范盈盈，向旭輝，雷 婷，周燕燕，步 宏,，鄭眾喜

乳腺癌是常見的惡性腫瘤之一，人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor 2, HER-2)基因擴增可見于15%～20%的乳腺癌，HER-2陽性與乳腺癌患者不良預后相關[1]。目前最常用的HER-2檢測方法為免疫組化，但是該方法受病理醫(yī)師的經(jīng)驗及主觀差異的影響，不同實驗室間HER-2判讀的一致性及可重復性差異顯著[2]。計算機在圖像處理方面具有優(yōu)越性，因此被用于提高HER-2免疫組化判讀的準確性及可重復性。傳統(tǒng)機器算法的性能較大程度上依賴于特征提取選擇，而特征提取選擇存在差異，并且傳統(tǒng)的機器算法不能支持大量數(shù)據(jù)的研究[3]，而深度學習在病理圖像上表現(xiàn)出較高的準確性及實用性，因此目前逐漸取代傳統(tǒng)的計算機算法應用于病理圖像處理中[4-5]。

回顧相關文獻，大部分已發(fā)表的研究僅對感興趣區(qū)域進行分析，導致最終準確性變化大[6-7]。因此在本實驗中使用深度學習算法建立準確性高、基于全片腫瘤區(qū)域的HER-2免疫組化的自動判讀模型，并且對該模型性能及其臨床應用的可行性進行分析。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2018年1月～2019年8月四川大學華西醫(yī)院存檔的浸潤性導管癌手術切除標本215例?；颊吲R床病理資料均直接取自本院的臨床病歷資料或者病理資料，包括患者年齡、性別、腫瘤直徑、病理學分級等。

1.2 方法標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)行脫水及石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，行HE和免疫組化染色。免疫組化染色使用羅氏Ventana全自動免疫組化染色儀，以DAB顯色、蘇木精對比染色。使用羅氏公司克隆號為4B5的兔抗人HER-2單克隆抗體為一抗，操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

1.3 判讀標準HER-2免疫組化判讀以《乳腺癌HER-2檢測指南(2019)》[8]為標準，即：無著色或≤10%的浸潤癌細胞呈不完整的、微弱的細胞膜染色為(0)；>10%的浸潤癌細胞呈不完整、微弱的細胞膜染色為(1+)；>10%浸潤癌細胞呈弱～中等強度的完整細胞膜染色或者≤10%的浸潤癌細胞呈完整、強且均勻的細胞膜染色為HER-2(2+)；>10%的浸潤癌細胞呈完整、強且均勻的細胞膜染色為HER-2(3+)。HER-2(0～1+)為陰性，HER-2(2+)為不確定，HER-2(3+)為陽性。

1.4 HER-2自動評分模型HER-2免疫組化切片使用優(yōu)納公司數(shù)字病理切片掃描儀進行全片掃描，形成全載玻片成像(whole slide imaging, WSI)。選取15例WSI作為訓練數(shù)據(jù)，200例WSI作為測試數(shù)據(jù)。15張WSI中的感興趣區(qū)域(即浸潤性導管癌)在物鏡10×下進行不重疊地分割，分割為32×32像素大小，由病理醫(yī)師對每張分割圖片進行分類。每張分割圖片分為0及1+、2+、3+、其它四類。其中其它分類用以區(qū)分腫瘤組織與非腫瘤組織，包括：背景(沒有確切的細胞核)、壞死區(qū)域、正常乳腺組織、間質(zhì)及異常著色區(qū)域。訓練數(shù)據(jù)中用于圖片特征學習的訓練集分割圖片合計12 550張：0及1+為2 226張，2+為2 074張，3+為2 124張，其它為6 126張。訓練數(shù)據(jù)中用于模型選取的驗證集包含2 013張圖片：0及1+為428張，2+為298張，3+為449張，其它為838張。

基于Inception V3和Resnet網(wǎng)絡建立深度學習網(wǎng)絡。深度學習模型實現(xiàn)HER-2免疫組化的自動評分主要由兩部分構成，即分割圖片分類及HER-2評分(圖1)。分割圖片分類步驟中將WSI分割為32×32像素大小的圖片。將分割圖片輸入到深度學習模型中，模型對每張分割圖片進行分類判讀。HER-2評分步驟中將分割圖片的判讀結(jié)果進行信息整合，最后計算判讀為0及1+、2+及3+分類的分割圖片百分比，對全片HER-2免疫組化圖像進行判讀。200例測試集數(shù)據(jù)均由3名經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師進行獨立判讀，共同的判讀結(jié)果作為標準判讀。第4名病理醫(yī)師獨立于3名病理醫(yī)師進行判讀。

1.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料采用Pearson χ2檢驗，評估兩種檢測方法之間的一致性采用Kappa值。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特點患者平均年齡為52.9歲，腫塊平均直徑為2.5 cm，病理組織學分級：WHO Ⅰ級2例，WHO Ⅱ級95例，WHO Ⅲ級118例，患者均為女性，均為手術切除標本。

