(jīng)開展了電子政務(wù),使得信息技術(shù)已經(jīng)成為我們生活中不可或缺的一部分。但是也正因?yàn)槿绱?,政府、企業(yè)和學(xué)校等都習(xí)慣在網(wǎng)絡(luò)中進(jìn)行一些信息的處理,由于網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)的開放性,使得一些重要的信息被他人盜取或者攔截,給計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)增加了極大的隱患,也給廣大計(jì)算機(jī)用戶們?cè)斐蓸O大的損失。

        利用ORAC法對(duì)藍(lán)莓花青素提取物及13 種花色苷標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行體外抗氧化能力測(cè)定[18]。將樣品用75 mmol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)(pH 7.4)進(jìn)行二倍稀釋,配制成100、50、25、12.5 μg/mL的溶液。取100 μL不同質(zhì)量濃度樣品待測(cè)液加入至96 微孔板上,同時(shí)另放不同濃度(0、2、4、8、16、32 μmol/L)Trolox標(biāo)準(zhǔn)品液(PBS配制)作對(duì)照。加入200 nmol/L的熒光素鈉50 μL,混合后于37 ℃反應(yīng)15 min,再于每孔中加入80 mmol/L 2,2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽50 μL,并迅速放入微孔板多功能分析儀中測(cè)定熒光值。設(shè)置參數(shù)為:激發(fā)波長(zhǎng)485 nm、發(fā)射波長(zhǎng)535 nm、溫度37 ℃、循環(huán)數(shù)100、循環(huán)周期60 s、熒光強(qiáng)度7 000。使用GraphPad Prism 6軟件計(jì)算熒光衰退曲線下面積(area under curve,AUC),樣品組的AUC(AUC樣品)與無(wú)樣品存在時(shí)(對(duì)照組)的AUC(AUC空白)之差為-net AUC(直線方程)。ORAC由樣品-net AUC與Trolox標(biāo)準(zhǔn)品-net AUC的斜率比得出,以每克樣品中所含的Trolox質(zhì)量表示,單位為μmol/g。

        1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

        所有數(shù)據(jù)均平行測(cè)量3 次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析和差異顯著性分析,其中差異顯著性分析采用t檢驗(yàn)。

        1.3.5 密度泛函理論計(jì)算方法

        2 結(jié)果與分析

        2.1 藍(lán)莓花青素組分鑒定及分析結(jié)果

        圖 2 4 種藍(lán)莓果中花青素的總含量Fig. 2 Total contents of anthocyanins in four blueberry varieties

        本實(shí)驗(yàn)室前期已對(duì)藍(lán)莓花青素單體化合物進(jìn)行了鑒定[20]。在藍(lán)莓提取物中檢測(cè)到13 種不同的花色苷,通過(guò)HPLC-ESI-MS的測(cè)定結(jié)果得出,藍(lán)莓花青素包括Dp、Cy、Pt、Pn和Mv,沒(méi)有檢測(cè)到天竺葵素。藍(lán)莓中最常見的己糖是半乳糖和葡萄糖,最常見的戊糖是阿拉伯糖。各個(gè)品種藍(lán)莓花青素單體鑒定結(jié)果一致,僅含量存在差異。之后通過(guò)HPLC法對(duì)4 個(gè)品種藍(lán)莓果中的花青素含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如圖2所示,4 種藍(lán)莓的花青素總含量由高到低順序?yàn)橐吧{(lán)莓>‘藍(lán)美1號(hào)’>‘海岸’>‘奧尼爾’,且存在顯著性差異(P<0.05)。

        學(xué)者們對(duì)母語(yǔ)在第二語(yǔ)言遷移中所起的作用的研究,可以幫助老師更清楚地認(rèn)識(shí)到學(xué)生產(chǎn)生偏誤及語(yǔ)言學(xué)習(xí)的難點(diǎn)和產(chǎn)生障礙的原因,及時(shí)幫助學(xué)生糾正錯(cuò)誤,避免再次發(fā)生類似的錯(cuò)誤,從而幫助老師更好地展開教學(xué),使學(xué)生更好、更快地掌握第二語(yǔ)言。

        表 1 4 種藍(lán)莓果中各花色苷含量Table 1 Contents of individual anthocyanins in four blueberry varieties

