王德望，彭麗紅，龔金梅，司明遠(yuǎn)，劉 夢，歐陽聰，張夢迪

冷凍切片技術(shù)已廣泛應(yīng)用于術(shù)中病理診斷，高質(zhì)量的冷凍切片技術(shù)對確保術(shù)中病理診斷的可靠性至關(guān)重要[1-2]。目前，國內(nèi)外對于術(shù)中冷凍制片的研究較多，有關(guān)冷凍后組織處理的研究較少。冷凍后組織行常規(guī)制片常常會出現(xiàn)形態(tài)學(xué)失真性改變，這是臨床病理工作中普遍性難題[3]。作者發(fā)現(xiàn)冷凍后的組織經(jīng)常規(guī)10%中性福爾馬林固定24 h左右或更長時間后制片，易發(fā)生組織收縮過度，細(xì)胞間或組織間出現(xiàn)人工裂隙，細(xì)胞核過度收縮，腺源性組織尤為明顯，增加了診斷難度。尤其是術(shù)中行快速冷凍病理檢查的組織標(biāo)本小，病變不典型，術(shù)中診斷較困難，且冷凍后對應(yīng)石蠟組織(以下簡稱：冷對組織)為唯一組織塊時，因組織過度收縮，比術(shù)中快速冷凍切片更不易觀察、診斷。作者近3年通過反復(fù)實(shí)踐后發(fā)現(xiàn)，改良冷凍后組織的固定方法可有效緩解組織過度收縮的問題，現(xiàn)將經(jīng)驗(yàn)分享如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源收集2016年8月～2019年3月南京同仁醫(yī)院病理科存檔的術(shù)中行快速冷凍病理檢查的部分實(shí)性或囊實(shí)性標(biāo)本合計200余例，重點(diǎn)回顧性觀察其中經(jīng)石蠟切片證實(shí)的60例甲狀腺乳頭狀癌和20例肺腺癌。

1.2 主要設(shè)備低溫恒溫冷凍切片機(jī)、全自動組織脫水機(jī)、漂烘儀、切片機(jī)等。

1.3 試劑配制10%中性福爾馬林；AAF液(無水乙醇85 mL，冰醋酸5 mL，40%甲醛15 mL)。

1.4 方法

1.4.1常規(guī)固定方法 將術(shù)中行快速冷凍病理檢查后的冷凍組織置于10%中性福爾馬林中隔夜固定后，再常規(guī)脫水，該方法作為本實(shí)驗(yàn)中的對照方法。改良固定方法1(以下簡稱：方法1)：將術(shù)中行快速冷凍病理檢查的冷凍組織置于預(yù)冷的AAF液中4 ℃冰箱中過夜固定，再常規(guī)脫水。改良固定方法2(以下簡稱：方法2)：將術(shù)中行快速冷凍病理檢查的冷凍組織置于10%中性福爾馬林中常溫固定3 h以上，10 h以內(nèi)，即送檢當(dāng)天適當(dāng)固定后，再行常規(guī)脫水。

1.4.2實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)1組，選取最大徑0.5 cm以上的腫物，取2塊組織分別行快速冷凍病理檢查后，再分別行常規(guī)方法及方法1固定；實(shí)驗(yàn)2組，選取最大徑0.5 cm以上的腫物，取2塊組織分別行快速冷凍病理檢查后，再分別行常規(guī)方法及方法2固定。

1.4.3觀察方法 所有組織塊經(jīng)常規(guī)石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察實(shí)驗(yàn)1、2組的甲狀腺乳頭癌各30例，肺腺癌各10例(經(jīng)常規(guī)石蠟切片驗(yàn)證)。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)1組中27例經(jīng)方法1處理的甲狀腺乳頭狀癌組織形態(tài)優(yōu)于經(jīng)常規(guī)固定處理的同源組織標(biāo)本，具體表現(xiàn)：常規(guī)固定處理的標(biāo)本經(jīng)常規(guī)制片后，甲狀腺濾泡出現(xiàn)變形，拉伸感，細(xì)胞間人工裂隙明顯，細(xì)胞及胞核收縮，胞核透亮空泡狀特征不明顯(圖1)，而方法1處理的甲狀腺乳頭癌標(biāo)本組織變形輕微，拉伸感消失或緩解，組織間人工裂隙消失或緩解，細(xì)胞及胞核收縮不明顯，核透亮、空泡狀(圖2)。3例甲狀腺乳頭癌組織經(jīng)方法1處理后組織形態(tài)與常規(guī)固定處理后的同源組織無明顯差異性改變。10例經(jīng)方法1處理的肺腺癌組織形態(tài)優(yōu)于經(jīng)常規(guī)固定處理的同源組織標(biāo)本，具體表現(xiàn)：常規(guī)固定處理的標(biāo)本經(jīng)常規(guī)制片后，癌灶處肺泡間隔因組織收縮致增寬看似不明顯，肺泡壁癌細(xì)胞核明顯收縮，同時因細(xì)胞質(zhì)收縮，導(dǎo)致部分本來連續(xù)性貼壁生長的癌細(xì)胞看似非連續(xù)(圖3)，而方法1處理的肺癌標(biāo)本，病灶區(qū)肺泡間隔增寬現(xiàn)象明顯，貼壁型生長區(qū)域肺泡壁癌細(xì)胞形態(tài)飽滿，呈連續(xù)性貼壁生長，核凸向肺泡腔(圖4)。

