王 磊,王 靜,2,張愛(ài)君,張 輝,張永春,2,*

1 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部江蘇耕地保育科學(xué)觀測(cè)站, 南京 210014 2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué),南京 210095 3 江蘇省徐淮地區(qū)徐州農(nóng)科所,徐州 221131

氮是植物必需的大量元素,也是獲得農(nóng)業(yè)高產(chǎn)最主要的限制因子之一。固氮微生物是生物圈中固定大氣氮的重要微生物[1],氮固定能力廣泛分布于原核分類群中,包括非常不同的,遠(yuǎn)緣相關(guān)的細(xì)菌和古細(xì)菌[2-3]。生物固氮是陸地氮循環(huán)的重要組成部分,每年為生物圈貢獻(xiàn)90—130 Tg N[4],且主要由細(xì)菌與豆科植物共同完成。然而,近年來(lái)土壤自生固氮微生物由于其對(duì)氮素的重要作用而受到越來(lái)越多的關(guān)注[5]。在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中,管理經(jīng)驗(yàn)對(duì)固氮微生物的結(jié)構(gòu)和固氮能力均具有重要的影響[6-7]。施肥管理經(jīng)驗(yàn)通過(guò)改變土壤特性直接影響土壤微生物群落和豐度或影響植物的反饋間接對(duì)土壤微生物群落和豐度產(chǎn)生影響[8-9]。近年來(lái),化肥特別是氮肥的過(guò)量施用導(dǎo)致一系列的生態(tài)和環(huán)境問(wèn)題,例如土壤酸化,氮淋失和潛在的大氣污染等[10-11]。施用有機(jī)肥料可以增加土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分含量,并改善土壤pH和土壤養(yǎng)分[12-14]。研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期的施肥模式通過(guò)改變土壤pH、養(yǎng)分有效性和碳含量,對(duì)土壤微生物種群產(chǎn)生積極或消極的影響[8, 15-16]。有研究發(fā)現(xiàn)固氮微生物群落中的一些類群對(duì)外界的擾動(dòng)也異常敏感[17]。因此,探究固氮微生物群落對(duì)無(wú)機(jī)或有機(jī)施肥的響應(yīng),對(duì)于了解土壤氮素的供應(yīng)過(guò)程和選擇有效的施肥策略至關(guān)重要。

許多研究表明土壤中充足的氮通常會(huì)抑制微生物的生物固氮,從而對(duì)固氮微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生重要影響[18-19]。當(dāng)向土壤中施用氮肥后,充足的可利用氮(如銨態(tài)氮和硝態(tài)氮)能夠充分滿足固氮微生物對(duì)氮素的需求,從而影響固氮微生物的活性并抑制其基因的表達(dá)[20-21]。例如,有研究發(fā)現(xiàn)氮肥的施用降低了菊芋根際土壤中固氮菌的數(shù)量,改變了固氮微生物的群落結(jié)構(gòu)[22]。Wang等[23]研究表明長(zhǎng)期施用化肥能改變固氮菌群落結(jié)構(gòu)及降低其群落多樣性。然而,M?rtensson等[24]研究發(fā)現(xiàn)施用氮磷鉀肥對(duì)稻田固氮微生物的影響較小。Piceno和Lovell[25]研究也發(fā)現(xiàn)在短期的施肥試驗(yàn)中氮肥施用與固氮菌的群落結(jié)構(gòu)之間沒(méi)有明顯的相關(guān)性。出乎意料的是Juraeva等[26]研究發(fā)現(xiàn)黃瓜根中固氮酶基因的豐度與氮肥供應(yīng)呈正相關(guān)關(guān)系。此外,在有機(jī)肥處理的土壤中高水平的碳和其它養(yǎng)分可能為固氮微生物提供更理想的條件。有研究表明單獨(dú)施用有機(jī)肥或與化肥配合施用都能明顯恢復(fù)固氮菌群落的多樣性[27]。另一方面,施用有機(jī)肥也會(huì)增加土壤有效氮的含量,這可能也會(huì)抑制固氮微生物的群落多樣性和豐度。有研究發(fā)現(xiàn)在酸性和中性土壤中長(zhǎng)期施用有機(jī)肥能顯著抑制固氮微生物的群落多樣性[28-29]。然而,在堿性土壤中研究施用有機(jī)肥對(duì)固氮菌群落影響的報(bào)道還相對(duì)較少。因此,研究堿性土壤中增施有機(jī)肥對(duì)固氮菌群落結(jié)構(gòu)、組成和多樣性的影響顯得尤為重要。