        由表1可以看出,4 個(gè)品種藍(lán)莓果中Mv-3-O-gal的含量均顯著高于其他12 種花色苷,且gal類花色苷含量均高于其他糖苷類花色苷。4 種藍(lán)莓花色苷含量均表現(xiàn)為Mv化合物最高,其次為Dp化合物和Pt化合物,Hosseinian等在野生藍(lán)莓中也發(fā)現(xiàn)各花青素中Mv衍生物的含量最高[21]?!畩W尼爾’中含有更多的?;ㄉ?,野生藍(lán)莓和海岸’的?;ㄉ蘸枯^少,而‘藍(lán)美1號(hào)’不含有?;ㄉ?。野生藍(lán)莓中花青素種類最為齊全,并且花青素總含量顯著高于其余3 種藍(lán)莓,其gal類花色苷的總含量也高于其余3 種藍(lán)莓;此外,‘海岸’中Cy-3-O-glc的含量高于其他品種。

        2.2 體外實(shí)驗(yàn)分析抗氧化能力結(jié)果

        由圖5中的分子優(yōu)化構(gòu)型及表2中的結(jié)構(gòu)參數(shù)可知,A環(huán)與C環(huán)間存在較小夾角,近似為共平面,但在不同糖苷類花青素之間存在細(xì)微差異。在13 種花色苷中,A環(huán)與C環(huán)間夾角大小均為gal類花色苷夾角最大,其次為ara類花色苷,glc類花色苷的夾角最小。B環(huán)連接在C環(huán)的C2位上,與O=C2雙鍵、C3位的O—R1、C4=C3雙鍵及A環(huán)形成了重要的共軛π鍵,能夠促使酚羥基在發(fā)生脫氫反應(yīng)時(shí)形成較為穩(wěn)定的半醌式自由基,從而提高抗氧化能力。從B環(huán)和C環(huán)的夾角來(lái)看,5 種花青素與3 種糖苷分別結(jié)合成的不同花色苷中夾角大小為gal類花色苷>ara類花色苷>glc類花色苷。

        圖 3 4 種藍(lán)莓果的抗氧化能力Fig. 3 Antioxidant capacity of four blueberry varieties

        ORAC法針對(duì)親水過(guò)氧基、親脂過(guò)氧基、羥基、過(guò)氧亞硝基和單線態(tài)氧5 種自由基進(jìn)行分析,是高效快速測(cè)定總抗氧化能力的方法[22],因此能夠通過(guò)ORAC法來(lái)測(cè)定藍(lán)莓果的抗氧化活性。如圖3所示,野生藍(lán)莓的抗氧化能力顯著高于其他3 個(gè)栽培品種,其ORAC約為‘藍(lán)美1號(hào)’的2 倍(P<0.05),約為‘海岸’、‘奧尼爾’的3 倍(P<0.05);‘藍(lán)美1號(hào)’的抗氧化能力相比‘海岸’與‘奧尼爾’較高,但這三者間并無(wú)顯著性差異,該結(jié)果與花青素總含量結(jié)果基本一致,野生藍(lán)莓的花青素總含量最高,其抗氧化活性也最強(qiáng)。已有研究采用清除DPPH自由基法對(duì)60 種藍(lán)莓花青素進(jìn)行抗氧化活性分析,結(jié)果表明藍(lán)莓花青素含量越高,其抗氧化能力則越強(qiáng)[23];還有研究發(fā)現(xiàn),野生品種藍(lán)莓的抗氧化活性明顯高于栽培品種藍(lán)莓[24],與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。

        2.2.2 13 種花色苷抗氧化活性

        我們基本兌現(xiàn)了“一卷《星火》在手,洞悉全國(guó)文壇”的承諾,也一直在踐行新人與名家并重、本省作者和外省作者兼顧的選稿方略。

        圖 4 13 種花色苷標(biāo)準(zhǔn)品的抗氧化能力Fig. 4 Antioxidant capacity of 13 anthocyanin standards

