甘小娜，彭 博，李廷釗，李 波,

（1.安利（中國(guó)）研發(fā)中心，上海 201203；2.安利（中國(guó)）植物研發(fā)中心，江蘇 無(wú)錫 214145）

藤茶，亦稱銀茶、霉茶，是葡萄科蛇葡萄屬植物顯齒蛇葡萄的干燥莖葉，為多年生藤本植物，主要分布于長(zhǎng)江流域，如湖北恩施、湖南張家界和衡陽(yáng)、貴州梵凈山、福建武夷山等地[1]。藤茶在我國(guó)民間（尤其是少數(shù)民族地區(qū)）應(yīng)用歷史悠久，是土家族藥用珍品，也是客家的民俗茶飲，還是瑤族的傳統(tǒng)浴波植物之一，在拉祜族、侗族、基諾族等少數(shù)民族中均有廣泛應(yīng)用，用以治療口腔潰瘍、咽炎，以及胃腸不適癥等[2]。藤茶中富含黃酮類化合物，占干制樣品的40%[3]，其中又以二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）含量最為突出[4]。現(xiàn)代藥理研究藤茶具多種功效，如抗氧化[5-6]、抗菌抗炎[7]、降血脂[8]、護(hù)肝解酒[9]、保護(hù)心臟[10]、抗腫瘤[11]等。2013年12月24日，國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委批準(zhǔn)顯齒蛇葡萄葉為新資源食品；作為茶藥兩用植物資源，藤茶開(kāi)發(fā)潛力巨大。

常規(guī)活性成分的篩選是將原植物進(jìn)行提取、分離并鑒定后，再針對(duì)單體化合物進(jìn)行活性測(cè)定，該方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且原藥材用量較大；近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外有不少學(xué)者對(duì)該方法進(jìn)行改進(jìn)，將活性分析（如抗氧化劑[12-15]、乙酰膽堿酯酶抑制劑[16]、α-葡萄糖苷酶抑制劑[17]、肝細(xì)胞色素P450配體[18]、磷酸二酯酶抑制劑[19]、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑[20]等）和現(xiàn)代分析儀器設(shè)備結(jié)合起來(lái)，在進(jìn)行化學(xué)成分分析的同時(shí)完成化合物活性篩選和鑒定，大大提高了天然植物活性化合物篩選和鑒定的效率。但目前發(fā)表的抗氧化活性篩選相關(guān)文獻(xiàn)基本都是將活性分析與普通高效液相色譜儀結(jié)合，鮮見(jiàn)有超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）[21]在線抗氧化方法的運(yùn)用；UPLC分析速度快、分離度好，可在很大程度上縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間、提高實(shí)驗(yàn)效率，其在分析領(lǐng)域的應(yīng)用，尤其對(duì)不穩(wěn)定物質(zhì)的快速分析，有其不可替代的優(yōu)勢(shì)。

本實(shí)驗(yàn)旨在利用在線活性分析的方法，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的手段，獲得化合物的保留時(shí)間、紫外吸收?qǐng)D譜及相對(duì)分子質(zhì)量信息，對(duì)比文獻(xiàn)對(duì)化合物進(jìn)行初步推斷，并結(jié)合已有標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)推斷的結(jié)論進(jìn)一步驗(yàn)證，從而鑒定藤茶中主要的抗氧化成分；建立UPLC-二極管陣列檢測(cè)器-質(zhì)譜-2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（UPLC-photo-diode array-mass spectrometry-2,2’-amino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)ammonium salt，UPLC-PDA-MS-ABTS）陽(yáng)離子自由基藤茶抗氧化活性的定量方法，并分析比較不同產(chǎn)地藤茶抗氧化活性的高低，以期為后續(xù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)也為UPLC串聯(lián)在線抗氧化活性測(cè)定提供參考方法和實(shí)驗(yàn)條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國(guó)Merck公司；乙醇（分析純） 中國(guó)General-Reagent公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；甲酸（色譜純） 美國(guó)Honeywell公司；ABTS、過(guò)硫酸鉀（K2(SO4)2）、Trolox中國(guó)Adamas Reagent公司；超純水由美國(guó)Milli-Q超純水機(jī)制備；DMY、楊梅素-3-O-鼠李糖苷、楊梅素深圳振強(qiáng)生物技術(shù)有限公司；藤茶藥材由安利（中國(guó)）研發(fā)中心陳亮博士鑒定，并存樣于藥材庫(kù)，其產(chǎn)地及來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 藤茶產(chǎn)地及來(lái)源信息Table 1 Information about vine tea samples used in this study