中國(guó)是世界上最大的甘薯生產(chǎn)國(guó),其種植面積和總產(chǎn)量均居世界第一[30],甘薯-小麥輪作是其主要輪作模式,其廣泛分布在長(zhǎng)江中下游地區(qū)和北方薯區(qū)[31]。甘薯-小麥輪作與其它輪作方式存在顯著不同,在甘薯生產(chǎn)中,適當(dāng)?shù)牡释度胧歉适碓霎a(chǎn)的有力措施之一[32],過(guò)高的氮肥施用量使甘薯藤蔓生長(zhǎng)過(guò)旺,降低光合同化產(chǎn)物向薯塊的運(yùn)輸,進(jìn)而降低甘薯的收獲指數(shù)[33-34]。此外,考慮到礦質(zhì)氮肥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的過(guò)量施用已經(jīng)引起嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題[35-37]。通過(guò)合適的措施增強(qiáng)自生固氮菌的生物固氮是在低氮肥投入條件下滿足植物營(yíng)養(yǎng)需求的另一種方法[5]。因此,研究小麥-甘薯輪作體系中不同施肥方式尤其是增施有機(jī)肥對(duì)土壤固氮菌群落的影響及其環(huán)境驅(qū)動(dòng)因子尤為重要。本文以種植小麥-甘薯長(zhǎng)期定位試驗(yàn)中不同施肥處理的甘薯季堿性土壤樣本為研究對(duì)象,采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù),探討其輪作模式下不同施肥處理對(duì)土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響及其環(huán)境驅(qū)動(dòng)因子,結(jié)果對(duì)于我們更加充分認(rèn)識(shí)長(zhǎng)期施肥尤其是增施有機(jī)肥條件下固氮菌的群落及合理施用有機(jī)肥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 長(zhǎng)期試驗(yàn)點(diǎn)概況及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究所選取的長(zhǎng)期施肥定位試驗(yàn)點(diǎn)位于徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所內(nèi)(117°09′ E, 34°17′ N),海拔42 m,屬溫帶季風(fēng)氣候,年均氣溫14 ℃,年降雨量800—930 mm,無(wú)霜期約210 d,年日照時(shí)數(shù)2284—2495 h,日照率52%—57%。氣候特點(diǎn)是：四季分明,光照充足,雨量適中,雨熱同期。土壤類型為黃潮土,質(zhì)地沙壤。試驗(yàn)從1980年開(kāi)始,試驗(yàn)前耕層(0—20 cm)土壤有機(jī)質(zhì)含量10.8 g/kg,全氮0.66 g/kg,速效磷12.0 mg/kg,pH 8.01。1981—2002年為“小麥-玉米輪作”,2002年后改為“小麥-甘薯輪作”。試驗(yàn)設(shè)9個(gè)處理：(1)不施肥對(duì)照(CK)；(2)氮肥(N)；(3)施氮磷肥(NP)；(4)施氮鉀肥(NK)；(5)單施化肥(NPK)；(6)單施有機(jī)肥(M)；(7)氮肥+有機(jī)肥(NM)；(8)氮磷肥+有機(jī)肥(NPM)；(9)化肥+有機(jī)肥(NPKM)。本研究選取其中3個(gè)施肥處理：CK：不施肥對(duì)照；NPK：?jiǎn)问┗剩籒PKM：化肥+有機(jī)肥。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),4次重復(fù),小區(qū)面積33.6 m2(7 m×4.8 m),選取其中的3個(gè)重復(fù)用于本次研究。氮磷鉀肥每年施用量為純N 300 kg/hm2,P2O5150 kg/hm2,K2O 225 kg/hm2。有機(jī)肥為堆積制腐的廄肥。1981—1985年每年施用量(鮮基)為75000 kg/hm2,1985年后為37500 kg/hm2,有機(jī)肥平均含N 6.3 g/kg、P2O55.14 g/kg、K2O 7.93 g/kg,C:N為20.3。小麥、玉米季氮肥的基、追肥比例為各50%,甘薯季氮、磷、鉀及有機(jī)肥在翻地前均作基肥一次施用。