        藍(lán)莓花色素的提取參考文獻(xiàn)[15]的方法,取2 g新鮮藍(lán)莓果,研磨后加入體積分?jǐn)?shù)85%甲醇-0.5%甲酸提取溶劑,經(jīng)超聲(20 ℃、20 min、100 W)、離心(5 000 r/min、10 min)后取上清液得到藍(lán)莓花青素提取液。提取步驟重復(fù)3 次,提取溶劑體積加入量分別為20、20、10 mL。合并3 次提取液,于-20 ℃冰箱保存,用于后續(xù)檢測(cè)分析[15]。

        一般來(lái)說(shuō),花青素類化合物的抗氧化活性取決于其酚羥基的數(shù)目和位置,其酚羥基數(shù)目和位置直接影響了酚羥基脫氫反應(yīng)的難易程度[25],然而ORAC分析結(jié)果顯示不同類別的糖苷對(duì)花色苷抗氧化能力的影響更大,尤其是gal類抗氧化能力顯著增強(qiáng),為了進(jìn)一步解析不同基團(tuán)對(duì)藍(lán)莓花色苷抗氧化作用影響的機(jī)理,針對(duì)這13 種花色苷分子進(jìn)行了密度泛函理論計(jì)算。

        2.3 密度泛函理論計(jì)算分析抗氧化機(jī)理

        2.3.1 主要分子結(jié)構(gòu)參數(shù)

        2.2.1 4 種藍(lán)莓果抗氧化活性

        圖 5 13 種花色苷的優(yōu)化構(gòu)型Fig. 5 Optimal configurations of 13 anthocyanins

        1.3.4 體外抗氧化能力測(cè)定

        通過(guò)分子價(jià)鍵理論可知,同種類型化學(xué)鍵的鍵長(zhǎng)越長(zhǎng),其鍵能越小,該鍵更容易斷裂,則其反應(yīng)活性越強(qiáng)[26]。對(duì)于花青素類化合物而言,其抗氧化能力的強(qiáng)弱由環(huán)上的酚羥基同自由基發(fā)生脫氫反應(yīng)的難易程度以及脫氫后所形成自由基的穩(wěn)定性來(lái)決定[27],因此,酚羥基的數(shù)量和存在位置是影響花青素類化合物抗氧化能力的重要指標(biāo)。如表2所示,A環(huán)上C7位的酚羥基鍵長(zhǎng)近似相等,而C5位酚羥基的鍵長(zhǎng)中,均為gal類花色苷的鍵長(zhǎng)最大,其次為ara類花色苷,而glc類花色苷的鍵長(zhǎng)較小,且gal類花色苷的鍵長(zhǎng)普遍大于同種花色苷分子中C4’位活性酚羥基的鍵長(zhǎng);B環(huán)上相同位置(C3’、C4’、C5’處)的酚羥基鍵長(zhǎng)近似相同,其中C3’位酚羥基的鍵長(zhǎng)最小,C4’位酚羥基的鍵長(zhǎng)最大,并且在C4’位呈現(xiàn)出gal類花色苷的鍵長(zhǎng)最大,其次為ara類花色苷,glc類花色苷的鍵長(zhǎng)最小的規(guī)律。在C環(huán)C3位所連糖苷處,各類花色苷中的二級(jí)羥基與C4’位活性酚羥基形成氫鍵(glc)或產(chǎn)生斥力(gal),對(duì)脫氫反應(yīng)抑制或促進(jìn)作用[28];對(duì)于Pt-3-O-gal,C3’位的甲氧基也可能對(duì)C4’位酚羥基產(chǎn)生活化作用,進(jìn)一步促進(jìn)其發(fā)生脫氫反應(yīng),使得Pt-3-O-gal的抗氧化能力最強(qiáng)[29]。

        表 2 13 種花色苷分子的主要結(jié)構(gòu)參數(shù)Table 2 Major structural parameters of 13 anthocyanins

        綜合看來(lái),13 種花色苷分子中B環(huán)上C4’處酚羥基的鍵長(zhǎng)普遍較長(zhǎng),可推斷該處反應(yīng)活性最強(qiáng),其次為A環(huán)上C5處酚羥基,其反應(yīng)活性也較強(qiáng),因此13 種花青素的抗氧化能力由強(qiáng)到弱的順序?yàn)間al類花色苷>ara類花色苷>glc類花色苷,與ORAC實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

