王蘭嬌，李大婧，張良聰，柴 智，何偉偉，黃午陽(yáng),3,*，包怡紅，張鐘元

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；3.江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014）

藍(lán)莓（Vacciniumspp.）為杜鵑花科越橘屬的代表植物[1]，除富含常見的糖、酸、VC、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還含有超氧化物歧化酶、熊果苷、花青素等特殊功能成分[2-3]。藍(lán)莓中的花青素含量十分豐富，花青素屬于黃酮類化合物，是一種有益于人體健康的抗氧化物質(zhì)，具有清除細(xì)胞中自由基、調(diào)節(jié)人體機(jī)能、預(yù)防心血管疾病、加速視網(wǎng)膜的合成與再生以及抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等重要功效[4-5]。黃酮類化合物首要的活性功能就是抗氧化能力，藍(lán)莓果實(shí)中的花青素是最豐富的抗氧化劑來(lái)源之一[6-7]。研究表明，花青素是目前發(fā)現(xiàn)的最高效的天然抗氧化劑，它的抗氧化能力約為VE的50 倍、VC的20 倍[8]，而其抗氧化能力主要與分子中酚羥基結(jié)構(gòu)存在不可分割的關(guān)聯(lián)[9]。

標(biāo)準(zhǔn)體系是標(biāo)準(zhǔn)分類管理的重要依據(jù)。根據(jù)《測(cè)繪標(biāo)準(zhǔn)體系》（2017修訂版），按定義與描述、獲取與處理、成果、應(yīng)用服務(wù)、檢驗(yàn)與測(cè)試和管理六大類36小類對(duì)測(cè)繪標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類管理［3］。

天然黃酮類化合物以游離或苷類的形式存在于自然界，而花青素與其他黃酮類化合物相比，最明顯的差別在于它的分子中含有氧正離子，并且在4位沒(méi)有羰基取代，根據(jù)B環(huán)各個(gè)碳位上的取代基不相同，形成了不同的花青素。目前已知自然界中有23 種花青素[10]，其中矢車菊素（cyanidin，Cy）、飛燕草素（delphinidin，Dp）、矮牽牛素（petunidin，Pt）、芍藥素（peonidin，Pn）、錦葵色素（malvidin，Mv）、天竺葵素（pelargonidin，Pg）6 種花青素常見于一般天然植物中[11]，而藍(lán)莓果實(shí)中的花青素通常由除天竺葵素以外的其他5 種花青素組成[12]，并分別與葡萄糖苷（glucose，glc）、半乳糖苷（galactose，gal）、阿拉伯糖苷（arabinose，ara）相結(jié)合，形成不同的藍(lán)莓花色苷[13]。

藍(lán)莓花色苷的抗氧化作用主要依靠酚羥基的脫氫反應(yīng)來(lái)完成，酚羥基脫去氫原子并同自由基反應(yīng)，在消除自由基后形成共振穩(wěn)定的半醌式自由基結(jié)構(gòu)，進(jìn)而按序終止自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[14]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）實(shí)驗(yàn)分析了13 種花色苷及不同品種藍(lán)莓花青素提取物的體外抗氧化活性，測(cè)定了藍(lán)莓花青素提取物中花色苷的組成成分與含量，并通過(guò)密度泛函理論對(duì)花色苷主要幾何結(jié)構(gòu)參數(shù)、酚羥基的解離能（bond dissociation energy，BDE）、電離勢(shì)（ionization potential，IP）及半醌式自由基的自旋密度分布等進(jìn)行計(jì)算分析，從而解析花色苷的抗氧化機(jī)理，對(duì)藍(lán)莓花色苷進(jìn)一步研究和利用提供有利參考。13 種花色苷分子結(jié)構(gòu)與花青素母核結(jié)構(gòu)見圖1。

圖 1 13 種花色苷的分子結(jié)構(gòu)及花青素母核結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structures of 13 anthocyanins and basic structure of anthocyanindin

1 材料與方法

1.1 原料及材料

藍(lán)莓‘US12’為野生種Vaccinium darrowi，采自江蘇省南京市中山植物園，果皮顏色較深，果粒較??；其余3 種均為南高叢藍(lán)莓，產(chǎn)自浙江諸暨，‘奧尼爾’（O’neal）果實(shí)粒大，果質(zhì)偏硬；‘海岸’（Gulfcoast）果實(shí)中粒，甜味較大；‘藍(lán)美1號(hào)’果粒呈圓球形、中等大小，有特殊香氣。

