李雄峰，郗彥鳳，史玉潔，魏晶晶

肺癌的發(fā)病率和病死率位居惡性腫瘤之首，其中80%～85%為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)，而肺腺癌占40%[1]，大多數(shù)患者就診時(shí)已處中晚期。國(guó)內(nèi)外對(duì)于肺癌發(fā)展及預(yù)后的相關(guān)影響因素已進(jìn)行廣泛研究，以往研究報(bào)道顯示，C-met信號(hào)通路和環(huán)氧化酶2(Cox-2)參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于C-met、Cox-2在其他腫瘤中的研究較多，但關(guān)于肺癌中C-met及Cox-2的相關(guān)研究較少，尤其是肺腺癌。為進(jìn)一步探究肺腺癌的發(fā)生機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)主要探討肺腺癌中C-met和Cox-2的表達(dá)并分析兩者表達(dá)的相關(guān)性及對(duì)患者預(yù)后的影響，以期為臨床治療和評(píng)估預(yù)后提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料選取2012年1月～2013年1月山西省腫瘤醫(yī)院病理科確診且具有完整臨床病理資料的肺腺癌140例，其中男性61例，女性79例；年齡28～77歲，平均54.3歲；有吸煙史者56例，無吸煙史者84例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者58例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者82例；病理分級(jí)：Ⅰ+Ⅱ級(jí)46例，Ⅲ+Ⅳ級(jí)94例；按第7版國(guó)際肺癌pTNM分期標(biāo)準(zhǔn)：T1+T2期63例，T3+T4期77例。隨訪時(shí)間截至2017年1月，或由于復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及其他原因?qū)е碌乃劳鋈掌跒橹埂?/p>

1.2 方法所有病例均經(jīng)兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師共同確診，遇有意見分歧的病例協(xié)商討論后最后確定。免疫組化染色采用EnVision兩步法，每例標(biāo)本3 μm厚切片，經(jīng)常規(guī)脫蠟至水，蒸餾水洗滌、高壓鍋抗原修復(fù)、用3%H2O2封閉阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，加一抗4 ℃過夜，二抗孵育、經(jīng)PAS沖洗、DAB顯色、蘇木精復(fù)染、1%鹽酸乙醇數(shù)秒分化、梯度乙醇脫水、二甲苯透明封固。陽性對(duì)照采用淋巴結(jié)切片，陰性對(duì)照用PAS替代一抗。C-met兔抗人單抗和Cox-2兔抗人單抗均購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.3 結(jié)果判讀C-met蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色，C-met免疫組化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[2]：腫瘤細(xì)胞染色結(jié)果依據(jù)染色強(qiáng)度及范圍分為0～3分，即無反應(yīng)或<10%的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞膜反應(yīng)為0分,≥10%的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)微弱/難以察覺的細(xì)胞膜反應(yīng)或細(xì)胞的部分細(xì)胞膜有反應(yīng)為1分，≥10%的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)微弱至中等強(qiáng)度的完整、基底側(cè)或側(cè)膜反應(yīng)為2分,≥10%的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)高強(qiáng)度的完整、基底外側(cè)或側(cè)膜反應(yīng)為3分。其中0～1分為低表達(dá)組，2～3分為高表達(dá)組。Cox-2表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色至深棕黃色，若只有細(xì)胞核著色，細(xì)胞質(zhì)不著色或細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)均不著色定義為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法分析C-met和Cox-2表達(dá)與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系，相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析法，Kaplan-Meier生存曲線法描述患者的生存狀態(tài)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌中C-met和Cox-2的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系140例肺腺癌中，C-met高表達(dá)31例(22.1%)(圖1、2)，C-met高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)、臨床分期有關(guān)(P<0.05)，與患者性別、吸煙史、年齡無關(guān)(P>0.05，表1)。140例肺腺癌中，Cox-2陽性86例(61.4%)(圖3)，Cox-2表達(dá)與吸煙史、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)、臨床分期有關(guān)(P<0.05)，與患者性別、年齡無關(guān)(P>0.05，表1)。