1.2 儀器與設(shè)備

Milli-Q超純水系統(tǒng) 上海技舟化工科技有限公司；WF-600EHT型超聲波清洗機(jī) 寧波海曙五方超聲設(shè)備有限公司；TU-1900雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；XS2051/10萬(wàn)分之一電子天平、MS3002S型電子分析天平 梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司；UPLC儀（配PDA檢測(cè)器、串聯(lián)QDa質(zhì)譜儀） 美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 藤茶中化合物的鑒別與在線抗氧化活性篩選

1.3.1.1 供試品溶液的制備

取藤茶粉末約100 mg，精密稱質(zhì)量，置于50 mL容量瓶中，加60%乙醇溶液定容至刻度線，超聲提取30 min，以0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，待測(cè)。

1.3.1.2 ABTS溶液的制備[22]

精密稱取ABTS粉末約50 mg，加適量PBS溶解；精密稱取過(guò)硫酸鉀粉末約50 mg，加入10 mL PBS溶解；取適量過(guò)硫酸鉀溶液加入ABTS溶液中，混勻，使ABTS終濃度為3.6 nmol/L，過(guò)硫酸鉀終濃度為1.2 nmol/L；室溫避光反應(yīng)過(guò)夜（12～16 h），于4 ℃保存?zhèn)溆?，自由基溶液有效期? d，使用時(shí)用PBS調(diào)節(jié)至所需吸光度（729 nm波長(zhǎng)處吸光度為0.7±0.02）。

1.3.1.3 藤茶中化合物的鑒別與在線抗氧化活性篩選流程

UPLC-PDA-MS-ABTS陽(yáng)離子自由基在線鑒別藤茶中的抗氧化成分裝置流程見(jiàn)圖1。路徑A：供試品溶液經(jīng)色譜柱分離后，進(jìn)入柱后反應(yīng)模塊，與柱后反應(yīng)體系泵入的PBS混合后先后流經(jīng)PDA和質(zhì)譜，即可得到化合物在290 nm波長(zhǎng)處的正吸收峰圖及質(zhì)譜圖，根據(jù)質(zhì)譜得到的化合物分子質(zhì)量信息并結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，即可初步推斷供試品中化合物的結(jié)構(gòu)。路徑B：將柱后體系中的溶劑置換成ABTS溶液，并設(shè)置PDA檢測(cè)波長(zhǎng)為729 nm，以相同的條件進(jìn)樣，供試品溶液經(jīng)分離后與柱后反應(yīng)體系泵入的ABTS溶液混合并反應(yīng)后進(jìn)入PDA，即可得到由于自由基的清除作用而形成的負(fù)吸收峰。

圖1 在線檢測(cè)藤茶抗氧化成分示意圖Fig.1 Schematics of UPLC-PDA-MS (A) and UPLC-PDA-ABTS cation radical (B) for screening and identification of antioxidants in vine tea

1.3.1.4 藤茶中化合物的鑒別與在線抗氧化活性篩選條件

UPLC條件：色譜柱：ACQUITY UPLC?BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～2.5 min，90% A，10% B；1.5～6 min，90%～10%A，10%～90% B；6～8 min；10% A，90% B；8～10 min，10%～100% A，90%～0% B；流速：0.4 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：290 nm/729 nm（具體設(shè)置見(jiàn)1.3.1.3節(jié)）；進(jìn)樣量：1 μL。