Mv-3-O-gal、Mv-3-O-glc 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；Dp-3-O-glc、Cy-3-O-gal、Cy-3-O-ara、Pt-3-O-gal、Pt-3-O-glc 北京索萊寶科技有限公司；Dp-3-O-ara、Pt-3-O-ara 上海吉至生化有限公司；Dp-3-O-gal、Pn-3-O-gal、Cy-3-O-glc 法國(guó)Extrasynthese公司；Mv-3-O-ara 上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司；乙腈（色譜純） 美國(guó)TEDIA試劑有限公司；磷酸（色譜純）阿拉丁試劑（上海）有限公司；Trolox 梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司。其他試劑均為分析純。

除此之外，隨著“一帶一路”建設(shè)的進(jìn)一步加深，惠臺(tái)政策80條也明確為臺(tái)商參與“一帶一路”建設(shè)指明了方向，在政策第三條中，明確指出要“支持符合條件的臺(tái)資企業(yè)項(xiàng)目納入廣西“一帶一路”重大項(xiàng)目?jī)?chǔ)備庫(kù)，并優(yōu)先向國(guó)家“一帶一路”重大項(xiàng)目?jī)?chǔ)備庫(kù)推薦?！耙粠б宦贰苯ㄔO(shè)是習(xí)近平總書記在經(jīng)濟(jì)全球化背景下提出的“新絲綢之路經(jīng)濟(jì)帶”和“21世紀(jì)海上絲綢之路”的合作倡議，是依托于中國(guó)與相關(guān)國(guó)家開展的多邊機(jī)制的經(jīng)貿(mào)活動(dòng)?；菖_(tái)政策80條中為臺(tái)商參與“一帶一路”建設(shè)提供政策保障，不僅僅有利于兩岸經(jīng)貿(mào)往來(lái)的發(fā)展，更有利于提升中國(guó)在“一帶一路”建設(shè)中的戰(zhàn)略地位。

1.2 儀器與設(shè)備

1 2 0 0 高效液相色譜（h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y，H P L C）儀、X D B-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） 美國(guó)安捷倫科技有限公司；TSQ Quantum HPLC-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用（electrospray ionization-mass spectrometry，ESI-MS）儀 美國(guó)Thermo- Fisher公司；Tristar LB 941微孔板多功能分析儀德國(guó)Berthold公司；KH7200DB數(shù)控超聲波處理設(shè)備昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；HZQ-F100恒溫培養(yǎng)箱太倉(cāng)市華美生化儀器廠。

（2）教師要深入把控教學(xué)生成問(wèn)題?！爸参锏纳场币徽n中，教師采用了生物學(xué)中常用的對(duì)比學(xué)習(xí)法，對(duì)有性生殖和無(wú)性生殖兩種生殖方式在形成過(guò)程、遺傳特性、與母體的性狀一致性和后代個(gè)體變異等多個(gè)方面進(jìn)行對(duì)比的同時(shí)，讓學(xué)生體會(huì)到兩種生殖方式各有利弊，從而知道：人們應(yīng)當(dāng)趨利避害，取長(zhǎng)補(bǔ)短，在植物不同的生命階段，采用不同的生殖方式以繁衍后代。在課堂中，教師還需分配更多時(shí)間、列舉更多例子來(lái)幫助學(xué)生分析和理解為了適應(yīng)環(huán)境以實(shí)現(xiàn)種族的繁衍，兩種生殖方式應(yīng)當(dāng)如何合理搭配應(yīng)用，將理論聯(lián)系生活實(shí)際，服務(wù)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 藍(lán)莓果花青素的提取

由圖4可知，13 種花色苷均具備較好的抗氧化能力，在5 種花青素與3 種糖苷分別結(jié)合成的不同花色苷當(dāng)中，gal類花色苷的抗氧化能力顯著高于其他兩類，其中Pt-3-O-gal的抗氧化能力最強(qiáng)，約為Pt-3-O-glc的6 倍；glc類花色苷的抗氧化能力低于ara類花色苷；相同糖苷的不同花青素之間抗氧化活性有一定的差異，但差異不大，推測(cè)藍(lán)莓果的抗氧化活性一方面由花色苷總含量決定；另一方面主要由gal類花色苷含量決定。