①②③

表1 肺腺癌中C-met和Cox-2蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.2 肺腺癌中C-met和Cox-2表達(dá)的相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，肺腺癌中C-met和Cox-2的表達(dá)無相關(guān)性(rs=-0.143，P=0.092，表2)。

表2 肺腺癌中C-met和Cox-2表達(dá)的相關(guān)性

2.3 C-met、Cox-2表達(dá)與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系140例肺腺癌患者Kaplan-Meier生存曲線表明，C-met低表達(dá)組者總生存期高于C-met高表達(dá)組，Cox-2陰性組的總生存期高于陽性組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4、5)。Cox多因素分析表明，肺腺癌病理分級(jí)、臨床分期、C-met高表達(dá)及Cox-2陽性為影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

3 討論

肺癌具有發(fā)病隱匿，癥狀不明顯，病死率高等特點(diǎn)，病理分型常被作為預(yù)測(cè)治療效果的重要指標(biāo)。隨著人類對(duì)肺癌研究的推進(jìn)，對(duì)相關(guān)腫瘤標(biāo)志物的作用認(rèn)識(shí)逐漸清晰，研究相關(guān)腫瘤標(biāo)志物可以更好的為治療提供依據(jù)，評(píng)估預(yù)后，而對(duì)于患者而言，治療重點(diǎn)在于延長(zhǎng)生存期，因而提高患者生存期就成為臨床醫(yī)師越來越關(guān)注的焦點(diǎn)。

圖4 C-met表達(dá)與肺腺癌患者總生存期的關(guān)系

圖5 Cox-2表達(dá)與肺腺癌患者總生存期的關(guān)系

C-met作為Met家族成員，屬于酪氨酸激酶受體，表達(dá)于各種上皮細(xì)胞的表面[3]，在正常生理狀態(tài)下，C-met可以調(diào)節(jié)胚胎生長(zhǎng)，促進(jìn)組織再生及生長(zhǎng)愈合；但在病理狀態(tài)下，C-met可以促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，阻止凋亡，促進(jìn)多種類型腫瘤(如肝癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌等)的進(jìn)展[4]。Tretiakova等[5]研究發(fā)現(xiàn)C-met在NSCLC中高表達(dá)，本組中C-met高表達(dá)率為22.1%，與Tretiakova等的研究結(jié)果相近。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，C-met高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)、臨床分期有關(guān)(P<0.05)，與患者性別、吸煙史、年齡等無關(guān)。艾婷等[6]認(rèn)為C-met蛋白表達(dá)與病理分級(jí)之外的其他病理特征均無關(guān)，導(dǎo)致結(jié)果不同的原因可能與各實(shí)驗(yàn)使用的檢測(cè)方法或采用的檢測(cè)試劑不同及判讀差異等影響因素有關(guān)，而最重要的原因可能是HGF/C-met信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄及翻譯過程中受其他信號(hào)通路(如KRAS-MAPK信號(hào)通路)或其他基因(如T790M)的作用有關(guān)，該信號(hào)通路同樣可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移，在信號(hào)傳導(dǎo)過程中可能與HGF/C-met信號(hào)通路競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞膜內(nèi)相應(yīng)的酪氨酸激酶區(qū)域。C-met高表達(dá)患者的總生存期低于低表達(dá)患者，分析可能原因：C-met具有誘導(dǎo)血管生成的功能，可以增加腫瘤的惡性程度，從而使腫瘤更易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致預(yù)后差。因此C-met高表達(dá)患者提示預(yù)后不良，可作為判斷預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)，早期檢測(cè)C-met蛋白表達(dá)狀態(tài)可以為臨床治療提供更多的參考。