1.2 土壤樣品采集

土壤樣品于2018年10月(甘薯收獲后)采集。其中每個(gè)小區(qū)間隔為40 cm,每個(gè)區(qū)組間隔為70 cm,將每個(gè)小區(qū)中距水泥埂1 m左右的區(qū)域定為采樣區(qū)域,避免邊緣效應(yīng)。去除表面土壤后,各小區(qū)按“S”形采樣路線隨機(jī)選取5個(gè)取樣點(diǎn),用采樣器(直徑為2.5 cm)采集0—20 cm的耕作層土壤。各小區(qū)采集的5個(gè)土芯經(jīng)初步破碎混勻后,所有樣品采用冰袋保鮮運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。土壤樣品在去除植物根系和大的石塊后過(guò)2 mm篩混勻。所有樣品分為兩部分,一部分室溫下風(fēng)干后用于土壤理化性質(zhì)測(cè)定,另一部分置于-80 ℃用于土壤DNA提取。

1.3 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

1.4 土壤DNA提取及固氮菌nifH基因高通量測(cè)序

稱取0.50 g新鮮的土壤樣品,用強(qiáng)力土壤DNA提取試劑盒(QIAGEN laboratories, Carlsbad, CA, Germany)參照其操作說(shuō)明提取土壤樣品中的總DNA,提取獲得的DNA于超低溫(-80 ℃)冰箱中保存。固氮菌nifH基因的高通量測(cè)序采用引物PolF(5′-TGCGAYCCSAARGCBGACTC-3′)和PolR (5′-ATSGCCATCATYTCRCCGGA-3′)[28]。每個(gè)樣品前段引物均含有不同的8 bp Barcode用于區(qū)分不同樣品。PCR的擴(kuò)增條件為95 ℃ 2 min,95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,25個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸5 min。PCR反應(yīng)體系為20 μL,其中包括4 μL(5×FastPfu)緩沖液,2 μL (2.5 mM)dNTP,0.8 μL正反引物,0.4 μL(5×FastPfu)DNA聚合酶,1 μL DNA模板,ddH2O補(bǔ)充到20 μL。擴(kuò)增后的產(chǎn)物利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, U.S.)進(jìn)行純化。將不同樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物等摩爾混合后,采用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)完成序列分析(委托南京集思慧遠(yuǎn)生物科技有限公司測(cè)定)。

1.5 高通量數(shù)據(jù)分析

利用QIIME軟件對(duì)下機(jī)后的原始序列根據(jù)相應(yīng)的barcode信息進(jìn)行各樣品序列分配并去除接頭和引物序列[39]。利用FLASH軟件拼接正反向序列,對(duì)拼接后的序列進(jìn)行質(zhì)控,去除低質(zhì)量序列。具體步驟如下：1)去除q值小于0.5或長(zhǎng)度不足250 bp的序列；2)去除單序列；3)序列97%相似度水平上生成一個(gè)OTU；4)去除嵌合體；5)挑選每個(gè)OTU代表序列；6)nifH序列與proGenomes數(shù)據(jù)庫(kù)(http://progenomes.embl.de/)比對(duì)進(jìn)行注釋。將生成的OTU表格轉(zhuǎn)換成適合Mothur軟件分析用的文件,然后利用Mothur軟件進(jìn)行各處理Alpha多樣性分析[40]?；赨nweight_unifrac距離的主坐標(biāo)分析(PCoA)在QIIME軟件上進(jìn)行。用冗余分析(Redundancy analysis, RDA)探索固氮菌群落結(jié)構(gòu)、樣方和理化性質(zhì)之間的關(guān)系；Mantel test用于檢測(cè)微生物群落組成與土壤理化之間的相關(guān)性；相似性分析(ANOSIM,Analysis of Similarities)用于檢驗(yàn)各處理群落的相似性。前向選擇(forward selection)用于選取最優(yōu)解釋變量。RDA、Mantel test、ANOSIM和前向選擇均在R 3.3.1統(tǒng)計(jì)軟件的Vegan[41]包里進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,單因素方差分析(One-way ANOVA)配合Tukey′s-b檢驗(yàn)多處理間均值的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

