趙天源，張艷敏，常延河

近年隨著空氣污染、人口老齡化等原因的日漸加重，肺癌患病率和病死率位居惡性腫瘤的首位[1]。肺癌中最常見(jiàn)病理類(lèi)型為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)，其惡性程度較高，侵襲和轉(zhuǎn)移是造成預(yù)后不良的主要原因，因此探討與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子指標(biāo)具有重要的意義。在多種腫瘤中HAb18G能夠誘導(dǎo)MMP-9、MMP-2表達(dá)等，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[2]，但在肺癌中的表達(dá)鮮見(jiàn)報(bào)道。本文著重探討HAb18G、MMP-9和MMP-2的表達(dá)與NSCLC轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系，為NSCLC的早期診斷和預(yù)后判斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料收集2002年1月～2013年5月河北省唐山市開(kāi)灤總醫(yī)院手術(shù)切除的原發(fā)性NSCLC石蠟標(biāo)本121例，其中男性98例，女性23例；≤50歲者45例，>50歲者76例；腫瘤直徑≤3 cm者86例，>3 cm者35例；病理類(lèi)型：鱗癌61例，腺癌60例；組織學(xué)分化程度：高+中分化89例，低分化32例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期65例，Ⅲ+Ⅳ期56例；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者54例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者67例。所有患者均經(jīng)病理確診，臨床病理資料均完整，術(shù)前患者均未行放、化療及免疫治療。

1.2 主要試劑HAb18G單抗和相關(guān)免疫組化試劑盒，購(gòu)自江蘇太平洋美諾克公司。鼠抗人MMP-9單克隆抗體和免疫組化試劑盒，購(gòu)自福州邁新公司。鼠抗人MMP-2單克隆抗體和免疫組化試劑盒，購(gòu)自武漢博士德公司。

1.3 方法采用免疫組化SP法染色，將121例NSCLC石蠟包埋塊常規(guī)脫蠟、水化，3%H2O2，微波抗原修復(fù)，10%正常羊血清封閉。分別滴加HAb18G(1 ∶200)、MMP-9(1 ∶200)和MMP-2(1 ∶200)抗體，4 ℃過(guò)夜，滴加辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記兔抗鼠IgG，37 ℃ 1 h，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，透明樹(shù)膠封固。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照，取陽(yáng)性對(duì)照片同步操作做陽(yáng)性對(duì)照。通過(guò)查閱病案資料、電話等方式對(duì)患者進(jìn)行術(shù)后5年生存期調(diào)查，利用Kaplan-Meier生存曲線和Log-rank檢驗(yàn)分析三者的表達(dá)水平與患者生存期的關(guān)系。

1.4 結(jié)果判讀HAb18G、MMP-9和MMP-2的陽(yáng)性細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞膜或胞質(zhì)呈棕黃色，在高倍鏡視野下選取4個(gè)不同視野，分別計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為(-)；陽(yáng)性細(xì)胞<30%為(+)；30%～50%為()；>50%為()。以(～)為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。免疫組化結(jié)果采用χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法進(jìn)行分析，利用GraphPad Prims軟件繪制Kaplan-Meier生存曲線及Log-rank檢驗(yàn)分析患者HAb18G、MMP-9和MMP-2表達(dá)水平與生存期的關(guān)系，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC中HAb18G、MMP-9和MMP-2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系HAb18G(圖1、2)、MMP-9(圖3、4)和MMP-2(圖5、6)在NSCLC組織中的陽(yáng)性率分別為71.07%、41.32%和55.37%。HAb18G蛋白表達(dá)與患者性別、年齡和病理類(lèi)型無(wú)關(guān)(P>0.05)；在腫瘤直徑>3 cm組、低分化組、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達(dá)分別高于腫瘤直徑≤3 cm組、高+中分化組、TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.05)。MMP-9和MMP-2蛋白表達(dá)與患者性別、年齡和分化程度無(wú)關(guān)(P>0.05)；在腫瘤直徑>3 cm組、腺癌組、低分化組、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)分別高于腫瘤直徑≤3 cm組、鱗癌組、高+中分化組、TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.05，表1)。

①②③④⑤⑥

表1 NSCLC中HAb18G、MMP-9和MMP-2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.2 NSCLC組織中HAb18G與MMP-9和MMP-2表達(dá)的相關(guān)性將NSCLC組織中HAb18G蛋白表達(dá)和MMP-9蛋白表達(dá)進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果顯示：HAb18G蛋白表達(dá)和MMP-9蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.313，P<0.001)；將NSCLC組織中HAb18G蛋白表達(dá)和MMP-2蛋白表達(dá)進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果顯示：HAb18G蛋白表達(dá)和MMP-2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.268，P<0.05)。