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧離子源，負(fù)離子檢測(cè)模式；霧化氣：氮?dú)?；錐孔電壓：15 V；質(zhì)量掃描范圍：m/z100～800。

柱后反應(yīng)系統(tǒng)條件：反應(yīng)環(huán)體積：1 mL；流動(dòng)相：ABTS陽(yáng)離子自由基溶液（729 nm波長(zhǎng)處吸光度為0.7±0.02）；流速：0.4 mL/min，柱后反應(yīng)模塊溫度：37 ℃。

1.3.2 藤茶中DMY的含量測(cè)定

采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，以DMY為標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)其質(zhì)量濃度與峰面積之間的關(guān)系，對(duì)藤茶中DMY進(jìn)行定量分析。

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

取DMY標(biāo)準(zhǔn)品約5 mg，精密稱定，置于5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度線，充分搖勻，備用。

1.3.2.2 供試品溶液的制備

取藤茶粉末約80 mg，精密稱質(zhì)量，置于250 mL容量瓶中，加60%乙醇溶液200 mL，超聲提取30 min，再加60%乙醇溶液定容至刻度線，充分混勻，以0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，待測(cè)。

1.3.2.3 儀器工作條件

設(shè)備連接見(jiàn)1.3.1節(jié)，選用路徑A，斷開(kāi)質(zhì)譜連接；超高效液相系統(tǒng)及柱后反應(yīng)體系其他條件同1.3.1.4節(jié)，檢測(cè)波長(zhǎng)選用290 nm，柱后反應(yīng)系統(tǒng)的流動(dòng)相選用PBS。

1.3.3 藤茶的抗氧化活性定量分析

以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，對(duì)其中DMY的抗氧化活性進(jìn)行分析；其活性用Trolox當(dāng)量抗氧化能力（trolox-equivalent antioxidant capacity，TEAC）評(píng)價(jià)，按下式[23]進(jìn)行計(jì)算：

式中：Y=kX＋b為T(mén)rolox的濃度與倒峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線方程；A為供試品中DMY的倒峰面積；b為標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的截距；V為供試品的體積；k為標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的斜率；M為供試品的質(zhì)量。

1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

取Trolox標(biāo)準(zhǔn)品約5 mg，精密稱定，置于5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度線，充分搖勻，備用。

1.3.3.2 供試品溶液的制備

同1.3.2.2節(jié)。

1.3.3.3 儀器工作條件

設(shè)備連接見(jiàn)1.3.1節(jié)，選用路徑B；UPLC系統(tǒng)及柱后反應(yīng)體系其他條件同1.3.1.4節(jié)，檢測(cè)波長(zhǎng)選用729 nm，柱后反應(yīng)系統(tǒng)的流動(dòng)相選用ABTS溶液。

1.4 數(shù)據(jù)采集及分析

采用Empower 3FR3和Excel 2016軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)方法的優(yōu)化

2.1.1 ABTS陽(yáng)離子自由基最大波長(zhǎng)的選擇

ABTS陽(yáng)離子自由基波長(zhǎng)大概分布在410、645、730 nm三個(gè)波長(zhǎng)附近[24-28]，本實(shí)驗(yàn)對(duì)自由基的吸收光譜從300～800 nm掃描；取ABTS儲(chǔ)備液適量，加40 倍體積的PBS溶液，稀釋，搖勻，用紫外-可見(jiàn)分光光度儀進(jìn)行掃描，結(jié)果與文獻(xiàn)一致，ABTS陽(yáng)離子自由基在413、645、729 nm波長(zhǎng)處達(dá)到吸收峰值，為盡量減小干擾，本實(shí)驗(yàn)最終選擇729 nm作為ABTS陽(yáng)離子自由基的測(cè)定波長(zhǎng)。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇

本實(shí)驗(yàn)比較甲醇和乙腈兩種有機(jī)相對(duì)出峰的影響，結(jié)果表明，藤茶提取物在兩種有機(jī)相下均能獲得較好的峰形，但以甲醇為有機(jī)相時(shí)，Trolox出峰較晚且基線漂移較大，故本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈為實(shí)驗(yàn)的有機(jī)相；水相考察純水、0.1%甲酸、0.1%乙酸的影響，結(jié)果表明流動(dòng)相中添加少量甲酸和添加少量乙酸的效果相當(dāng)，相對(duì)于用純水作為流動(dòng)相，加入少量酸能獲得更好的峰形，并改善DMY與鄰峰之間的分離度，本實(shí)驗(yàn)最終選擇甲酸作為流動(dòng)相添加劑。

2.1.3 UPLC系統(tǒng)流速及柱后反應(yīng)系統(tǒng)流速的選擇

整個(gè)系統(tǒng)流速的選擇是影響實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵因素。在相同梯度條件下，UPLC系統(tǒng)流速過(guò)低會(huì)導(dǎo)致出峰延遲且影響分離度。柱后反應(yīng)系統(tǒng)流速過(guò)低時(shí)，圖譜噪音基線提高，且色譜峰展寬明顯；而當(dāng)柱后部分流速過(guò)大時(shí)，負(fù)吸收峰的面積逐漸減小，反應(yīng)程度呈下降的趨勢(shì)。因此，為兼顧化合物的分離度、峰形和實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)程度，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)設(shè)置不同的流速進(jìn)行比較，最終選擇液相系統(tǒng)流速和柱后反應(yīng)系統(tǒng)流速均為0.4 mL/min。

2.1.4 柱溫的選擇

實(shí)驗(yàn)比較柱溫在25、30、35、40 ℃出峰情況，結(jié)果表明，溫度越高，化合物出峰越早，分離度越差；在25 ℃，化合物的保留及分離度均能達(dá)到較好狀態(tài)。

2.2 抗氧化成分的鑒定

圖2 Trolox色譜圖（a）、藤茶樣本原色譜圖（b）、在線ABTS色譜圖（c）及負(fù)離子模式下提取離子流圖（d）Fig.2 Liquid chromatograms of Trolox (a) and vine tea (b), on-line ABTS assay chromatogram (c) and extracted ion chromatogram in negative ion mode (d)

取供試品溶液按優(yōu)化條件進(jìn)行分析，得到藤茶提取液原色譜圖、在線ABTS色譜圖及負(fù)離子模式下提取離子流圖（圖2）。分別對(duì)其中的質(zhì)譜峰進(jìn)行分析，得化合物1的分子離子峰[M－H]－的m/z為319.16，化合物2的分子離子峰[M―H]-的m/z為319.13，化合物3的分子離子峰[M―H]-的m/z為463.24，化合物4的分子離子峰[M-H]-的m/z為316.97。根據(jù)化合物的紫外吸收、保留時(shí)間及分子質(zhì)量信息，結(jié)合文獻(xiàn)[29-30]初步推斷化合物1為DMY，化合物2為異二氫楊梅素，化合物3為楊梅素-3-O-鼠李糖苷，化合物4為楊梅素；取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以相同色譜條件進(jìn)樣，標(biāo)準(zhǔn)品溶液與所推斷化合物在相同時(shí)間出峰，進(jìn)一步證明推斷正確。由圖2可知，以上4 個(gè)化合物均有不同程度的抗氧化活性，其中主要抗氧化成分為DMY。