長(zhǎng)期不同施肥處理對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響如表1所示。與CK處理相比,NPK和NPKM處理顯著降低土壤pH(P<0.05),顯著增加土壤有機(jī)碳和全氮含量(P<0.05),其中pH分別降低0.30和0.54個(gè)單位,有機(jī)碳分別增加33.24%和104.26%,全氮分別增加61.54%和105.13%。銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量在3個(gè)處理中差異顯著(P<0.05),其中銨態(tài)氮含量在3個(gè)處理的高低順序?yàn)镹PKM > CK > NPK,硝態(tài)氮按照NPKM > NPK > CK的順序排列。土壤有效磷和速效鉀在3個(gè)處理中差異顯著(P<0.05),其含量在3個(gè)處理中的高低順序?yàn)镹PKM > NPK > CK。以上結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),在堿性土壤上增施有機(jī)肥通過(guò)降低土壤pH有效改善土壤酸堿度,通過(guò)增加土壤有機(jī)碳、全氮和速效養(yǎng)分的含量顯著改善土壤肥力水平。

表1 長(zhǎng)期不同施肥處理的土壤理化性質(zhì)

2.2 固氮菌群落Alpha多樣性

如表2所示,不同施肥處理間土壤固氮菌群落Alpha多樣性存在不同程度的差異。與CK處理相比,NPK和NPKM處理降低土壤固氮菌群落Chao1豐富度指數(shù)、觀測(cè)的物種數(shù)和Shannon多樣性指數(shù),其中NPKM處理的Chao1豐富度指數(shù)、觀測(cè)的物種數(shù)顯著低于CK和NPK處理(P<0.05),Shannon多樣性指數(shù)在NPKM處理中最低,但差異不顯著(P> 0.05)。因此,長(zhǎng)期施肥降低土壤固氮菌群落多樣性和豐富度,增施有機(jī)肥降低的程度更大。

表2 長(zhǎng)期不同施肥處理的土壤固氮菌群落Alpha多樣性

2.3 固氮菌群落Beta多樣性

如圖1所示,不同施肥處理間土壤固氮菌群落Beta多樣性差異顯著。在OTU水平上,基于Unweight_unifrac距離進(jìn)行主坐標(biāo)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)主坐標(biāo)的前兩軸共解釋群落變異的58.60%,第一軸和第二軸分別解釋群落變異的43.88%和14.72%。CK、NPK和NPKM處理的群落組成沿著第一軸依次分開(kāi),相似性分析(ANOSIM)也表明CK、NPK和NPKM處理的群落組成差異顯著(R= 0.4825,P= 0.005)。冗余分析主要是分析土壤理化、群落組成與樣方之間的關(guān)系,結(jié)果表明土壤理化因子顯著影響固氮菌群落的組成(Mantel test,R= 0.4825,P= 0.01)。通過(guò)解釋變量的前向選擇(forward selection)發(fā)現(xiàn)土壤速效鉀和有機(jī)碳分別能解釋群落變異的75.01%和24.99%。因此,長(zhǎng)期增施有機(jī)肥顯著增加土壤速效鉀和有機(jī)碳,這種變化驅(qū)動(dòng)著土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變。

圖1 長(zhǎng)期不同施肥處理中土壤固氮菌群落組成及其與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系Fig.1 Soil diazotrophic community composition and its relationship with soil physicochemical properties in long-term different fertilization treatmentANOSIM：相似性分析；Mantel test：檢驗(yàn)群落組成與理化因子的相關(guān)性；CK：不施肥對(duì)照；NPK：?jiǎn)问┗?；NPKM：化肥+有機(jī)肥RDA: 冗余分析; SOC: 有機(jī)碳Soil organic carbon; AK:速效鉀Available potassium