土地承包有效期的迫近，導(dǎo)致土地流轉(zhuǎn)有效時(shí)期縮短，部分經(jīng)營(yíng)主體無(wú)法長(zhǎng)期轉(zhuǎn)入土地，潛在生產(chǎn)能力難以發(fā)揮出來(lái)。土地流轉(zhuǎn)的市場(chǎng)價(jià)格形成機(jī)制復(fù)雜，缺乏必要的制度性約束。久而久之，許多農(nóng)戶的轉(zhuǎn)入意愿難以實(shí)現(xiàn)，土地規(guī)模經(jīng)營(yíng)及其一、二、三產(chǎn)業(yè)的融合都受到了嚴(yán)重制約。

1.3.2 HPLC-ESI-MS鑒定藍(lán)莓花青素成分

采用HPLC-ESI-MS法鑒定藍(lán)莓花青素[16]。分析柱為XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)6%甲酸（溶劑為超純水），流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)6%甲酸（溶劑為乙腈）。梯度洗脫：0～5 min，5% B；15～25 min，10% B；25～35 min，12% B；3 5 ～5 0 m i n，1 5% B；5 0 ～6 0 m i n，1 8% B；60～80 min，25% B；80 ～90 min，30% B。在陽(yáng)離子模式下，ESI毛細(xì)管電壓為3.0 kV，毛細(xì)管溫度為350 ℃。離子化時(shí)使用的1.5 L/min霧化氣體和10 L/min干燥氣體都是氮?dú)?。ESI的掃描范圍m/z100～1 200。

1.3.3 HPLC測(cè)定藍(lán)莓花青素含量

將1.3.1節(jié)中提取出的花青素用0.22 μm聚偏二氟乙烯膜過(guò)濾后，通過(guò)HPLC法測(cè)定得出13 種花色苷標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線[17]，并測(cè)定各品種藍(lán)莓果花青素提取物中13 種花色苷的含量，1200 HPLC儀配置G1311A二元泵和G1315D二極管陣列檢測(cè)器，并采用C18色譜柱進(jìn)行分離。以體積分?jǐn)?shù)1.0%的磷酸緩沖液為流動(dòng)相A，以100%的乙腈為流動(dòng)相B。流速設(shè)置為0.6 mL/min，運(yùn)行柱溫為25 ℃，波長(zhǎng)設(shè)置520 nm。洗脫梯度與1.3.2節(jié)HPLC-ESI-MS所用的洗脫梯度相同。

2016年7月在德國(guó)漢堡召開的ICME-13上有兩件大事值得一提，一是在會(huì)前的ICMI會(huì)員代表大會(huì)（General Assembly，GA）上，中國(guó)數(shù)學(xué)會(huì)推薦的候選人徐斌艷在九選五的差額選舉中當(dāng)選下一屆ICMI EC成員，這是中國(guó)的第五位EC成員，中國(guó)大陸第四位EC成員；二是在ICME-13開幕式上，中國(guó)香港大學(xué)梁貫成教授正式被授予弗賴登塔爾獎(jiǎng)（2013年度）．

整體看來(lái)，A環(huán)與C環(huán)間夾角普遍較小，B環(huán)與C環(huán)間存在著12°～25°的微小轉(zhuǎn)角，推測(cè)C環(huán)對(duì)B環(huán)的影響要稍小于其對(duì)A環(huán)的影響。3 類糖苷類花色苷分子中，gal類花色苷在A環(huán)與C環(huán)、B環(huán)與C環(huán)間的夾角均呈現(xiàn)較大值，從而推測(cè)gal類花色苷分子各環(huán)間所形成的夾角更有助于電子解離。

如果是為了穩(wěn)定，去做思想工作，那出發(fā)的前提就是老同志是不穩(wěn)定的因素是站在一個(gè)教育、對(duì)立的情緒上做思想工作。如果是“讓老同志幸?！保浅霭l(fā)的前提就是老同志的家里人，是穩(wěn)定的主力軍，是站在一個(gè)認(rèn)同的情緒上做工作。