        在我們?nèi)A夏民族悠久的陶瓷文化歷史里,各式各樣的陶瓷作品層出不窮,其中各種彩類更是五花八門。而生活陶藝也是眾多陶瓷作品中的一種,也是離普通老板姓接觸最多的一種。據(jù)考證,在江西省萬(wàn)年仙人洞中,就有考古學(xué)家發(fā)現(xiàn)過(guò)遠(yuǎn)古時(shí)期的生活陶藝殘片,在這些殘片周圍還留下木炭化石的痕跡,可以斷定這就是曾經(jīng)生活在這里的遠(yuǎn)古人生活中儲(chǔ)存食物的器皿。而另一種時(shí)代久遠(yuǎn)的生活陶藝就是——彩陶,我們現(xiàn)在還能在博物館里看到我們祖先所留下的這種文化遺產(chǎn),這種彩陶出現(xiàn)在我國(guó)黃河流域。

        2.3.2 活性羥基BDE

        酚羥基BDE是一種能夠用來(lái)衡量清除自由基活性的理論參數(shù),酚羥基BDE越小,羥基鍵越弱,越容易失去酚羥基上的氫,那么可以說(shuō)明其抗氧化活性越高[30]。有研究表明,花青素分子B環(huán)上C4’處酚羥基的活性最強(qiáng),A環(huán)上C5處酚羥基的活性次強(qiáng)[31],并且由鍵長(zhǎng)計(jì)算得出,C4’位與C5位的鍵長(zhǎng)最大,故對(duì)C4’位和C5位的酚羥基BDE進(jìn)行計(jì)算。

        表 3 13 種花色苷活性羥基BDETable 3 Hydroxyl dissociation energy of 13 anthocyanins at active positions

        由表3可知,在活性最強(qiáng)的C4’位酚羥基處,Cy的3 種糖苷化合物及Pn-3-O-gal的BDE普遍大于其余種類花青素類化合物,而Pt的3 種糖苷化合物的BDE普遍小于其余種類花青素類化合物,這表明Cy類花色苷的抗氧化活性在5 種花青素類化合物中呈現(xiàn)較弱狀態(tài),而Pt類花色苷的抗氧化活性較強(qiáng)。此外Pt-3-O-gal的BDE僅為251.21 kJ/mol,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他花青素類化合物的BDE,從而推斷Pt-3-O-gal在13 種花色苷中的抗氧化活性最強(qiáng)。這可能是由于Cy類化合物分子的C4’與C3’處羥基形成內(nèi)氫鍵,不利于C4’位酚羥基的解離,使得C4’位羥基BDE增大,活性降低[32];而Pn-3-O-gal可能由于C4’位羥基的鄰位甲氧基位阻效應(yīng)使其反應(yīng)幾率降低,但甲氧基為兩性基團(tuán),也可使鄰位羥基活化,從而促使Pt類花色苷的BDE減小,使其抗氧化活性增強(qiáng)[33]。C5位酚羥基的BDE普遍大于C4’位酚羥基的BDE,但其整體差別不大。

        這5 類花青素分別與3 種糖苷結(jié)合后,活性最強(qiáng)的酚羥基(C4’位)BDE均為:gal類花色苷<ara類花色苷<glc類花色苷,即gal類花色苷的抗氧化活性最高,其次為ara類花色苷,glc類花色苷活性最弱,與ORAC實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

        2.3.3 IP及半醌式自由基自旋密度分布

        表 4 13 種花色苷失去電子所需能量(IP)Table 4 Energy required for electron loss (ionization potential) in 13 anthocyanins

        單電子轉(zhuǎn)移途徑也能夠說(shuō)明物質(zhì)的抗氧化能力,可通過(guò)IP反映的單電子轉(zhuǎn)移途徑來(lái)對(duì)物質(zhì)的抗氧化能力進(jìn)行預(yù)測(cè),IP越低,說(shuō)明該物質(zhì)的給電能力越強(qiáng),即抗氧化能力越強(qiáng)[34]。如表4所示,5 類花青素化合物中IP均為gal類花色苷<ara類花色苷<glc類花色苷,說(shuō)明gal類花色苷的抗氧化活性最強(qiáng),其次為ara類花色苷,glc類花色苷的活性最弱,且Pt-3-O-gal的IP最低,僅為484.51 kJ/mol,說(shuō)明Pt-3-O-gal的抗氧化能力最高,與ORAC分析結(jié)果一致。其中Mv及Pt的3 類糖苷化合物的IP普遍小于其他花青素類化合物,推測(cè)Mv類糖苷化合物和Pt類糖苷化合物的抗氧化活性較強(qiáng)。