實(shí)驗(yàn)2組中28例經(jīng)方法2處理的甲狀腺乳頭狀癌組織形態(tài)(圖5)優(yōu)于經(jīng)常規(guī)固定處理的同源組織標(biāo)本(圖6)，表現(xiàn)結(jié)果同實(shí)驗(yàn)1組，2例無明顯差異性改變。9例經(jīng)方法2處理的肺腺癌組織形態(tài)優(yōu)于經(jīng)常規(guī)固定處理的同源組織標(biāo)本，表現(xiàn)結(jié)果同實(shí)驗(yàn)1組，1例無無明確差異性改變。

3 討論

通常我們認(rèn)為10%中性福爾馬林在組織處理過程中主要起到蛋白固定的作用，對組織的收縮作用比較弱，組織固定時間一般在6～24 h之間，最長不宜超過72 h，普遍認(rèn)為，過長時間固定會造成組織抗原性丟失，一般不導(dǎo)致組織收縮過度，而導(dǎo)致組織形態(tài)變形失真[4]。但作者發(fā)現(xiàn)，組織冷凍后常溫下10%中性福爾馬林固定時間如果大于10 h，制片后組織形態(tài)會失真，主要表現(xiàn)為：組織過度收縮，細(xì)胞間出現(xiàn)人工裂隙，細(xì)胞體積變小，核變致密，核型不清晰。這些改變會導(dǎo)致病變出現(xiàn)“人工不典型”，個別情況下如果病變組織小，術(shù)中快速冷凍病理檢查已全部取材或近似全部取材，因其它原因術(shù)中不能明確診斷的情況下，而冰對組織的“人工不典型”可能進(jìn)一步增加診斷的難度，而不利于最終的診斷。因此，根據(jù)本科室長期以來的觀察經(jīng)驗(yàn)，傳統(tǒng)觀點(diǎn)所認(rèn)為的10%中性福爾馬林組織收縮性弱可能僅限于常規(guī)組織固定后的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，而冷凍后的組織經(jīng)10%中性福爾馬林固定后收縮效果則不完全一致。

冷凍組織經(jīng)AAF液(無水乙醇，冰醋酸，福爾馬林)4 ℃冰箱中過夜固定后的制片效果較常規(guī)固定后佳，原因主要有兩個方面：(1)4 ℃低溫固定是關(guān)鍵所在，有專家認(rèn)為組織經(jīng)低溫冷凍后(18～22 ℃)細(xì)胞內(nèi)易產(chǎn)生冰晶，同時細(xì)胞內(nèi)骨架及生物膜相系統(tǒng)會驟然發(fā)生改變，而冷凍切片后如直接回到室溫，細(xì)胞骨架及生物膜相系統(tǒng)易致?lián)p傷[5-6]，而4 ℃環(huán)境可作為一個緩沖，有效緩解組織因忽“冷”忽“熱”所致的損傷，但目前有關(guān)低溫冷凍后組織的損傷機(jī)制尚不完全清楚，還有待得到進(jìn)一步的科學(xué)論證。(2)AAF液中固定劑配伍有一定奧妙，此三種液體均有組織固定作用，但固定的機(jī)制不完全一致，其中乙醇屬于凝固固定劑，其滲透性較強(qiáng)(比福爾馬林弱)，但組織收縮性強(qiáng)，主要用于糖原及高分子量蛋白質(zhì)固定；福爾馬林屬于非凝固交聯(lián)固定劑，其滲透性較強(qiáng)，固定均勻，組織收縮性小，主要通過與蛋白質(zhì)共價結(jié)合并促進(jìn)蛋白質(zhì)交聯(lián)而產(chǎn)生固定作用；乙醇福爾馬林混合液可保存像糖原這樣的分子，使組織收縮和變硬程度比單獨(dú)使用要小。乙酸屬于酸性固定劑，滲透性強(qiáng)，其組織膨脹性強(qiáng)，可凝固核酸，是染色質(zhì)的良好固定劑，但不能使蛋白質(zhì)固定和沉淀。因此，AAF液的配方可阻抗組織過度收縮[7]，同時4 ℃固定可防止細(xì)胞內(nèi)骨架及生物膜相系統(tǒng)受到破壞，維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性。有研究表明，甲醇與乙醇的固定效果類似，而且甲醇比乙醇的組織收縮性更少[8-10]，如果將本組實(shí)驗(yàn)中AAF液配方中的乙醇改成甲醇或許更佳。

總體來講，冷凍組織經(jīng)改良固定處理后形態(tài)較常規(guī)固定者佳，甚至色澤也較之鮮艷，形態(tài)色澤較接近常規(guī)非冷凍組織，雖仍有差別，但形態(tài)已相對較為保真，易于觀察、診斷。在日常工作中，作者將所有行術(shù)中快速冷凍病理檢查的組織均進(jìn)行了改良固定和常規(guī)固定的比對，發(fā)現(xiàn)幾乎所有的冷凍組織(鱗狀上皮、腺上皮、軟組織等)經(jīng)改良固定后制片的效果比常規(guī)固定佳，其中以腺源性標(biāo)本差異性大，究其機(jī)制不甚清楚，估計其細(xì)胞內(nèi)微細(xì)結(jié)構(gòu)較其他組織具有一定差異性。當(dāng)然，影響冰對組織制片質(zhì)量不僅僅與冷凍后固定方法這一單一因素有密切關(guān)系，還與冷凍過程中包埋劑對組織是否覆蓋完全及冷凍時長等造成細(xì)胞內(nèi)冰晶形成的因素密切關(guān)聯(lián)。與其同時本組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，組織冷凍后再固定，固定時長似乎要比常規(guī)組織固定要短，但仍需積累大樣本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證和探究。

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