Cox-2作為一種可誘導(dǎo)的環(huán)氧合酶，是前列腺素生產(chǎn)過程中的重要限速酶，其蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)可增加前列腺素的產(chǎn)生和分泌[7]，進(jìn)而激活生長(zhǎng)通路，抑制細(xì)胞凋亡通路。通過回顧性分析，Cox-2在大量腫瘤基因中處于高表達(dá)狀態(tài)，如鄭玲玲等[8]發(fā)現(xiàn)，乳腺癌中Cox-2陽性率高達(dá)71.43%，有助于腫瘤的形成和生長(zhǎng)。Cox-2在30%的良性息肉和80%～85%的腺癌中過表達(dá)[7,9]。本實(shí)驗(yàn)中Cox-2的陽性率為61.4%，低于Ranjbar等[9]的結(jié)果，分析原因可能為：(1)本組樣本數(shù)量較少缺乏大數(shù)據(jù)分析，結(jié)果波動(dòng)幅度較大；(2)采用的試劑不同及診斷醫(yī)師主觀分析差異等所致。盡管研究結(jié)果已表明，Cox-2表達(dá)在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，然而Cox-2在NSCLC中的表達(dá)及對(duì)其發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的影響卻存在很多爭(zhēng)議[10-11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Cox-2表達(dá)與肺腺癌患者吸煙史、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)、臨床分期有關(guān)，Cox-2陰性者的總生存期高于陽性者，與費(fèi)賢樹等[12]的研究結(jié)果相似；提示隨著病程的延長(zhǎng)，病理分級(jí)及臨床分期越高，Cox-2蛋白陽性程度越高，Cox-2可能具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化，提高腫瘤細(xì)胞侵襲的能力，參與肺癌進(jìn)程的發(fā)展。Turk等[13]研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌中Cox-2的陽性率為55%，Cox-2表達(dá)與臨床分期、組織類型、生存率之間無顯著相關(guān)性，Cox-2表達(dá)非肺癌患者預(yù)后評(píng)估的指標(biāo)。孫曉艷等[14]研究表明Cox-2蛋白在NSCLC中高表達(dá)，影響因素可能為病理類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Jiang等[15]分析顯示，Cox-2蛋白表達(dá)是NSCLC的預(yù)后因素且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)。這些不同的研究結(jié)果表明，Cox-2在NSCLC中發(fā)揮的具體作用還存在很大的不確定性，仍需要更多研究者繼續(xù)深入探究。

以往薈萃分析表明，C-met和Cox-2在乳腺癌和胃癌等多數(shù)腫瘤中具有相互作用。Kuang等[16]研究證實(shí)C-met可以誘導(dǎo)Cox-2表達(dá)的增加從而參與乳腺癌的發(fā)生。Chen等[17]認(rèn)為在治療胃癌時(shí)可根據(jù)腫瘤細(xì)胞中C-met的表達(dá)水平來評(píng)估Cox-2抑制劑用量的標(biāo)準(zhǔn)。這些研究結(jié)果均表明，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，C-met和Cox-2之間具有相互作用。同理類推，在肺癌中，C-met和Cox-2之間也應(yīng)該存在某種關(guān)系，本組Spearman相關(guān)性分析顯示，C-met與Cox-2蛋白表達(dá)無相關(guān)性(rs=-0.143，P=0.092)。分析原因可能為本實(shí)驗(yàn)樣本量較少，導(dǎo)致結(jié)果有一定偏移；不同實(shí)驗(yàn)組采用的研究方法和判讀標(biāo)準(zhǔn)的不同也會(huì)導(dǎo)致誤差結(jié)果的出現(xiàn)，更深入的原因可能為HGF/C-met信號(hào)通路的激活途徑與Cox-2蛋白誘導(dǎo)所致的生長(zhǎng)通路的激活方式不同有關(guān)。關(guān)于肺腺癌中C-met和Cox-2的相關(guān)性仍需更多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的進(jìn)一步論證。受實(shí)驗(yàn)條件限制，本組實(shí)驗(yàn)尚未分析兩種蛋白在基因表達(dá)層面的關(guān)系，有待后續(xù)通過分子檢測(cè)進(jìn)一步完善資料。

綜上所述，C-met和Cox-2在肺腺癌中具有一定的作用，盡管本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)兩者表達(dá)的相關(guān)性，但單從各個(gè)基因來看，其表達(dá)通常提示預(yù)后較差，因此作者建議要盡早同時(shí)檢測(cè)C-met和Cox-2的表達(dá)，評(píng)估患者預(yù)后，從而為肺腺癌患者治療提供更多的理論依據(jù)和臨床選擇。