2.4 固氮菌群落類群分析

固氮菌測(cè)序得到的原始序列經(jīng)過(guò)質(zhì)控獲得1104419條高質(zhì)量的序列,每個(gè)樣品的序列從112486到131951條不等,平均每個(gè)樣品有122713條序列,99%的序列被劃分為細(xì)菌界,共獲得1337個(gè)OTU,歸屬為9個(gè)門,12個(gè)綱,27個(gè)目,32個(gè)科,36個(gè)屬,61個(gè)種。固氮菌門水平相對(duì)豐度如圖2所示,具體9個(gè)主要門：變形菌門(47.66%—90.61%),硝化螺旋菌門(2.65%—49.52%),藍(lán)藻菌門(0.18%—7.60%),放線菌門(0.27%—2.24%),浮霉菌門(0—1.68%),酸桿菌門(0.04%—0.80%),厚壁菌門(0.04%—0.64%),芽單胞菌門(0—0.56%),擬桿菌門(0—0.38%)。在門水平上,長(zhǎng)期不同施肥處理對(duì)其相對(duì)豐度產(chǎn)生顯著影響。與CK和NPK處理相比,NPKM處理顯著增加酸桿菌門和硝化螺旋菌門的相對(duì)豐度(P<0.05),但也顯著降低了變形菌門的相對(duì)豐度(P<0.05)。與CK處理比較,兩個(gè)肥料處理NPK和NPKM處理均顯著降低藍(lán)藻菌門的相對(duì)豐度(P<0.05),其中在NPKM處理中其相對(duì)豐度最低。

圖2 長(zhǎng)期不同施肥處理中土壤固氮菌群落門水平的相對(duì)豐度Fig.2 Relative abundance of soil diazotrophic phyla level within long-term different fertilization treatment不同的字母表示在P<0.05(Tukey′s-b test)水平上差異顯著；CK：不施肥對(duì)照；NPK：?jiǎn)问┗?；NPKM：化肥+有機(jī)肥

如圖3所示,在固氮菌綱水平上,Beta-變形菌和Gamma-變形菌是最豐富的類群。在不同施肥處理中綱水平上的相對(duì)豐度差異明顯。Alpha-變形菌、Beta-變形菌和Delta-變形菌在NPKM處理的土壤中其相對(duì)豐度最低,其中Beta-變形菌的相對(duì)豐度顯著低于CK和NPK處理(P<0.05)。Gamma-變形菌在3個(gè)處理中差異不顯著,其相對(duì)豐度的高低順序?yàn)镃K > NPKM > NPK。

圖3 長(zhǎng)期不同施肥處理中土壤固氮菌群落綱水平的相對(duì)豐度Fig.3 Relative abundance of soil diazotrophic class level within long-term different fertilization treatment不同的字母表示在P<0.05(Tukey′s-b test)水平上差異顯著；CK：不施肥對(duì)照；NPK：?jiǎn)问┗?；NPKM：化肥+有機(jī)肥

如圖4所示,對(duì)固氮菌群落屬水平上進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CK處理的土壤中擬色球藍(lán)細(xì)菌屬相對(duì)豐度高于NPK和NPKM處理,但差異不顯著(P> 0.05)。與CK和NPK處理相比,NPKM處理顯著增加硝化螺菌屬的相對(duì)豐度(P<0.05),但顯著降低固氮弧菌屬的相對(duì)豐度(P<0.05)。

圖4 長(zhǎng)期不同施肥處理中土壤固氮菌群落屬水平的相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of soil diazotrophic genus level within long-term different fertilization treatment不同的字母表示在P<0.05(Tukey′s-b test)水平上差異顯著；CK：不施肥對(duì)照；NPK：?jiǎn)问┗?；NPKM：化肥+有機(jī)肥

2.5 固氮菌群落多樣性及類群與土壤環(huán)境因子的關(guān)系

土壤理化因子與固氮菌群落多樣的相關(guān)分析如表3所示。土壤硝態(tài)氮與Shannon多樣性指數(shù)顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；豐富度指數(shù)Chao1和觀測(cè)到的物種數(shù)與土壤pH達(dá)到極顯著的正相關(guān)(P<0.01),而與土壤有機(jī)碳、全氮、硝態(tài)氮、有效磷和速效鉀之間均達(dá)到極顯著的負(fù)相關(guān)(P<0.01)。以上結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)期施肥尤其是增施有機(jī)肥能顯著提升土壤肥力水平,這從某種程度上降低了固氮菌的群落多樣性。