通過(guò)Gauss View 5.0軟件建立優(yōu)化分子模型，使用Gaussian 09 D.01軟件包在M062-x/6-311G*水平上對(duì)13 個(gè)分子進(jìn)行幾何結(jié)構(gòu)全優(yōu)化，相同水平下進(jìn)行了頻率分析確認(rèn)無(wú)虛頻，證明所得結(jié)構(gòu)為勢(shì)能面上的極小值點(diǎn)，所得結(jié)構(gòu)為穩(wěn)定結(jié)構(gòu)[19]。幾何結(jié)構(gòu)參數(shù)基于此穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。能量計(jì)算也基于此穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，在M062-x/6-311++G**水平上對(duì)分子結(jié)構(gòu)參數(shù)、活性羥基BDE、IP及半醌式自由基自旋密度布局進(jìn)行計(jì)算。

在計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)發(fā)展中存在很多問(wèn)題隱患，其中主要的一條就是信息網(wǎng)絡(luò)自身固有的局限性，這個(gè)局限性絕對(duì)是計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)安全隱患出現(xiàn)的重要原因之一。在信息網(wǎng)絡(luò)不斷發(fā)展的今天，各種信息技術(shù)被應(yīng)用在我們的周圍，很多企業(yè)和學(xué)校都實(shí)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)化辦公，政府部門也已經(jīng)開展了電子政務(wù)，使得信息技術(shù)已經(jīng)成為我們生活中不可或缺的一部分。但是也正因?yàn)槿绱?，政府、企業(yè)和學(xué)校等都習(xí)慣在網(wǎng)絡(luò)中進(jìn)行一些信息的處理，由于網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)的開放性，使得一些重要的信息被他人盜取或者攔截，給計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)增加了極大的隱患，也給廣大計(jì)算機(jī)用戶們?cè)斐蓸O大的損失。

利用ORAC法對(duì)藍(lán)莓花青素提取物及13 種花色苷標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行體外抗氧化能力測(cè)定[18]。將樣品用75 mmol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.4）進(jìn)行二倍稀釋，配制成100、50、25、12.5 μg/mL的溶液。取100 μL不同質(zhì)量濃度樣品待測(cè)液加入至96 微孔板上，同時(shí)另放不同濃度（0、2、4、8、16、32 μmol/L）Trolox標(biāo)準(zhǔn)品液（PBS配制）作對(duì)照。加入200 nmol/L的熒光素鈉50 μL，混合后于37 ℃反應(yīng)15 min，再于每孔中加入80 mmol/L 2,2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽50 μL，并迅速放入微孔板多功能分析儀中測(cè)定熒光值。設(shè)置參數(shù)為：激發(fā)波長(zhǎng)485 nm、發(fā)射波長(zhǎng)535 nm、溫度37 ℃、循環(huán)數(shù)100、循環(huán)周期60 s、熒光強(qiáng)度7 000。使用GraphPad Prism 6軟件計(jì)算熒光衰退曲線下面積（area under curve，AUC），樣品組的AUC（AUC樣品）與無(wú)樣品存在時(shí)（對(duì)照組）的AUC（AUC空白）之差為-net AUC（直線方程）。ORAC由樣品-net AUC與Trolox標(biāo)準(zhǔn)品-net AUC的斜率比得出，以每克樣品中所含的Trolox質(zhì)量表示，單位為μmol/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)均平行測(cè)量3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析和差異顯著性分析，其中差異顯著性分析采用t檢驗(yàn)。

1.3.5 密度泛函理論計(jì)算方法

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓花青素組分鑒定及分析結(jié)果

圖 2 4 種藍(lán)莓果中花青素的總含量Fig. 2 Total contents of anthocyanins in four blueberry varieties

本實(shí)驗(yàn)室前期已對(duì)藍(lán)莓花青素單體化合物進(jìn)行了鑒定[20]。在藍(lán)莓提取物中檢測(cè)到13 種不同的花色苷，通過(guò)HPLC-ESI-MS的測(cè)定結(jié)果得出，藍(lán)莓花青素包括Dp、Cy、Pt、Pn和Mv，沒(méi)有檢測(cè)到天竺葵素。藍(lán)莓中最常見的己糖是半乳糖和葡萄糖，最常見的戊糖是阿拉伯糖。各個(gè)品種藍(lán)莓花青素單體鑒定結(jié)果一致，僅含量存在差異。之后通過(guò)HPLC法對(duì)4 個(gè)品種藍(lán)莓果中的花青素含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如圖2所示，4 種藍(lán)莓的花青素總含量由高到低順序?yàn)橐吧{(lán)莓＞‘藍(lán)美1號(hào)’＞‘海岸’＞‘奧尼爾’，且存在顯著性差異（P＜0.05）。

