楊苗苗，王岳君，王 源，王娜娜，章俊生，黃偉超，陳國(guó)棟，孟 剛,4

胃癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤,發(fā)病率和病死率均位居惡性腫瘤的前列,據(jù)國(guó)家癌癥登記中心(NationalCentralCancerRegistry,NCCR)的調(diào)查結(jié)果顯示,我國(guó)每年新發(fā)病例數(shù)約41萬(wàn),死亡病例數(shù)約29萬(wàn)[1]?目前針對(duì)胃癌的分子靶向治療研究多集中在抗HER2單抗[2]和抗VEGF單抗,但由于胃癌相關(guān)蛋白表達(dá)強(qiáng)度及表達(dá)細(xì)胞存在高度異質(zhì)性導(dǎo)致單分子靶向藥物的治療存在局限性[3],因此,尋找能夠抑制胃癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的新分子靶點(diǎn)有望促進(jìn)腫瘤治療新策略的制定?維甲酸誘導(dǎo)蛋白14(retin-oic acid induced protein 14, RAI14)是一種首先于人視網(wǎng)膜色素上皮中被發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)編碼基因，在人的胎盤和睪丸組織中亦存在高表達(dá)，與細(xì)胞骨架相關(guān)，在卵巢癌[4]、胃癌[5]及肺腺癌[6]中的研究表明其與腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲密切相關(guān)。本文采用免疫組化法檢測(cè)胃腺癌組織中RAI14的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系，并與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)樣本分析結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，以期進(jìn)一步探討RAI14與胃癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2017～2019年安徽醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院行胃癌根治術(shù)切除的有完整資料的58例胃浸潤(rùn)性腺癌標(biāo)本，其中男性45例，女性13例，患者年齡26～84歲，平均66歲。所有病例均經(jīng)本院兩位高年資病理醫(yī)師復(fù)核確診并排除原位癌病例。

1.2 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)樣本分析UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)是一個(gè)有效的癌癥數(shù)據(jù)在線分析和挖掘的網(wǎng)站，主要是基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)癌癥數(shù)據(jù)，對(duì)基因進(jìn)行biomarker鑒定、表達(dá)譜分析，生存分析等。

1.3 方法標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋切片。免疫組化染色采用EliVision兩步法，兔抗人RAI14單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司，工作濃度1 ∶100，EliVision檢測(cè)試劑盒購(gòu)自羅氏公司。具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。胎盤組織中RAI14的染色作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作為空白對(duì)照，DAB顯色，蘇木精襯染。

1.4 結(jié)果判斷免疫組化結(jié)果判定由兩位高年資病理醫(yī)師通過(guò)雙盲法獨(dú)立閱片。RAI14陽(yáng)性為胞質(zhì)和(或)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒，參考文獻(xiàn)[7-8]中的判讀標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)細(xì)胞著色強(qiáng)度計(jì)分：不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行計(jì)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<1%為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分；將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：≤4分為低表達(dá)組，>4分為高表達(dá)組。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，RAI14的表達(dá)在胃腺癌組織和癌旁正常胃黏膜組織中的差異及與各臨床病理特征的關(guān)系均采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中胃腺癌中RAI14的表達(dá)差異及生存分析對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中415例胃腺癌及34例正常胃黏膜樣本進(jìn)行分析，結(jié)果顯示胃腺癌組與正常胃黏膜組織相比，RAI14呈高表達(dá)；進(jìn)一步的生存分析結(jié)果顯示，RAI14高表達(dá)的胃腺癌患者生存期較短(圖1)，提示RAI14可能是胃腺癌診斷及預(yù)后的潛在標(biāo)志物。

2.2 胃腺癌和癌旁正常胃黏膜組織中RAI14的表達(dá)58例胃腺癌組織中有34例(58.6%)高表達(dá)RAI14，癌旁正常胃黏膜組織中僅13例(22.4%)高表達(dá)RAI14，兩組陽(yáng)性率差異有顯著性(P<0.001，表1，圖2)。

表1 胃腺癌和癌旁正常胃黏膜組織中RAI14的表達(dá)[n(%)]