表3 被選擇的土壤理化性質(zhì)與固氮菌群落多樣性的相關(guān)分析

如表4所示,相關(guān)分析表明土壤pH、有機(jī)碳、全氮、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、有效磷和速效鉀與放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、芽單胞菌門、浮霉菌門和Gamma-變形菌間均無(wú)顯著相關(guān)性(P> 0.05)；土壤pH與酸桿菌門、硝化螺旋菌門和硝化螺菌屬顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),與藍(lán)藻菌門、變形菌門、Beta-變形菌、擬色球藍(lán)細(xì)菌屬和固氮弧菌屬間均呈顯著(P<0.05)正相關(guān)；而土壤有機(jī)碳和全氮與酸桿菌門、硝化螺旋菌門和硝化螺菌屬間顯著正相關(guān)(P<0.05),與藍(lán)藻菌門、變形菌門、Beta-變形菌、擬色球藍(lán)細(xì)菌屬和固氮弧菌屬顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；銨態(tài)氮與酸桿菌門顯著正相關(guān)(P<0.05),與Alpha-變形菌顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；硝態(tài)氮與酸桿菌門、硝化螺旋菌門和硝化螺菌屬顯著正相關(guān)(P<0.05),與藍(lán)藻菌門、變形菌門、Beat-變形菌、擬色球藍(lán)細(xì)菌屬和固氮弧菌屬顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；有效磷和速效鉀均與酸桿菌門、硝化螺旋菌門和硝化螺菌屬顯著正相關(guān)(P<0.05),均與變形菌門、Beta-變形菌和固氮弧菌屬顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),其中有效磷與Delta-變形菌顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),速效鉀與藍(lán)藻菌門和擬色球藍(lán)細(xì)菌屬顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。綜上,施肥導(dǎo)致土壤pH的變化對(duì)固氮菌群落類群產(chǎn)生潛在積極的影響,而土壤有機(jī)碳及有效養(yǎng)分改變對(duì)其產(chǎn)生潛在消極的影響。

表4 被選擇的土壤理化性質(zhì)與固氮菌類群間的相關(guān)分析

3 討論

3.1 長(zhǎng)期不同施肥對(duì)固氮菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響

土壤固氮微生物群落多樣性對(duì)不同土壤施肥方式異常敏感。本研究中,長(zhǎng)期增施有機(jī)肥顯著降低土壤固氮菌群落多樣性、改變固氮菌群落結(jié)構(gòu)。有研究發(fā)現(xiàn)在中性黑土上,長(zhǎng)期施用化肥或有機(jī)肥均降低土壤固氮菌群落的多樣性[42],在氮素缺乏的土壤中固氮微生物更具競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì),土壤氮素含量的變化會(huì)影響固氮微生物與其它土壤微生物的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,從而影響固氮微生物的群落組成[43]。本文中我們發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期增施有機(jī)肥顯著改變土壤pH、有機(jī)碳、全氮及有效養(yǎng)分的含量,這些土壤特性是驅(qū)動(dòng)固氮菌群落豐富度變化的主要因子[44-45],這可能解釋了在增施有機(jī)肥處理的土壤中固氮菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)與對(duì)照和單施化肥處理相比差異更大。此外與對(duì)照和單施化肥處理相比,增施有機(jī)肥顯著降低土壤pH、增加土壤有機(jī)碳、全氮、硝態(tài)氮、有效磷和速效鉀(表1),這些改變分別對(duì)土壤固氮菌群落多樣性產(chǎn)生潛在積極和消極的影響(表3)。土壤養(yǎng)分含量的增加導(dǎo)致固氮菌群落多樣性降低,可能是養(yǎng)分含量上升增加了固氮微生物與其它土壤微生物的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,從而影響固氮微生物的群落豐富度和多樣性。然而在有些研究中報(bào)到了不同的結(jié)果,如wang等[45]研究指出有機(jī)管理的水稻田中固氮細(xì)菌多樣性相對(duì)較高。Feng等[46]研究發(fā)現(xiàn)單施化肥顯著降低土壤固氮菌多樣性,而添加畜禽糞便能保持其多樣性。Lin等[28]研究表明長(zhǎng)期施肥顯著降低土壤固氮菌豐度和群落多樣性,而添加豬糞增加了其抑制作用。在Orr等[47]對(duì)傳統(tǒng)和有機(jī)管理的農(nóng)業(yè)土壤進(jìn)行比較時(shí),發(fā)現(xiàn)土壤肥力管理對(duì)固氮菌群落和多樣性影響不大。產(chǎn)生以上不同的結(jié)果可能是施肥改變了其它的土壤特性,例如土壤pH[48, 23]和有機(jī)質(zhì)含量[49],這些變化可能對(duì)固氮微生物產(chǎn)生二次的影響。