2.3 DMY含量測(cè)定方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察

取DMY標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加甲醇配制成質(zhì)量濃度為0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，按1.3.1.4節(jié)方法進(jìn)行測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以DMY峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程為Y=6 675 318.17X-11 262.08，R2=1.000，表明DMY在0.01～0.5 mg/mL之間線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的對(duì)照品溶液1 μL，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄DMY的峰面積，其RSD為0.43%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一樣品6 份，按1.3.2.2節(jié)和1.3.2.3節(jié)處理并進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算其相對(duì)含量，結(jié)果平均值為40.8%，RSD為0.78%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，每次1 μL，結(jié)果表明DMY峰面積在24 h內(nèi)變化很小，RSD為1.59%，表明供試品在室溫（25 ℃）24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取藤茶粉末適量于250 mL容量瓶，加入標(biāo)準(zhǔn)品粉末，按1.3.2.2節(jié)方法制備藤茶樣本并進(jìn)樣，計(jì)算其回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 DMY在藤茶樣品中的加樣回收率Table 2 Recovery of DMY in spiked vine tea

2.4 活性定量方法學(xué)考察結(jié)果

2.4.1 線性關(guān)系考察結(jié)果

取Trolox標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加甲醇配制成質(zhì)量濃度為0.02、0.04、0.10、0.20、0.40 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，按1.3.1.4方法進(jìn)行測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以倒峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程為Y＝6 366 664.72X＋13 021.76，R2＝0.999，表明Trolox在0.02～0.4 mg/mL線性關(guān)系良好。

2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取Trolox和DMY標(biāo)準(zhǔn)品，配制成兩者均為0.1 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)樣。精密吸取同一對(duì)照品溶液1 μL，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定Trolox和DMY的峰面積，其RSD分別為0.39%和0.54%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一樣品6 份，按1.3.2.2節(jié)和1.3.2.3節(jié)處理并進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算TEAC值，結(jié)果平均值為0.41，RSD為0.19%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取供試品溶液，分別于0、0.5、1、2、5、10 h進(jìn)樣，每次1 μL，結(jié)果DMY倒峰峰面積在10 h內(nèi)變化很小，RSD為1.91%，表明供試品在室溫（25 ℃）10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，也說(shuō)明所配制的ABTS陽(yáng)離子自由基在10 h內(nèi)可對(duì)樣品進(jìn)行穩(wěn)定測(cè)定。

2.5 樣品測(cè)定結(jié)果

取藤茶藥材粉末80 mg，精密稱定，按1.3.2.2節(jié)方法制備，吸取供試品溶液1 μL，依法測(cè)定倒峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算TEAC值，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，不同產(chǎn)地來(lái)源的藤茶抗氧化能力差異較大，其中來(lái)源于湖北恩施鳳硒藤茶有限公司（S7）和福建武夷山（S4）的樣本抗氧化能力最強(qiáng)。

表3 不同來(lái)源藤茶樣本DMY含量及抗氧化活性測(cè)定結(jié)果Table 3 Antioxidative capacities of vine tea samples from different sources

3 結(jié) 論

本研究采用UPLC-PDA-MS-ABTS陽(yáng)離子自由基在線篩選藤茶中的抗氧化活性物質(zhì)，推斷出主要抗氧化活性物質(zhì)DMY，并以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，建立藤茶抗氧化活性分析的定量方法，對(duì)市場(chǎng)上來(lái)源不同的12 批藤茶樣本進(jìn)行分析，來(lái)源于湖北恩施和福建武夷山的藤茶抗氧化效果較為突出。DMY既是藤茶含量最高的化合物，也是其抗氧化活性最好的成分，可作為其質(zhì)量控制的指標(biāo)。

將抗氧化活性數(shù)據(jù)與藤茶中DMY的含量數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)其含量與活性之間呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系，也進(jìn)一步證明了該定量方法對(duì)藤茶中DMY活性評(píng)估的可靠性。

本方法將UPLC與柱后反應(yīng)系統(tǒng)相結(jié)合，利用UPLC分離效率高的優(yōu)勢(shì)，可有效縮短分析時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率；然而由于這兩套系統(tǒng)本身在管路設(shè)計(jì)上存在差異，對(duì)于成分復(fù)雜的提取物的活性定量具有較大的挑戰(zhàn)性，后期可嘗試對(duì)管路進(jìn)行優(yōu)化和改造，使該方法應(yīng)用于更多復(fù)雜體系的分析。