學(xué)者們對(duì)母語(yǔ)在第二語(yǔ)言遷移中所起的作用的研究，可以幫助老師更清楚地認(rèn)識(shí)到學(xué)生產(chǎn)生偏誤及語(yǔ)言學(xué)習(xí)的難點(diǎn)和產(chǎn)生障礙的原因，及時(shí)幫助學(xué)生糾正錯(cuò)誤，避免再次發(fā)生類似的錯(cuò)誤，從而幫助老師更好地展開教學(xué)，使學(xué)生更好、更快地掌握第二語(yǔ)言。

表 1 4 種藍(lán)莓果中各花色苷含量Table 1 Contents of individual anthocyanins in four blueberry varieties

由表1可以看出，4 個(gè)品種藍(lán)莓果中Mv-3-O-gal的含量均顯著高于其他12 種花色苷，且gal類花色苷含量均高于其他糖苷類花色苷。4 種藍(lán)莓花色苷含量均表現(xiàn)為Mv化合物最高，其次為Dp化合物和Pt化合物，Hosseinian等在野生藍(lán)莓中也發(fā)現(xiàn)各花青素中Mv衍生物的含量最高[21]?！畩W尼爾’中含有更多的?；ㄉ?，野生藍(lán)莓和海岸’的?；ㄉ蘸枯^少，而‘藍(lán)美1號(hào)’不含有?；ㄉ?。野生藍(lán)莓中花青素種類最為齊全，并且花青素總含量顯著高于其余3 種藍(lán)莓，其gal類花色苷的總含量也高于其余3 種藍(lán)莓；此外，‘海岸’中Cy-3-O-glc的含量高于其他品種。

2.2 體外實(shí)驗(yàn)分析抗氧化能力結(jié)果

由圖5中的分子優(yōu)化構(gòu)型及表2中的結(jié)構(gòu)參數(shù)可知，A環(huán)與C環(huán)間存在較小夾角，近似為共平面，但在不同糖苷類花青素之間存在細(xì)微差異。在13 種花色苷中，A環(huán)與C環(huán)間夾角大小均為gal類花色苷夾角最大，其次為ara類花色苷，glc類花色苷的夾角最小。B環(huán)連接在C環(huán)的C2位上，與O＝C2雙鍵、C3位的O—R1、C4＝C3雙鍵及A環(huán)形成了重要的共軛π鍵，能夠促使酚羥基在發(fā)生脫氫反應(yīng)時(shí)形成較為穩(wěn)定的半醌式自由基，從而提高抗氧化能力。從B環(huán)和C環(huán)的夾角來(lái)看，5 種花青素與3 種糖苷分別結(jié)合成的不同花色苷中夾角大小為gal類花色苷＞ara類花色苷＞glc類花色苷。

圖 3 4 種藍(lán)莓果的抗氧化能力Fig. 3 Antioxidant capacity of four blueberry varieties

ORAC法針對(duì)親水過(guò)氧基、親脂過(guò)氧基、羥基、過(guò)氧亞硝基和單線態(tài)氧5 種自由基進(jìn)行分析，是高效快速測(cè)定總抗氧化能力的方法[22]，因此能夠通過(guò)ORAC法來(lái)測(cè)定藍(lán)莓果的抗氧化活性。如圖3所示，野生藍(lán)莓的抗氧化能力顯著高于其他3 個(gè)栽培品種，其ORAC約為‘藍(lán)美1號(hào)’的2 倍（P＜0.05），約為‘海岸’、‘奧尼爾’的3 倍（P＜0.05）；‘藍(lán)美1號(hào)’的抗氧化能力相比‘海岸’與‘奧尼爾’較高，但這三者間并無(wú)顯著性差異，該結(jié)果與花青素總含量結(jié)果基本一致，野生藍(lán)莓的花青素總含量最高，其抗氧化活性也最強(qiáng)。已有研究采用清除DPPH自由基法對(duì)60 種藍(lán)莓花青素進(jìn)行抗氧化活性分析，結(jié)果表明藍(lán)莓花青素含量越高，其抗氧化能力則越強(qiáng)[23]；還有研究發(fā)現(xiàn)，野生品種藍(lán)莓的抗氧化活性明顯高于栽培品種藍(lán)莓[24]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。

