李 瑩，刁為英，王彩霞，曲燦華，孫玉鴻，李 升，徐 輝

甲狀腺癌是臨床內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外甲狀腺癌的發(fā)病率不斷攀升，成為專業(yè)領(lǐng)域的關(guān)注焦點(diǎn)[1]。超過(guò)90%的甲狀腺癌為分化型甲狀腺癌(differentiated thyroid cancer, DTC)，即甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)和甲狀腺濾泡癌(follicular thyroid carcinoma, FTC)。其中PTC最常見(jiàn)，占甲狀腺癌的60%～70%，F(xiàn)TC占甲狀腺癌的20%～25%，但其惡性度較PTC高，尤其血行轉(zhuǎn)移率較高。對(duì)于FTC的診斷，臨床病理醫(yī)師主要通過(guò)術(shù)中、術(shù)后組織病理切片顯示包膜及血管侵犯程度進(jìn)行判斷[2]。但在診斷工作中因?yàn)榍忻婕叭〔年P(guān)系，經(jīng)常不能完整顯示腫瘤的包膜及血管侵犯程度，這使FTC的確診一直成為臨床病理工作者關(guān)注的焦點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)FTC、PTC及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫伴腺瘤組織中miRNA-133的表達(dá)，分析miRNA-133的表達(dá)差異為FTC的診斷提供客觀的依據(jù)，并進(jìn)一步探討miRNA-133作為腫瘤標(biāo)志物的可行性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2016年11月～2017年12月佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院診治的甲狀腺癌患者60例，臨床病理資料見(jiàn)表1。FTC患者30例，其中男性4例，女性26例，年齡11～80歲，平均(45±6.8)歲；PTC患者30例，其中男性10例，女性20例，年齡18～65歲，平均(40.83±3.5)歲。結(jié)節(jié)性甲狀腺腫伴腺瘤患者30例，其中男性11例，女性19例，年齡15～76歲，平均(44.72±13.03)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)納入患者經(jīng)兩名副主任及以上病理醫(yī)師明確診斷；(2)甲狀腺癌患者未患有其它惡性腫瘤疾病，結(jié)節(jié)性甲狀腺腫伴腺瘤患者未患有惡性腫瘤疾?。?3)患者均未接受放、化療；(4)患者基本臨床資料均完整。

1.2 標(biāo)本與試劑標(biāo)本取自新鮮的石蠟標(biāo)本，8 μm厚切片，用1.5 mL無(wú)RNA酶EP管收集至-20 ℃冰箱保存。石蠟包埋組織miRNA提取試劑盒、miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRNA熒光定量試劑盒、has-miR-133a-3p檢測(cè)引物均購(gòu)自天根生物公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1總RNA的提取 將裝有組織切片的EP管加入1 mL二甲苯，離心2 min；吸取上清后加入1 mL無(wú)水乙醇于沉淀中，離心2 min；吸取上清，打開(kāi)管蓋，室溫放置直至乙醇揮發(fā)完全；加入150 μL裂解液，振蕩器振蕩混勻，55 ℃、80 ℃各孵育15 min；冰上放置3 min，離心15 min，轉(zhuǎn)移上清至新的離心管中，加入16 μL RDDbuffer，顛倒混勻，室溫放置15 min，離心后加入320 μL緩沖液RB；混勻后加入1 120 μL無(wú)水乙醇，混勻，轉(zhuǎn)移至吸附柱，離心，棄掉廢液，重復(fù)上一步驟；加入漂洗液，室溫放置2 min，離心后棄廢液，吸附柱轉(zhuǎn)入新的離心管中，置于室溫晾干后滴加去離子水100 μL，離心2 min。

1.3.2cDNA合成 參照miRNAcDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將反應(yīng)體系試劑組分加至總體積20 μL，移液器混勻，設(shè)置反應(yīng)程序，上機(jī)。合成的cDNA反應(yīng)液放置于-20 ℃保存。