由于土壤類型和土壤利用方式的差異,土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)受到不同環(huán)境因子的調(diào)控。有學(xué)者指出在土壤pH<5時(shí),土壤pH對(duì)固氮菌群落有著重要的影響[50]。Lin等[28]研究也發(fā)現(xiàn)土壤pH是驅(qū)動(dòng)固氮菌群落變化的關(guān)鍵因子。Hu等[29]結(jié)果表明土壤有效磷是影響固氮菌群落改變最重要的因子。在Yang等[42]研究中發(fā)現(xiàn)土壤硝態(tài)氮和有效磷驅(qū)動(dòng)固氮菌群落結(jié)構(gòu)的改變。冗余分析中解釋變量的前向選擇結(jié)果表明土壤有機(jī)碳和速效鉀的變化能最大程度上解釋土壤固氮菌群落的改變(圖1)。而本研究中不同施肥處理間土壤pH值均大于8,且pH值變化范圍較小(8.16—8.70),因此pH的變化可能對(duì)固氮菌群落結(jié)構(gòu)的影響沒(méi)有有機(jī)碳和速效鉀強(qiáng)烈。此外隨著長(zhǎng)期化肥或有機(jī)肥的添加,土壤有機(jī)碳、全氮及速效養(yǎng)分改變較大(表1),可能這些土壤特性的變化驅(qū)動(dòng)著固氮菌群落結(jié)構(gòu)的變化。綜上所述,在小麥-甘薯輪作中土壤有機(jī)碳和速效鉀與固氮菌群落的變化密切相關(guān)。