2.2.2 13 種花色苷抗氧化活性

我們基本兌現(xiàn)了“一卷《星火》在手，洞悉全國(guó)文壇”的承諾，也一直在踐行新人與名家并重、本省作者和外省作者兼顧的選稿方略。

圖 4 13 種花色苷標(biāo)準(zhǔn)品的抗氧化能力Fig. 4 Antioxidant capacity of 13 anthocyanin standards

藍(lán)莓花色素的提取參考文獻(xiàn)[15]的方法，取2 g新鮮藍(lán)莓果，研磨后加入體積分?jǐn)?shù)85%甲醇-0.5%甲酸提取溶劑，經(jīng)超聲（20 ℃、20 min、100 W）、離心（5 000 r/min、10 min）后取上清液得到藍(lán)莓花青素提取液。提取步驟重復(fù)3 次，提取溶劑體積加入量分別為20、20、10 mL。合并3 次提取液，于-20 ℃冰箱保存，用于后續(xù)檢測(cè)分析[15]。

一般來(lái)說(shuō)，花青素類化合物的抗氧化活性取決于其酚羥基的數(shù)目和位置，其酚羥基數(shù)目和位置直接影響了酚羥基脫氫反應(yīng)的難易程度[25]，然而ORAC分析結(jié)果顯示不同類別的糖苷對(duì)花色苷抗氧化能力的影響更大，尤其是gal類抗氧化能力顯著增強(qiáng)，為了進(jìn)一步解析不同基團(tuán)對(duì)藍(lán)莓花色苷抗氧化作用影響的機(jī)理，針對(duì)這13 種花色苷分子進(jìn)行了密度泛函理論計(jì)算。

2.3 密度泛函理論計(jì)算分析抗氧化機(jī)理

2.3.1 主要分子結(jié)構(gòu)參數(shù)

2.2.1 4 種藍(lán)莓果抗氧化活性

圖 5 13 種花色苷的優(yōu)化構(gòu)型Fig. 5 Optimal configurations of 13 anthocyanins

1.3.4 體外抗氧化能力測(cè)定

通過(guò)分子價(jià)鍵理論可知，同種類型化學(xué)鍵的鍵長(zhǎng)越長(zhǎng)，其鍵能越小，該鍵更容易斷裂，則其反應(yīng)活性越強(qiáng)[26]。對(duì)于花青素類化合物而言，其抗氧化能力的強(qiáng)弱由環(huán)上的酚羥基同自由基發(fā)生脫氫反應(yīng)的難易程度以及脫氫后所形成自由基的穩(wěn)定性來(lái)決定[27]，因此，酚羥基的數(shù)量和存在位置是影響花青素類化合物抗氧化能力的重要指標(biāo)。如表2所示，A環(huán)上C7位的酚羥基鍵長(zhǎng)近似相等，而C5位酚羥基的鍵長(zhǎng)中，均為gal類花色苷的鍵長(zhǎng)最大，其次為ara類花色苷，而glc類花色苷的鍵長(zhǎng)較小，且gal類花色苷的鍵長(zhǎng)普遍大于同種花色苷分子中C4’位活性酚羥基的鍵長(zhǎng)；B環(huán)上相同位置（C3’、C4’、C5’處）的酚羥基鍵長(zhǎng)近似相同，其中C3’位酚羥基的鍵長(zhǎng)最小，C4’位酚羥基的鍵長(zhǎng)最大，并且在C4’位呈現(xiàn)出gal類花色苷的鍵長(zhǎng)最大，其次為ara類花色苷，glc類花色苷的鍵長(zhǎng)最小的規(guī)律。在C環(huán)C3位所連糖苷處，各類花色苷中的二級(jí)羥基與C4’位活性酚羥基形成氫鍵（glc）或產(chǎn)生斥力（gal），對(duì)脫氫反應(yīng)抑制或促進(jìn)作用[28]；對(duì)于Pt-3-O-gal，C3’位的甲氧基也可能對(duì)C4’位酚羥基產(chǎn)生活化作用，進(jìn)一步促進(jìn)其發(fā)生脫氫反應(yīng)，使得Pt-3-O-gal的抗氧化能力最強(qiáng)[29]。

表 2 13 種花色苷分子的主要結(jié)構(gòu)參數(shù)Table 2 Major structural parameters of 13 anthocyanins