2.2 HER-2免疫組化染色結(jié)果判讀實驗納入陰性病例HER-2(0及1+)130例(60.5%)，不確定病例HER-2(2+)42例(19.5%)，陽性病例HER-2(3+)43例(20%)。WSI中深度學習模型判讀為0及1+、2+、3+、其它四類的分割圖片如圖2所示。200例測試集中深度學習模型及病理醫(yī)師判讀結(jié)果中陰性病例分別為101例(50.5%)及92例(46%)，不確定病例為56例(28%)及68例(34%)，陽性病例為43例(21.5%)及40例(20%)。深度學習模型判讀結(jié)果見表1。深度學習模型判讀的準確率為87.5%(75/200)，病理醫(yī)師判讀的準確率為81.5%(163/200)，深度學習模型判讀的準確率高于病理醫(yī)師的判讀準確率(P<0.05)。深度學習模型判讀結(jié)果與標準判讀之間的Kappa值為0.79(P<0.05)，病理醫(yī)師判讀結(jié)果與標準判讀之間Kappa值為0.71(P<0.05)，深度學習模型判讀結(jié)果與病理醫(yī)師判讀結(jié)果之間的Kappa值為0.70(P<0.05)，深度學習模型判讀結(jié)果與標準判讀及病理醫(yī)師判讀結(jié)果之間的一致性較高。深度學習模型與病理醫(yī)師在不確定病例中判讀的準確率分別為60.7%(34/56)及50%(34/68)，兩者差異無統(tǒng)計學意義(P=0.23)。與病理醫(yī)師判讀相比，深度學習模型減少17.6%(12/68)的不確定病例。

圖1 HER-2免疫組化自動判讀模型判讀流程

圖2 感興趣區(qū)域進行分割后的圖片：A.0；B.1+；C.2+；D.3+；E.其它，異常著色區(qū)域；F.其它，背景沒有確切的細胞核

表1 深度學習模型判讀結(jié)果

2.3 評判不一致病例深度學習模型判讀與標準判讀間有25例判讀不一致病例，深度學習模型將22例陰性病例判讀為不確定，3例不確定病例判讀為陽性，假陽性率為1.5%(3/200)。病理醫(yī)師判讀的假陽性率及假陰性率分別為0.5%(1/200)及1%(2/200)。25例判讀不一致的病例中，病理醫(yī)師判讀與標準判讀的一致性僅為52%；而在判讀一致的175例中，病理醫(yī)師判讀與標準判讀之間的一致性為85.7%，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。深度學習模型判讀與標準判讀之間判讀不一致的病例中13例為HER-2異質(zhì)性表達，2例為組織重疊，1例在腫瘤周圍及腫瘤組織中存在術中定位墨汁。

3 討論

本實驗提出的HER-2免疫組化自動判讀模型，是在分割圖片分類的基礎上進行全片腫瘤細胞HER-2免疫組化判讀。目前發(fā)表的相關研究中，大部分研究是基于感興趣區(qū)域進行HER-2免疫組化判讀，該方法通常受感興趣區(qū)域數(shù)量、非腫瘤區(qū)域的面積以及選擇者之間主觀差異的影響，最終的HER-2免疫組化判讀的準確性變化大，準確性為78%～98.33%[6-7,9]。與這些研究相比本組實驗提出的方法實現(xiàn)了HER-2免疫組化全片腫瘤區(qū)域的判讀，避免了由感興趣區(qū)域以及選擇者間主觀差異對HER-2免疫組化判讀的影響，與病理醫(yī)師實際工作中基于全片的HER-2免疫組化判讀方法一致。

Khameneh等[10]為了實現(xiàn)全片腫瘤區(qū)域腫瘤細胞的細胞核、膜的分割識別，采用包括支持向量機(support vector machine, SVM)、局部二值模式(local binary patterns， LBP)及顏色直方圖等算法提取圖像特征，區(qū)分上皮及非上皮成分。本實驗中將間質(zhì)成分、正常的乳腺組織及異常著色等非腫瘤區(qū)域的分割圖片歸到一個類別中，標記工作簡單，避免由傳統(tǒng)算法中手動提取特征過程中導致的圖像數(shù)據(jù)的流失及選擇偏移。值得一提的是Vandenberghe等[11]對全片中免疫細胞、基質(zhì)細胞、人工假象及不同分級的腫瘤細胞進行探測分類，這種方法在標注過程中易受標注者間的主觀差異影響，這可能是導致其結(jié)果準確性不高的原因。

本實驗的準確性為87.5%，低于部分目前已經(jīng)發(fā)表的研究(表2)。除了與WSI全片判讀的方法相關外，可能與計算方法相關。依據(jù)已發(fā)表文獻準確率的計算方法，去除本實驗中1.5%的假陽性率，98.5%的準確率高于目前已發(fā)表的相關研究。本實驗中提出的HER-2免疫組化自動評分模型的準確率高，能準確識別出陰性病例，無假陰性病例，在臨床病理診斷工作中能在一定程度上減輕病理醫(yī)師的工作負荷。

本實驗中HER-2免疫組化自動判讀模型與標準判讀一致的病例中與病理醫(yī)師的判讀一致性明顯高于與評讀不一致的病例，提示深度學習模型能識別部分易于誤判的病例，可以幫助病理醫(yī)師識別高風險病例提高判讀的準確性，與Vandenberghe等[11]的結(jié)論相似。

HER-2 (2+)病例及HER-2表達異質(zhì)性病例是日常病理診斷工作的難點[12-13]。本實驗的深度學習模型能在保持與病理醫(yī)師判讀相同準確性的同時，能減少17.6%判讀為HER-2 (2+)的病例。深度學習模型判讀不一致的病例中超過50%的病例具有HER-2表達異質(zhì)性，是影響深度學習模型準確性的主要因素，因此這部分病例的判讀結(jié)果需要病理醫(yī)師進行復核判讀。

表2 已發(fā)表的使用深度學習HER-2免疫組化評估研究

總之，本實驗提出的深度學習模型是在進行簡單標記的測試集數(shù)據(jù)上進行模型的建立，在此基礎上建立了準確性高的HER-2免疫組化全片自動判讀模型。該模型能識別明確的陰性病例，幫助病理醫(yī)師識別高風險病例，減少判讀為HER-2 (2+)病例的數(shù)量，提高病理醫(yī)師判讀的準確性及一致性。深度學習模型在一定程度上能減少病理醫(yī)師的工作負荷，為乳腺癌患者臨床治療方案的決策及預后提供更準確的信息。