1.3.3qRT-PCR檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)操作條件要求在冰上進(jìn)行，將cDNA用蒸餾水稀釋10倍后，充分混勻，取稀釋后的cDNA 2 μL，再加入7.2 μL無(wú)酶水、10 μL Premix、0.4 μL Reverse Primer、2 μL Rox。每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)3次，引物序列miR-133a-3p：5′-UUUGG UCCCCUUCAACCAGCUG-3′，以U6作為內(nèi)參，各樣本得出的Ct值為達(dá)到熒光閾值的循環(huán)數(shù)，miR-133在甲狀腺癌和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫伴腺瘤組織中的相對(duì)表達(dá)量用△Ct=Ct實(shí)驗(yàn)-CtU6計(jì)算，最終結(jié)果用2-△△Ct表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，非正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)及其四分位間距[M(Q1,Q3)]表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用ROC曲線分析miR-133檢測(cè)的特異度與靈敏度，并判斷miR-133對(duì)于FTC的臨床診斷效能。

1.5 結(jié)果判斷ROC曲線下面積(area under curve, AUC)越接近1.0，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)診斷價(jià)值越大，AUC>0.9以上，提示該實(shí)驗(yàn)有較高的診斷價(jià)值；0.7≤AUC≤0.9，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)有一定的診斷價(jià)值；0.5

2 結(jié)果

2.1 不同甲狀腺組織中miR-133的表達(dá)本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-133在FTC與PTC及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫伴腺瘤中的表達(dá)差異有顯著性(Z=9.917，P=0.007，表2)；miR-133在FTC組中的表達(dá)低于PTC組(Z=-2.706，P=0.007)；miR-133在FTC組中的表達(dá)低于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫伴腺瘤組(Z=-2.737，P=0.006)；miR-133在PTC組中表達(dá)與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫伴腺瘤組中的表達(dá)差異無(wú)顯著性(Z=-0.31，P=0.757)。miR-133可以用來(lái)鑒別FTC與PTC及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫伴腺瘤病變。

2.2 FTC組織中miR-133相對(duì)表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，miR-133的表達(dá)與FTC腫瘤分期密切相關(guān)，分期越高，miR-133表達(dá)量越低(Z=-2.954，P=0.003)；與患者性別、發(fā)病年齡、腫瘤大小、甲狀腺外浸潤(rùn)、多灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)相關(guān)性(P>0.05，表3)。

2.3 miR-133對(duì)FTC的診斷價(jià)值FTC與PTC組中以miR-133相對(duì)表達(dá)量0.593為臨界值時(shí)，AUC為0.719(95%CI：0.591～0.846)，其診斷靈敏度為63.3%，特異度為81.2%，約登指數(shù)為0.446，見(jiàn)圖1。FTC與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫伴腺瘤組中以miR-133相對(duì)表達(dá)量0.725為臨界值時(shí)，AUC為0.723(95%CI：0.595～0.852)，其診斷靈敏度為63.3%，特異度為80.0%，約登指數(shù)為0.433，見(jiàn)圖2。提示miR-133對(duì)FTC、PTC及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫伴腺瘤的鑒別均有一定的診斷效能。

表1 甲狀腺癌患者的臨床病理資料

表2 FTC、PTC、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫伴腺瘤組織中miRNA-133的表達(dá)

表3 FTC組織中miR-133相對(duì)表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

圖1 FTC與PTC組中miR-133的ROC曲線

圖2 FTC與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫伴腺瘤組中miR-133的ROC曲線

3 討論

細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)活檢(fine needle aspiration, FNA)是術(shù)前診斷甲狀腺腫瘤的金標(biāo)準(zhǔn)，術(shù)中快速冷凍病理切片是術(shù)中病理的主要診斷方法，F(xiàn)TC是具有濾泡細(xì)胞分化的惡性腫瘤。FNA因其觀察不到血管及包膜，術(shù)中快速冷凍病理切片因制片關(guān)系不易明確包膜及血管狀態(tài)，兩種檢查均無(wú)法給出FTC的直接診斷，且分化性甲狀腺腫瘤(FTC和濾泡性腺瘤)病理學(xué)形態(tài)十分相近，對(duì)于FTC和濾泡性腺瘤的鑒別，在日常病理醫(yī)師的診斷中就更加困難[3]。因此，開(kāi)展一種用于診斷FTC腫瘤標(biāo)志物的研究具有重要的臨床意義。