2.3 胃腺癌中RAI14表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系胃腺癌中RAI14的表達(dá)與腫瘤大小、分化程度、脈管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腫瘤分期存在相關(guān)性(P<0.05)，在Lauren分型中腸型腺癌與彌漫型及混合型腺癌中的表達(dá)差異有顯著性，結(jié)果顯示腸型腺癌表達(dá)率低(圖3)，而彌漫型及混合型腺癌表達(dá)率較高(圖4)，同時(shí)對(duì)于有脈管侵犯(圖5)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期較晚者表達(dá)率高。與患者年齡、性別無(wú)相關(guān)性，而且在神經(jīng)侵犯的癌組織中，RAI14高表達(dá)者占68.7%，提示可能具有臨床意義，但與無(wú)神經(jīng)侵犯者相比，兩者RAI14的陽(yáng)性率差異無(wú)顯著性(表2)。

圖1 A.TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中胃腺癌和正常胃黏膜組織中RAI14的表達(dá)差異；B.TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中胃腺癌患者基于RAI14表達(dá)高低的生存分析

3 討論

RAI14是新發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)編碼基因，又稱NORPEG，2001年發(fā)現(xiàn)于全反式維甲酸誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中[9]。隨后的研究[10-11]表明RAI14是肝臟中的一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，同時(shí)在人類睪丸中被發(fā)現(xiàn)，并在人類精子中高度表達(dá)。在人類中，RAI14存在三種選擇性剪接亞型，并與細(xì)胞骨架、F肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維和細(xì)胞黏附位點(diǎn)等相關(guān)。

2013年，Qian等[12]發(fā)現(xiàn)在大鼠睪丸的支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞中存在RAI14的高表達(dá)，是構(gòu)成細(xì)胞質(zhì)特化的重要組成成分，參與血睪屏障形成。敲除RAI14相關(guān)基因能破壞肌動(dòng)蛋白并擾亂細(xì)胞間的緊密連接；同時(shí)在精子形成過(guò)程中RAI14能調(diào)節(jié)精子細(xì)胞極性和精子細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。

②③④⑤

Hsu等[13]通過(guò)全基因組分析，發(fā)現(xiàn)RAI14是與癌細(xì)胞侵襲能力與抗藥能力相關(guān)的8個(gè)基因(EGFR、ITGA3、MYLK、RAI14、AHNAK、GLS、IL32和NNMT)中的1個(gè)，與紫杉醇、多西紫杉醇、厄洛替尼的藥物敏感存在相關(guān)性；在Chen等[5]的研究中發(fā)現(xiàn)RAI14基因敲除能抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。Yuan等[6]研究發(fā)現(xiàn)，RAI14的高表達(dá)能抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖。上述研究結(jié)果顯示，RAI14可能是癌癥治療的新靶點(diǎn)。

本組實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察RAI14在胃腺癌組織及癌旁正常胃黏膜中的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)有58.6%的胃腺癌組織高表達(dá)RAI14，癌旁正常胃黏膜組織中的高表達(dá)率僅有22.4%，兩者差異有顯著性，這與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)論一致，提示RAI14可能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有一定的促進(jìn)作用。目前關(guān)于RAI14的表達(dá)與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系研究較少，國(guó)內(nèi)He等[14]研究68例胃癌組織中RAI14的表達(dá)，認(rèn)為胃癌組織中RAI14的高表達(dá)與不良預(yù)后有關(guān)。本組數(shù)據(jù)顯示，RAI14表達(dá)與患者年齡、性別無(wú)相關(guān)性，RAI14在腫瘤直徑>5 cm、分化程度較低、有脈管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及進(jìn)展期胃腺癌中的陽(yáng)性率較高且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)發(fā)現(xiàn)按照Lauren分型顯示，腸型腺癌與彌漫型及混合型腺癌中RAI14的表達(dá)也具有相關(guān)性，提示RAI14可能與癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移密切相關(guān)，參與胃癌的進(jìn)一步惡化，這與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)生存分析顯示RAI14高表達(dá)患者生存期較短一致。本組隨訪顯示，8例死亡，其中4例為RAI14高表達(dá)患者，因隨訪時(shí)間較短，仍需長(zhǎng)期隨訪對(duì)其生存期進(jìn)行分析。本組數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，具有神經(jīng)侵犯的腺癌患者雖然有68.7%的高表達(dá)率，但與缺乏神經(jīng)侵犯病例的RAI14表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有待增加樣本量進(jìn)行深入探討。

表2 胃腺癌中RAI14的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

總之，本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RAI14基因在胃腺癌中高表達(dá)，主要表達(dá)于腫瘤直徑較大、分化較差的彌漫型和混合型腺癌以及具有脈管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期較晚的胃癌組織中，說(shuō)明RAI14的高表達(dá)提示腫瘤有較強(qiáng)的侵襲性，并伴有較短的生存期。RAI14可能是胃癌未來(lái)潛在的新治療靶點(diǎn)。