綜合看來(lái)，13 種花色苷分子中B環(huán)上C4’處酚羥基的鍵長(zhǎng)普遍較長(zhǎng)，可推斷該處反應(yīng)活性最強(qiáng)，其次為A環(huán)上C5處酚羥基，其反應(yīng)活性也較強(qiáng)，因此13 種花青素的抗氧化能力由強(qiáng)到弱的順序?yàn)間al類花色苷＞ara類花色苷＞glc類花色苷，與ORAC實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

在我們?nèi)A夏民族悠久的陶瓷文化歷史里，各式各樣的陶瓷作品層出不窮，其中各種彩類更是五花八門。而生活陶藝也是眾多陶瓷作品中的一種，也是離普通老板姓接觸最多的一種。據(jù)考證，在江西省萬(wàn)年仙人洞中，就有考古學(xué)家發(fā)現(xiàn)過(guò)遠(yuǎn)古時(shí)期的生活陶藝殘片，在這些殘片周圍還留下木炭化石的痕跡，可以斷定這就是曾經(jīng)生活在這里的遠(yuǎn)古人生活中儲(chǔ)存食物的器皿。而另一種時(shí)代久遠(yuǎn)的生活陶藝就是——彩陶，我們現(xiàn)在還能在博物館里看到我們祖先所留下的這種文化遺產(chǎn)，這種彩陶出現(xiàn)在我國(guó)黃河流域。

2.3.2 活性羥基BDE

酚羥基BDE是一種能夠用來(lái)衡量清除自由基活性的理論參數(shù)，酚羥基BDE越小，羥基鍵越弱，越容易失去酚羥基上的氫，那么可以說(shuō)明其抗氧化活性越高[30]。有研究表明，花青素分子B環(huán)上C4’處酚羥基的活性最強(qiáng)，A環(huán)上C5處酚羥基的活性次強(qiáng)[31]，并且由鍵長(zhǎng)計(jì)算得出，C4’位與C5位的鍵長(zhǎng)最大，故對(duì)C4’位和C5位的酚羥基BDE進(jìn)行計(jì)算。

表 3 13 種花色苷活性羥基BDETable 3 Hydroxyl dissociation energy of 13 anthocyanins at active positions

由表3可知，在活性最強(qiáng)的C4’位酚羥基處，Cy的3 種糖苷化合物及Pn-3-O-gal的BDE普遍大于其余種類花青素類化合物，而Pt的3 種糖苷化合物的BDE普遍小于其余種類花青素類化合物，這表明Cy類花色苷的抗氧化活性在5 種花青素類化合物中呈現(xiàn)較弱狀態(tài)，而Pt類花色苷的抗氧化活性較強(qiáng)。此外Pt-3-O-gal的BDE僅為251.21 kJ/mol，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他花青素類化合物的BDE，從而推斷Pt-3-O-gal在13 種花色苷中的抗氧化活性最強(qiáng)。這可能是由于Cy類化合物分子的C4’與C3’處羥基形成內(nèi)氫鍵，不利于C4’位酚羥基的解離，使得C4’位羥基BDE增大，活性降低[32]；而Pn-3-O-gal可能由于C4’位羥基的鄰位甲氧基位阻效應(yīng)使其反應(yīng)幾率降低，但甲氧基為兩性基團(tuán)，也可使鄰位羥基活化，從而促使Pt類花色苷的BDE減小，使其抗氧化活性增強(qiáng)[33]。C5位酚羥基的BDE普遍大于C4’位酚羥基的BDE，但其整體差別不大。

這5 類花青素分別與3 種糖苷結(jié)合后，活性最強(qiáng)的酚羥基（C4’位）BDE均為：gal類花色苷＜ara類花色苷＜glc類花色苷，即gal類花色苷的抗氧化活性最高，其次為ara類花色苷，glc類花色苷活性最弱，與ORAC實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

2.3.3 IP及半醌式自由基自旋密度分布

表 4 13 種花色苷失去電子所需能量（IP）Table 4 Energy required for electron loss (ionization potential) in 13 anthocyanins

