陳杰偉，黃馬燕，劉 君，袁安琦，雷 俊，張新科，肖永波

病理醫(yī)師清晰解讀周圍型肺癌與臟層胸膜的彈力纖維關(guān)系，準(zhǔn)確判讀腫瘤是否侵犯臟層胸膜，對制定治療方案具有重要的指導(dǎo)意義[1-2]；第7版TNM分類中也說明了肺胸膜侵犯(visceral pleural invasion, VPI)可以作為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)預(yù)后不良的因素[3]。已有文獻(xiàn)[4]報道采用特殊染色法和免疫組化法先后標(biāo)記彈力纖維和腫瘤細(xì)胞，能更好的觀察腫瘤細(xì)胞與周圍胸膜之間的毗鄰關(guān)系。但這種方法耗時長，費用高，且步驟多，易掉片，為進(jìn)一步節(jié)約成本和提高效率，開發(fā)一種能清晰顯示肺癌細(xì)胞與臟層胸膜彈力纖維關(guān)系的方法具有社會價值，因此本文方法在維多利亞藍(lán)染色法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了探索和改進(jìn)，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集2016年4月～2019年4月中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院存檔的100例周圍型肺癌石蠟組織(包含45例明確診斷存在肺膜侵犯的肺癌)，每例連續(xù)切2張白片；另從其中隨機抽取3例周圍型肺癌石蠟組織，每例連續(xù)切6張白片。

1.2 試劑彈力纖維染色液試劑盒購自珠海貝索公司，Weigert蘇木精、Mayer蘇木精、Harris蘇木精、核固紅，均購自Wexis公司。

1.3 方法對3例肺癌白片進(jìn)行HE染色及五種方法(方法1為Elastin+VG，方法2為Elastin+Weigert+VG，方法3為Elastin+Mayer+VG，方法4為Elastin+Harris+VG，方法5為Elastin+核固紅+VG)的彈力纖維染色，具體染料及主要步驟見表1。方法1為傳統(tǒng)的維多利亞藍(lán)染色法，方法2、3、4、5均對彈力纖維進(jìn)行Elastin浸染過夜后采用三種不同的蘇木精及核固紅進(jìn)行復(fù)染，再行VG液進(jìn)行染色。結(jié)果由三位病理主治醫(yī)師和一位高級職稱病理醫(yī)師進(jìn)行評價并推選其中一種改良方法。為進(jìn)一步證明該改良方法的有效性，對100例肺癌白片采用原方法及改良方法進(jìn)行染色。在不比對原來HE切片的前提下，結(jié)果由兩位病理主治醫(yī)師直接對彈力纖維染色片進(jìn)行獨立判讀。判讀結(jié)果從準(zhǔn)確性和一致性兩個方面進(jìn)行評價，采用配對χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 五種不同方法的彈力纖維及背景染色的主要步驟及時間

2 結(jié)果

2.1 不同方法的對比3例肺癌采用五種不同的染色方法染色，結(jié)果顯示方法2、3、4、5均不同程度地顯示了細(xì)胞核及彈力纖維(圖1)，但方法5采用核固紅復(fù)染效果略差，而蘇木精復(fù)染細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)均能清晰可見，與組織中的彈力纖維著色對比明顯。最后四位病理醫(yī)師獨立并一致選擇Mayer蘇木精作為復(fù)染細(xì)胞核。采用Mayer蘇木精復(fù)染的改良維多利亞藍(lán)方法能達(dá)到理想的效果，彈力纖維清晰，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)明顯，腫瘤細(xì)胞與肺膜的彈力纖維關(guān)系明顯，在判讀腫瘤細(xì)胞是否侵犯肺胸膜時無需再對照HE片，工作效率明顯提高。

2.2 改良方法的準(zhǔn)確性和一致性采用方法1維多利亞藍(lán)法和方法3 Mayer蘇木精作為復(fù)染細(xì)胞核的改良維多利亞藍(lán)法對100例肺癌白片染色后，在不比對原來HE切片的前提下，由兩位病理主治醫(yī)師直接對彈力纖維染色片進(jìn)行獨立判讀。統(tǒng)計結(jié)果顯示，采用方法1染色的彈力纖維，兩位病理醫(yī)師盲評腫瘤細(xì)胞侵犯肺膜病例數(shù)量分別是40例及42例，準(zhǔn)確性分別是89%和93%，一致性是89%；采用方法3染色的彈力纖維，兩位醫(yī)師判讀結(jié)果一致性達(dá)100%，侵犯肺膜例數(shù)均是45例，準(zhǔn)確率達(dá)100%，其準(zhǔn)確性和一致性比方法1顯著提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表2)。充分體現(xiàn)了改良后的彈力纖維染色更能滿足臨床病理診斷需求，方便診斷的同時，也減少了漏診率。

ABCDEF

表2 兩位病理醫(yī)師判讀100例不同方法彈力纖維染色結(jié)果比較

3 討論

彈力纖維廣泛分布于身體各處，特別在肺泡壁、動脈壁和皮膚較多，內(nèi)對照極為豐富，所以在行彈力纖維特殊染色時往往不需要外對照。彈力纖維染色方法有多種，目前臨床病理實驗室廣泛應(yīng)用的是維多利亞藍(lán)法[5]。但該方法主要顯示彈力纖維，腫瘤細(xì)胞分布與彈力纖維的關(guān)系難以判讀，不能滿足病理診斷的要求，病理醫(yī)師在判讀腫瘤細(xì)胞是否侵犯肺胸膜時，必須結(jié)合原來HE切片的組織形態(tài)，常由于切面不同，對判讀造成困擾。而且其染色原理目前也尚未清楚，可能是彈力纖維中某些部分與Elatin染液中的間苯二酚的酚基形成氫鍵而使彈力纖維被染成藍(lán)黑色。改良Harris蘇木精和Mayer蘇木精均屬于明礬蘇木精，根據(jù)文獻(xiàn)報道明礬蘇木精細(xì)胞核染色后應(yīng)用的任何酸性染料均比較敏感，而VG染色時使用苦味酸酸性品紅復(fù)合物可脫掉大部分蘇木精的顏色，以致細(xì)胞核形態(tài)難以辨認(rèn)，在這種情況下使用鐵蘇木精(Weigert蘇木精)可抵抗苦味酸的影響而達(dá)到滿意的效果，但是本實驗過程中對比了這三種蘇木精，總體蘇木精著色效果均較好，達(dá)到診斷的的需求。作者已在日常工作中應(yīng)用改良維多利亞藍(lán)方法進(jìn)行彈力纖維染色，Elatin染色后進(jìn)行Mayer蘇木精復(fù)染5 min，流水返藍(lán)10 min，再行VG復(fù)染，結(jié)果顯示細(xì)胞核著色比較細(xì)膩，核仁明顯，與彈力纖維的染色對比明顯，能較好地滿足病理診斷的要求，相對原來維多利亞藍(lán)方法，病理診斷的準(zhǔn)確性有了明顯的提高。當(dāng)然，彈力纖維更多更深層次的染色機制仍需要進(jìn)一步探討。

綜上所述，彈力纖維在病理診斷中應(yīng)用廣泛，尤其是肺癌VPI的判讀更是需要借助彈力纖維染色。本改良方法經(jīng)反復(fù)的實踐驗證，結(jié)果穩(wěn)定，可靠，重復(fù)性好，可以明顯減少臨床病理醫(yī)師的工作量，提高工作效率，同時也提高了肺癌VPI的準(zhǔn)確性，值得推廣應(yīng)用。