2.3 NSCLC中HAb18G、MMP-9和MMP-2的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示：高表達(dá)HAb18G患者術(shù)后5年生存率(12.79%)顯著低于低表達(dá)者(42.86%)(P<0.01)；高表達(dá)MMP-9患者術(shù)后5年生存率(14.00%)顯著低于低表達(dá)者(23.94%)(P<0.01)；高表達(dá)

圖7 NSCLC中HAb18G、MMP-9和MMP-2的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

表2 NSCLC中HAb18G、MMP-9和MMP-2的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

3 討論

肺癌作為全球高發(fā)惡性腫瘤，相關(guān)調(diào)查研究結(jié)果顯示其生存率不足20%[3]，因此對(duì)其侵襲及轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究成為當(dāng)今熱點(diǎn)之一。腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)機(jī)制是由多因素、多步驟、多基因共同參與的復(fù)雜過(guò)程。

基質(zhì)金屬蛋白酶是一組與鋅結(jié)合的內(nèi)肽酶，能降解大部分細(xì)胞外基質(zhì)成分，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞突破正常組織學(xué)屏障，侵襲鄰近組織和發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。其中，MMP-2和MMP-9與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系最為密切。MMP-2(又稱(chēng)Ⅳ型膠原酶)與MMP-9均由腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞以酶原形式分泌，共同參與降解Ⅳ型膠原及纖維黏連蛋白等基膜和細(xì)胞外基質(zhì)成分，其中MMP-9對(duì)腫瘤細(xì)胞的黏附能力也具有一定的作用[4]。兩者在多種腫瘤中均有表達(dá)。Liu等[5]研究表明，抑制MMP-2的通路與前列腺癌患者病情進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)。Ciuc?等[6]的研究結(jié)果表明，在54例舌鱗癌組織中，MMP-9和MMP-2在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中強(qiáng)表達(dá)，提示它們?cè)诰植拷?rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中有著重要意義。Jeleniewicz等[7]發(fā)現(xiàn)對(duì)MMP-9和MMP-2 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)可對(duì)卵巢癌患者的化療效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。本組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MMP-9和MMP-2在腫瘤直徑>3 cm組、腺癌組、低分化組、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)分別高于腫瘤直徑≤3 cm組、鱗癌組、高+中分化組、TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.05)。這與Zhang等[8]的研究結(jié)果一致。Ni等[9-10]的研究結(jié)果均證實(shí)高水平的MMP促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移，并與患者的生存期密切相關(guān)。

HAb18G是肝癌單克隆抗體HAb18的相應(yīng)膜抗原(是一種高度糖基化、相對(duì)分子質(zhì)量為5.8×104的跨膜蛋白)，作為新型腫瘤抗原之一，屬于免疫球蛋白家族成員，在人體中分布廣泛，參與胚胎發(fā)育、器官形成及炎癥反應(yīng)，并在多種上皮組織起源的腫瘤中表達(dá)，進(jìn)而參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等病理過(guò)程。其作用機(jī)制為誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)成纖維細(xì)胞產(chǎn)生多種基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-11等)使細(xì)胞外基質(zhì)降解，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)顯示，HAb18G在腫瘤直徑>3 cm組、低分化組、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)分別高于腫瘤直徑≤3 cm組、高+中分化組、TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.05)，且低表達(dá)患者生存率明顯高于高表達(dá)組(P<0.05)。崔麗萍等[11]的研究結(jié)果亦顯示，HAb18G的表達(dá)與腫瘤直徑、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)，證實(shí)NSCLC中HAb18G表達(dá)與其病理特征、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有一定的關(guān)系，可作為疾病發(fā)生、發(fā)展的重要參考指標(biāo)。因此，可將HAb18G作為判斷NSCLC的預(yù)后情況指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)合HAb18G、MMP-9和MMP-2三種檢測(cè)指標(biāo)，彌補(bǔ)單一指標(biāo)易出現(xiàn)偏差性的缺點(diǎn)，且經(jīng)過(guò)相關(guān)性分析，驗(yàn)證HAb18G與MMP-9和MMP-2表達(dá)呈正相關(guān)，綜合分析三者的表達(dá)水平與NSCLC的各項(xiàng)臨床病理特征及與預(yù)后的關(guān)系，為臨床提供了有價(jià)值的早期診斷與預(yù)后分析的參考指標(biāo)，其相關(guān)分子通路問(wèn)題有待于進(jìn)一步分析。