馮梓欣，田雪梅

卵巢是雌性動物生殖系統(tǒng)的重要器官，卵泡是卵巢組織中的主要結(jié)構(gòu)成分。卵巢長期處于動態(tài)變化中，其中卵泡受到一系列復(fù)雜精細的調(diào)控而發(fā)生形態(tài)和結(jié)構(gòu)的變化，處于不同的發(fā)育階段[1]。卵泡根據(jù)形態(tài)和功能可分為原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡和成熟卵泡四個階段，不具備生長優(yōu)勢的卵泡在發(fā)育進程中形成閉鎖卵泡[2]。對卵巢的組織學(xué)和病理學(xué)研究中，常常需要借助染色來觀察組織切片中卵泡的形態(tài)結(jié)構(gòu)，識別各種發(fā)育階段的卵泡。HE、PAS、Masson染色是小鼠卵巢組織石蠟切片常用的染色方法[3]。本文比較觀察HE染色和Masson染色的卵巢組織切片，以探討這兩種染色方法在卵巢組織切片中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1試劑 Bouin液：飽和苦味酸水溶液75 mL，10%中性福爾馬林25 mL，冰醋酸5 mL；Ehrlich蘇木精：取蘇木精2 g加入100 mL無水乙醇，37 ℃攪拌溶解后加入甘油100 mL，另取硫酸鋁鉀3 g加入100 mL蒸餾水，充分混勻，將上述兩種液體充分混勻后再加入10 mL冰醋酸，自然氧化成熟后過濾使用；伊紅染液：伊紅1 g，95%乙醇100 mL；1%鹽酸乙醇溶液：70%乙醇99 mL，濃鹽酸1 mL；Masson染色試劑盒購自南京建成科技公司，內(nèi)含核染液(主要成分為蘇木精染液)、質(zhì)染液(麗春紅、酸性復(fù)紅混合染液)、分色液(磷鉬酸水溶液)、沖洗液(乙酸水溶液)、復(fù)染液(苯胺藍染液)。

1.1.2儀器 石蠟包埋機(徠卡YB-6LF)；切片機(徠卡RM2235)；顯微鏡(尼康ECLIPSE 80i)。

1.2 小鼠卵巢石蠟切片制作小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)進行麻醉，頸椎脫臼法處死，取出雙側(cè)卵巢投入新鮮配制的Bouin液中固定12 h。實驗動物的操作均符合華南師范大學(xué)實驗動物倫理學(xué)管理條例。將固定后的卵巢于70%乙醇中脫去黃色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋。包埋好的組織蠟塊，連續(xù)5 μm厚切片，HE染色和Masson染色分別用于相鄰切片。

1.3 HE染色切片常規(guī)脫蠟至水，Ehrlich蘇木精染色20 min，1%鹽酸乙醇分色，自來水藍化20 min，用蒸餾水洗；再經(jīng)70%、80%和90%乙醇各3 min，伊紅染液10 s；95%、100%乙醇各10 min，二甲苯透明，中性樹膠封固，普通光鏡下觀察。

1.4 Masson染色染色按照試劑盒說明書中的方法進行操作。切片常規(guī)脫蠟至水，核染液染色1 min，沖洗液沖洗30 s；質(zhì)染液染色10 s，沖洗液沖洗30 s；分化液分色8 min；棄去分色液后直接用復(fù)染液染色3 min，100%乙醇洗凈浮色，二甲苯透明，中性樹膠封固，普通光學(xué)顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

初級卵泡由一個卵母細胞和外周包圍的若干層卵泡細胞組成，卵母細胞和卵泡細胞間有一層透明帶(圖1A)；次級卵泡體積增大，透明帶增厚，卵泡細胞間出現(xiàn)大小不等的腔隙(圖1B)。HE染色的切片中，卵巢組織中各發(fā)育階段卵泡及卵巢基質(zhì)的形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰可見，細胞核呈藍紫色，細胞質(zhì)及間質(zhì)成分呈淺紅色，卵泡中卵母細胞、卵泡細胞、透明帶均清晰可見；Masson染色的切片中，透明帶和含有膠原蛋白的結(jié)構(gòu)呈清晰的藍色，其他成分均呈橙紅色，能分辨各階段卵泡及卵巢基質(zhì)，但不能清晰地顯示卵泡細胞、卵泡膜細胞和卵巢基質(zhì)成分(圖1C、D)。

對兩種染色法進行觀察比較發(fā)現(xiàn)，HE染色的切片中表現(xiàn)正常的初級卵泡(圖2A)和次級卵泡(圖2B)，在Masson染色的切片中可觀察到透明帶皺縮及凹陷(圖2C、D)，該初級卵泡和次級卵泡均呈現(xiàn)為早期閉鎖狀態(tài)。HE染色的切片中透明帶皺縮，顯示為閉鎖的卵泡，在Masson染色的切片中可觀察到該卵泡的卵母細胞染色較深，透明帶皺縮成鋸齒狀，閉鎖狀態(tài)顯示更為明顯。

3 討論

在哺乳動物卵巢中存在不同發(fā)育階段的卵泡，大部分卵泡在發(fā)育過程中逐漸發(fā)生閉鎖，只有少部分能夠發(fā)育為成熟的卵泡。在一些卵巢組織病理變化的研究中常會計數(shù)閉鎖卵泡和非閉鎖卵泡的數(shù)量[4]。因此，需要準(zhǔn)確的分辨閉鎖卵泡和非閉鎖卵泡。閉鎖卵泡分為早期閉鎖卵泡和晚期閉鎖卵泡。早期閉鎖卵泡主要表現(xiàn)為透明帶皺縮和少量卵泡細胞發(fā)生凋亡；晚期閉鎖卵泡主要表現(xiàn)為卵母細胞明顯固縮，卵泡細胞凋亡嚴重，透明帶塌陷。Liu等[5]報道HE染色結(jié)合卵泡細胞凋亡檢測可識別晚期閉鎖卵泡，但不易識別早期閉鎖卵泡。

①A①B①C①D②A②B②C②D

常規(guī)的HE染色中，細胞核被蘇木精染成藍紫色，細胞質(zhì)與其他組織結(jié)構(gòu)被伊紅染成淺紅色，透明帶呈現(xiàn)為卵母細胞和卵泡細胞間一層均質(zhì)的淺紅色結(jié)構(gòu)，與其周圍結(jié)構(gòu)的區(qū)分不是很明顯。Masson染色法主要用于組織中纖維成分的染色[6]，其原理是根據(jù)染料分子量大小和組織滲透性，使不同組織成分染上鮮明的顏色，分子量大的染料如苯胺藍可進入到結(jié)構(gòu)松散、滲透性高的組織中。卵泡的透明帶是由顆粒物質(zhì)排列成疏松的纖維狀結(jié)構(gòu)，所以Masson染色中卵泡的透明帶呈藍色，與周圍染成橙紅色的組織成分形成對比，更能顯示透明帶形態(tài)的變化。因此在卵巢組織的觀察中，分別進行Masson染色和HE染色，能更好地觀察不同發(fā)育狀態(tài)的卵泡并識別早期閉鎖卵泡。