        半醌式自由基的自旋密度分布也是衡量物質(zhì)抗氧化活性的一項(xiàng)重要指標(biāo),有研究指出,半醌式自由基的自旋密度分布越離散,自由基就越穩(wěn)定,抗氧化活性也就相對(duì)更強(qiáng)[35]。由表5可知,13 種花色苷中,在C5位的酚羥基失去氫原子后的自旋密度分布差別較小,數(shù)值接近0,推測(cè)由于其脫氫能力較C4’位酚羥基偏弱,脫氫幾率偏小,難以形成半醌式自由基;而在C4’位酚羥基失去氫原子后自旋密度較為分散,且數(shù)值均為gal類花色苷<ara類花色苷<glc類花色苷,并且Pt-3-O-gal的半醌式自由基自旋密度分布最小,僅為0.032 78,故推斷在13 種花色苷中,Pt-3-O-gal的抗氧化能力最強(qiáng),并且gal類花青素的抗氧化活性均強(qiáng)于其他兩類,其次為ara類花青素,glc類花青素的活性最弱,與ORAC實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。

        表 5 13 種花色苷失去重要位置酚羥基氫原子后的自旋密度分布Table 5 Spin density distribution of 13 anthocyanins after loss of phenolic hydroxyl hydrogen atoms

        綜合上述結(jié)果得知,‘海岸’的花青素總含量略高于‘奧尼爾’,但其抗氧化能力卻略低,推測(cè)是由于‘奧尼爾’中Pt-3-O-gal的含量明顯高于‘海岸’,而經(jīng)理論計(jì)算及ORAC測(cè)定均顯示Pt-3-O-gal是13 種花色苷中抗氧化能力最強(qiáng)的花色苷,從而導(dǎo)致‘奧尼爾’中花青素總量雖略低于‘海岸’,但其抗氧化能力卻略高;此外,‘奧尼爾’中含有更多的?;ㄉ?,而?;ㄉ沼锌赡芴岣咂淇寡趸芰Α1容^4 種藍(lán)莓果的花青素含量還可以發(fā)現(xiàn),抗氧化能力最低的‘海岸’中Cy-3-O-glc的含量高于其他品種,而通過(guò)理論計(jì)算及ORAC測(cè)定可得出Cy-3-O-glc的抗氧化能力偏弱,可能影響其總抗氧化能力。

        3 結(jié) 論

        通過(guò)對(duì)比4 種藍(lán)莓果(野生藍(lán)莓、‘海岸’、‘奧尼爾’、‘藍(lán)美1號(hào)’)花青素提取物的HPLC定量分析和體外ORAC實(shí)驗(yàn)結(jié)果,發(fā)現(xiàn)不同品種藍(lán)莓間花青素含量、抗氧化能力存在差異。通過(guò)對(duì)分子結(jié)構(gòu)參數(shù)、酚羥基BDE、IP以及半醌式自由基自旋密度分布的計(jì)算得知,藍(lán)莓果花青素提取物抗氧化能力強(qiáng)弱與花青素總量、gal類花色苷含量、Pt-3-O-gal含量及?;ㄉ蘸棵芮邢嚓P(guān),推斷出藍(lán)莓花色苷中,gal類花色苷的抗氧化能力最強(qiáng),其次是ara類花色苷,而glc類花色苷的抗氧化能力相對(duì)較弱;Pt-3-O-gal在13 種花色苷中抗氧化能力最強(qiáng);此外闡明了花色苷抗氧化能力的構(gòu)效關(guān)系,糖苷種類對(duì)花色苷抗氧化能力影響更顯著。13 種花色苷在ORAC體外抗氧化實(shí)驗(yàn)及理論計(jì)算中均呈現(xiàn)出一致結(jié)果,這為花色苷類化合物抗氧化能力的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供了理論依據(jù)。

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