小RNA(microRNA, miRNA)是一類長(zhǎng)度19～25個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA[4]。在哺乳動(dòng)物中，miRNA中的第2～8核苷酸序列與mRNA靶基因的5′末端和3′UTR互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后階段調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)。近年越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤中失調(diào)的miRNA與其發(fā)病機(jī)制和病理學(xué)密切相關(guān)，miRNA主要參與調(diào)控個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞增殖和分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控等生命活動(dòng)，miRNA的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且可反映腫瘤存在及生長(zhǎng)，是潛在的腫瘤標(biāo)志物(tumor marker, TM)[4]。在甲狀腺癌的研究中，miRNA的表達(dá)紊亂亦可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡及自噬，增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移等方面促進(jìn)甲狀腺癌的發(fā)生及發(fā)展[5]。Chen等[6]最早發(fā)現(xiàn)miR-133可通過(guò)抑制血清反應(yīng)因子(serum response factor, SRF)增強(qiáng)骨骼肌成肌細(xì)胞增殖及分化，其存在于果蠅到人類等多個(gè)動(dòng)物物種體內(nèi)，提示miR-133具有進(jìn)化的保守性且可能參與機(jī)體復(fù)雜的分子調(diào)節(jié)。研究表明miR-133在乳腺癌[7]、非小細(xì)胞肺癌[8]、前列腺癌[9]、膀胱癌[10]、結(jié)腸癌[11]、胃癌[12]、肝癌[13]等多種腫瘤中均表達(dá)失調(diào)，且參與癌細(xì)胞的增殖、侵襲。Zhou等[10,14]研究發(fā)現(xiàn)miR-133a可通過(guò)靶向與肺癌及膀胱癌細(xì)胞中的表皮生長(zhǎng)因子受體(epithelial growth factor receptor, EGFR)結(jié)合抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。Weber等[15]于2006年首次提出miRNAs在FTC中表達(dá)異常，miR-197和miR-346的高表達(dá)可促進(jìn)FTC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，為FTC的診斷和治療提供可能新的標(biāo)志物和治療方向。miR-133在FTC中表達(dá)情況尚未見(jiàn)報(bào)道。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-133在FTC細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，且與FTC的高分期具有相關(guān)性，提示miR-133在FTC的發(fā)生、發(fā)展中可能起重要作用，但其作用機(jī)制尚不清楚。

本組ROC曲線結(jié)果顯示，F(xiàn)TC與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫伴腺瘤組中以miR-133的截?cái)嘀禐?.725，AUC為0.723，其診斷靈敏度為63.3%，特異度為80.0%；FTC與PTC組中miR-133的截?cái)嘀禐?.593，AUC為0.719，其診斷靈敏度為63.3%，特異度為81.2%。ROC曲線均顯示miR-133作為一種潛在分子標(biāo)志物對(duì)FTC有一定診斷效能，但靈敏度偏低，且本組納入病例數(shù)量較少，未來(lái)如進(jìn)一步行大樣本及FNA標(biāo)本實(shí)驗(yàn)，并聯(lián)合更多特異的miRNA進(jìn)行檢測(cè)，才有望達(dá)到臨床應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)。

甲狀腺濾泡性腫瘤的診斷目前還是臨床病理診斷的難點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-133在FTC組織中表達(dá)下調(diào)，且與腫瘤的病理分期具有相關(guān)性；ROC曲線進(jìn)一步表明，miR-133用于鑒別FTC與PTC、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫伴腺瘤具有一定的診斷價(jià)值。限于本組病例數(shù)偏少，仍需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入探究。