3.2 長(zhǎng)期不同施肥對(duì)固氮菌群落類群的影響

本研究發(fā)現(xiàn)變形菌門和硝化螺旋菌門為優(yōu)勢(shì)的自生固氮菌群(圖2)。在變形菌門內(nèi),Beta-變形菌和Gamma-變形菌為優(yōu)勢(shì)的菌群(圖3),這和賈雨雷等[51]研究結(jié)果一致。更為重要的是長(zhǎng)期不同施肥對(duì)固氮菌群落類群在土壤中的分布產(chǎn)生顯著的影響。如長(zhǎng)期增施有機(jī)肥顯著降低變形菌門、藍(lán)藻菌門、Beta-變形菌和固氮弧菌屬的相對(duì)豐度,增加硝化螺旋菌門、酸桿菌門和固氮弧菌屬的相對(duì)豐度(圖4)。已有研究發(fā)現(xiàn)變形菌門屬于革蘭氏陰性菌,是一類生長(zhǎng)在富營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中的類群,其相對(duì)豐度與養(yǎng)分含量呈正相關(guān)性[52-53]。藍(lán)藻細(xì)菌由于其固氮能力,在維持水稻土肥力水平起著至關(guān)重要的作用[54-55]。然而,在本文中我們發(fā)現(xiàn)變形菌門、藍(lán)藻菌門、Alpha-變形菌、Beta-變形菌、Delta-變形菌、Gamma-變形菌和固氮弧菌屬均與土壤有機(jī)碳和有效養(yǎng)分顯著負(fù)相關(guān),結(jié)果的不同可能是因?yàn)殚L(zhǎng)期施肥導(dǎo)致土壤養(yǎng)分顯著提高,土壤養(yǎng)分的提升為其它土壤微生物提供充足的養(yǎng)分供應(yīng),加速了與固氮微生物間的競(jìng)爭(zhēng)。此外,長(zhǎng)期施用化肥或有機(jī)肥也顯著提高土壤可利用氮的水平,而高氮含量的土壤中并不適合自生固氮菌的生長(zhǎng)和繁殖[47,57],這可能也是固氮微生物群落某些類群受到一定抑制的原因。在本研究中土壤pH雖然變化很小,對(duì)土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)的影響較小,但也可能對(duì)某些固氮微生物類群在土壤中的分布產(chǎn)生重要的影響。酸桿菌門是土壤中新發(fā)現(xiàn)的一類嗜酸菌,有研究發(fā)現(xiàn)土壤酸桿菌門與pH呈負(fù)相關(guān)性[57]。本研究也發(fā)現(xiàn)增施有機(jī)肥顯著降低土壤pH,而酸桿菌門在增施有機(jī)肥的處理中最高,相關(guān)分析也表明酸桿菌門與土壤pH顯著負(fù)相關(guān)。因此,在增施有機(jī)肥的土壤中pH顯著降低,同時(shí)顯著富集了固氮菌酸桿菌門。在屬水平上,在高養(yǎng)分含量的土壤中,硝化螺旋菌屬相對(duì)豐度較高,固氮弧菌屬相對(duì)豐度受到明顯的抑制。有研究表明,硝化螺菌屬中的微生物可以獨(dú)立完成氨氧化成硝酸鹽的氮代謝過(guò)程,并將這類微生物定義為全程氨氧化微生物[58-59]。因此,在我們研究中長(zhǎng)期增施有機(jī)肥可能顯著影響全程氨氧化微生物的群落,從而使硝化螺旋菌屬的相對(duì)豐度顯著提高。固氮弧菌屬是一類革蘭氏陰性細(xì)菌,隸屬于Beta-變形菌綱、紅環(huán)菌目的紅環(huán)菌科,目前發(fā)現(xiàn)的有7個(gè)代表種,具有生物固氮的功能,一般情況下每消耗1 g碳水化合物,至少10 g大氣氮被非共生固定。固氮弧菌屬?gòu)V泛存在于自然界,是一類兼性厭氧菌[60],在生物固氮過(guò)程中有著重要作用的微生物[61]。從生態(tài)的角度出發(fā),固氮弧菌屬可分為土壤固有的細(xì)菌和植物根系的內(nèi)生菌[63]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期增施有機(jī)肥顯著降低固氮弧菌屬的相對(duì)豐度(圖4),相關(guān)分析也表明固氮弧菌屬的相對(duì)豐度與有機(jī)碳、全氮、硝態(tài)氮、有效磷和速效鉀的含量顯著負(fù)相關(guān)(表4)。因此,長(zhǎng)期施用有機(jī)肥增加了土壤有機(jī)碳、全氮和有效養(yǎng)分進(jìn)而對(duì)固氮弧菌屬產(chǎn)生潛在消極的影響。綜上所述,長(zhǎng)期增施有機(jī)肥顯著改變土壤pH、有機(jī)碳和土壤有效養(yǎng)分的含量,這些土壤性質(zhì)的變化顯著影響土壤固氮微生物的群落結(jié)構(gòu),在某種程度上對(duì)固氮微生物群落多樣性和一些類群產(chǎn)生一定的抑制作用。

4 結(jié)論

本研究揭示了在堿性土壤上,與不施肥比較長(zhǎng)期增施有機(jī)肥對(duì)固氮菌群落結(jié)構(gòu)的影響強(qiáng)于單施化肥,對(duì)固氮菌群落多樣性的抑制作用更大。長(zhǎng)期增施有機(jī)肥增加了土壤有機(jī)質(zhì)、豐富了土壤養(yǎng)分,這些改變?cè)黾恿怂釛U菌門、硝化螺旋菌門和硝化螺旋菌屬的相對(duì)豐度,但也降低了變形菌門、藍(lán)藻菌門、Beta-變形菌和固氮弧菌屬的相對(duì)豐度。長(zhǎng)期增施有機(jī)肥顯著改變土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性,這與土壤有機(jī)碳和速效鉀的變化密切相關(guān)。因此,長(zhǎng)期增施有機(jī)肥對(duì)土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)的影響更大,且不利于其群落多樣性的維持。