單電子轉(zhuǎn)移途徑也能夠說(shuō)明物質(zhì)的抗氧化能力，可通過(guò)IP反映的單電子轉(zhuǎn)移途徑來(lái)對(duì)物質(zhì)的抗氧化能力進(jìn)行預(yù)測(cè)，IP越低，說(shuō)明該物質(zhì)的給電能力越強(qiáng)，即抗氧化能力越強(qiáng)[34]。如表4所示，5 類花青素化合物中IP均為gal類花色苷＜ara類花色苷＜glc類花色苷，說(shuō)明gal類花色苷的抗氧化活性最強(qiáng)，其次為ara類花色苷，glc類花色苷的活性最弱，且Pt-3-O-gal的IP最低，僅為484.51 kJ/mol，說(shuō)明Pt-3-O-gal的抗氧化能力最高，與ORAC分析結(jié)果一致。其中Mv及Pt的3 類糖苷化合物的IP普遍小于其他花青素類化合物，推測(cè)Mv類糖苷化合物和Pt類糖苷化合物的抗氧化活性較強(qiáng)。

半醌式自由基的自旋密度分布也是衡量物質(zhì)抗氧化活性的一項(xiàng)重要指標(biāo)，有研究指出，半醌式自由基的自旋密度分布越離散，自由基就越穩(wěn)定，抗氧化活性也就相對(duì)更強(qiáng)[35]。由表5可知，13 種花色苷中，在C5位的酚羥基失去氫原子后的自旋密度分布差別較小，數(shù)值接近0，推測(cè)由于其脫氫能力較C4’位酚羥基偏弱，脫氫幾率偏小，難以形成半醌式自由基；而在C4’位酚羥基失去氫原子后自旋密度較為分散，且數(shù)值均為gal類花色苷＜ara類花色苷＜glc類花色苷，并且Pt-3-O-gal的半醌式自由基自旋密度分布最小，僅為0.032 78，故推斷在13 種花色苷中，Pt-3-O-gal的抗氧化能力最強(qiáng)，并且gal類花青素的抗氧化活性均強(qiáng)于其他兩類，其次為ara類花青素，glc類花青素的活性最弱，與ORAC實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。

表 5 13 種花色苷失去重要位置酚羥基氫原子后的自旋密度分布Table 5 Spin density distribution of 13 anthocyanins after loss of phenolic hydroxyl hydrogen atoms

綜合上述結(jié)果得知，‘海岸’的花青素總含量略高于‘奧尼爾’，但其抗氧化能力卻略低，推測(cè)是由于‘奧尼爾’中Pt-3-O-gal的含量明顯高于‘海岸’，而經(jīng)理論計(jì)算及ORAC測(cè)定均顯示Pt-3-O-gal是13 種花色苷中抗氧化能力最強(qiáng)的花色苷，從而導(dǎo)致‘奧尼爾’中花青素總量雖略低于‘海岸’，但其抗氧化能力卻略高；此外，‘奧尼爾’中含有更多的?；ㄉ?，而?；ㄉ沼锌赡芴岣咂淇寡趸芰Α１容^4 種藍(lán)莓果的花青素含量還可以發(fā)現(xiàn)，抗氧化能力最低的‘海岸’中Cy-3-O-glc的含量高于其他品種，而通過(guò)理論計(jì)算及ORAC測(cè)定可得出Cy-3-O-glc的抗氧化能力偏弱，可能影響其總抗氧化能力。

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)比4 種藍(lán)莓果（野生藍(lán)莓、‘海岸’、‘奧尼爾’、‘藍(lán)美1號(hào)’）花青素提取物的HPLC定量分析和體外ORAC實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)不同品種藍(lán)莓間花青素含量、抗氧化能力存在差異。通過(guò)對(duì)分子結(jié)構(gòu)參數(shù)、酚羥基BDE、IP以及半醌式自由基自旋密度分布的計(jì)算得知，藍(lán)莓果花青素提取物抗氧化能力強(qiáng)弱與花青素總量、gal類花色苷含量、Pt-3-O-gal含量及?；ㄉ蘸棵芮邢嚓P(guān)，推斷出藍(lán)莓花色苷中，gal類花色苷的抗氧化能力最強(qiáng)，其次是ara類花色苷，而glc類花色苷的抗氧化能力相對(duì)較弱；Pt-3-O-gal在13 種花色苷中抗氧化能力最強(qiáng)；此外闡明了花色苷抗氧化能力的構(gòu)效關(guān)系，糖苷種類對(duì)花色苷抗氧化能力影響更顯著。13 種花色苷在ORAC體外抗氧化實(shí)驗(yàn)及理論計(jì)算中均呈現(xiàn)出一致結(jié)果，這為花色苷類化合物抗氧化能力的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供了理論依據(jù)。